Молекулярные и клеточные механизмы адипогенеза

Введение

Проблема метаболического синдрома, характеризующегося развитием висцерального ожирения в сочетании с инсулинорезистентностью и артериальной гипертензией, является крайне актуальной в настоящее время. Особую роль в развитии метаболического синдрома играет жировая ткань. Она чувствительна к действию инсулина, и, в то же время, является одним из основных регуляторов метаболизма. Ее избыточное развитие, возникающее за счет гиперплазии и/или гипертрофии составляющих ее клеток, сначала приводит к развитию ожирения, а затем и инсулинорезистентности. Транскрипционный каскад, обуславливающий развитие клеток жировой ткани, относительно хорошо изучен, и известно множество факторов, регулирующих транскрипцию генов в адипоцитах. Однако для более полного понимания адипогенной дифференцировки необходим комплексный взгляд на процесс.

Функции жировой ткани

Возникновение жировой ткани в процессе эволюции связывают с тем, что по мере увеличения размеров многоклеточных организмов возрастал объем потребляемых ими питательных веществ, и появилась необходимость в органе-накопителе энергетически ценных молекул для обеспечения равномерности процесса потребления. Этим органом стала жировая ткань, клетки которой (адипоциты) способны запасать триглицериды. Триглицериды накапливаются в липидных каплях адипоцитов, а при необходимости (во время голодания, при активной физической работе) расщепляются до глицерина и жирных кислот. Регуляция данного переключения осуществляется гуморальным путем: под действием инсулина происходит липогенез, а при стимуляции глюкагоном – липолиз.

Помимо своей первичной функции запасания энергии жировая ткань является важнейшим эндокринным органом. Секретируемые ею гормоны, называемые также адипокинами, непосредственно регулируют метаболические процессы всех тканей организма. Двумя наиболее изученными адипокинами являются лептин и адипонектин. Лептин вызывает чувство насыщения за счет способности регулировать синтез и высвобождение медиатора голода – нейропептида Y. Адипонектин стимулирует β-окисление жирных кислот и поддерживает уровень глюкозы в кровотоке [1], а его высокомолекулярная форма улучшает регенерацию при сердечно-сосудистых заболеваниях [2]. Совместное действие двух этих гормонов имеет синергический эффект, выражающийся в значительном увеличении чувствительности к инсулину, показанном на модели липоатрофических мышей [3].

Белая жировая ткань является преобладающим типом жировой ткани у млекопитающих. Она расположена под кожей (подкожная жировая ткань), а также вокруг внутренних органов (висцеральная жировая ткань). Наряду с белым жиром, у млекопитающих существует второй тип жировой ткани – бурая жировая ткань, отличающаяся морфологически и функционально. Два типа жировой ткани состоят из разных клеток: белых и бурых адипоцитов.

Бурая жировая ткань представляет собой малую часть жировой ткани организма взрослого человека и сосредоточена в нескольких участках тела: в подмышечных впадинах, между лопаток и на задней поверхности шеи. Темный цвет ткани обусловлен большей васкуляризацией и высоким содержанием цитохромов в митохондриях адипоцитов, количество митохондрий увеличено вследствие выполнения специфической функции. В бурых адипоцитах экспрессируется ген термогенина UCP1 (uncoupling protein 1), разобщающего дыхательную цепь белка, что позволяет транспортируемым протонам входить в митохондриальный матрикс без синтеза АТФ. Таким образом, скорость клеточного дыхания возрастает, и генерируется тепло. Бурые адипоциты отличаются от белых по морфологии: клетки имеют меньший размер, ядро часто располагается в центре клетки (у белых – всегда эксцентрично), а триглицериды накапливаются во множестве маленьких липидных капель, поэтому эти клетки иногда называют многокапельными адипоцитами.

Появление избыточной массы тела и развитие ожирения связано с экспансией белой жировой ткани. Это увеличение происходит при нарастании объема адипоцитов (гипертрофии) и/или изменении их количества (гиперплазии) [4], сопровождающих ожирением и инсулинорезистентностью. Гиперплазия адипоцитов чаще всего сопутствует наиболее тяжелым формам ожирения, развивающимся, как правило, в молодом возрасте. Основной причиной ожирения является нарушение баланса между накоплением и потреблением энергии. Ускоренное превращение преадипоцитов в адипоциты как таковое не способно коренным образом изменить этот баланс. Сходным образом, изменение количества жировых клеток является неправильным подходом лечения ожирения, так как в отсутствие адипоцитов жир накапливается в других органах и приводит к еще более тяжелым последствиям [5]. Избыточный объем и эктопическая локализация жировой ткани приводят к нарушению не только ее метаболической, но и секреторной функции, что сопровождается развитием осложнений метаболического синдрома: ишемической болезни сердца, атеросклероза, почечной недостаточности, неалкогольной жировой болезни печени. Изучение механизмов индукции патологического адипогенеза и сопутствующих нарушений сигнализации жировой ткани представляет большой интерес для понимания путей адаптации метаболизма современного человека, а также имеет первостепенное значение для разработки эффективных способов профилактики и лечения метаболического синдрома.

Сроки формирования функционирующей жировой ткани зависят от вида. У грызунов белая жировая ткань возникает большей частью после рождения, хотя с помощью чувствительных методов можно наблюдать экспрессию маркеров жировой ткани в подкожной области уже на 16,5–17,5 день эмбрионального развития, а подкожные адипоциты с липидными каплями видны на день позже этого [6, 7]. В организме человека, напротив, наблюдается развитие белого жира на 14-й неделе беременности, хотя точные сроки зависят от размера плода. Кроме того, чем крупнее плод, тем раньше развиваются адипоциты [8, 9]. Пролиферация клеток-предшественников снижается в конце беременности, и далее жировая ткань увеличивается в первую очередь за счет преддифференцированных клеток примерно до 10 лет, далее следует подростковый период, во время которого возрастает количество жировых клеток. Этот период определяет общее количество адипоцитов, которое индивид будет иметь на протяжении жизни, несмотря на то, что новые клетки будут образовываться и разрушаться [10]. Подобным образом обновляется около 10% адипоцитов человека в год. Для сравнения: за день у мыши погибает и возникает вновь 0,6% адипоцитов [11, 12].

Развитие адипоцитов

Выделяют два основных этапа развития адипоцита. На первом этапе происходит превращение мезенхимальной стромальной клетки (mesenchymal stromal cell, MSC) в предшественник жировой клетки (преадипоцит), а на втором, наиболее изученном, окончательное превращение в зрелую жировую клетку [13]. Как белые, так и бурые адипоциты происходят от мезенхимальной стромальной клетки, однако они образуются из различных клеток-предшественников.

Предшественники белых адипоцитов присутствуют в жировой ткани на протяжении всей жизни. Жировая ткань только на треть состоит из адипоцитов, тогда как оставшиеся две трети – это клетки кровеносных сосудов (ткань сильно васкуляризована), нервные волокна, фибробласты и собственно предшественники клеток жировой ткани на разных стадиях развития [14].

Существующие экспериментальные модели не позволяют с точностью идентифицировать предшественники жировой клетки – преадипоциты. Как правило, во время исследований содержащая клетки-предшественники стромоваскулярная фракция отделяется от зрелых жировых клеток посредством ферментативной обработки коллагеназой и последующего центрифугирования на низких скоростях. Когда стромоваскулярная фракция культивируется ex vivo, то клетки крови, эндотелия и другие не фибробластоподобные клетки не прикрепляются к поверхности чашки. Прикрепившиеся клетки способны дифференцироваться под действием гормонального коктейля, включающего инсулин, дексаметазон (агонист глюкокортикоидного рецептора), изобутилметилксантин (повышающий уровень внутриклеточного цAMФ-агент). Подобная методика не позволяет выделить специфическую популяцию в составе стромоваскулярной фракции, которая непосредственно участвует в образовании зрелых адипоцитов in vivo, и это послужило причиной множества исследований методами проточной цитометрии с использованием антител к различным поверхностным маркерам. Большинство из них показывают, что мезенхимальные стволовые клетки, имеющие маркеры CD34 и Sca-1, богаты предшественниками адипоцитов [15]. Более тщательный анализ поверхностных маркеров первичной культуры клеток, дифференцировавшихся in vitro в зрелые адипоциты, выявил наличие двух различных популяций: CD24+ (lin- :CD29+:CD34+:Sca-1+:CD24+) и CD24-. Однако опыты по трансплантации липодистрофичным мышам обеих популяций, меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), показали, что лишь инъекции клеток CD24+ приводят к образованию жировой ткани, адипоциты которой имеют нормальную морфологию. Клетки CD24-, как и CD34-, не способны образовывать жировых отложений [16]. Для преадипоцитов характерна экспрессия гена Pref1(Dlk1), который кодирует секретируемый белок Dlk1, член семейства EGF-подобных гомеотических белков, однако он не презентируется на поверхности клеток. Недавно было показано, что клетки-предшественники адипоцитов белой жировой ткани экспрессируют PDGFRα (CD140a), который также является маркером всех адипоцитов в белом жире [17]. Имеющаяся линия трансгенных мышей PDGFRα-Cre является одной из наиболее адекватных для исследований клеток-предшественников жировой ткани, так как позволяет производить делецию в преадипоцитах [18].

Происхождение бурых адипоцитов несколько иное [19]. Они образуются из Myf5+ клеток-предшественников скелетной мышечной ткани и мышечных тканей других типов. Дифференцировка предшественников в бурые адипоциты происходит под контролем транскрипционного кофактора PRDM16 [20].

Примечательно, что в подкожных отложениях белой жировой ткани часто находят многокапельные адипоциты, подобные бурым по морфологии и физиологии. Холодовая адаптация и стимуляция β3-селективными адренергическими агонистами стимулируют PRDM16, что приводит к повышению в клетках экспрессии UCP1 и к образованию бежевых (буроподобных) адипоцитов [21].

Экспериментальное моделирование адипогенеза

Механизмы дифференцировки преадипоцитов изучаются, главным образом, посредством in vitro моделей адипогенеза, и большая часть имеющихся данных была получена именно с использованием таких систем. Полученная клонированием клеточная линия представляет собой гомогенную популяцию, состоящую из клеток, находящихся на одной стадии дифференцировки. Это, в первую очередь, позволяет получить определенный ответ на стимуляцию. В то же время, клетки могут многократно пассироваться и культивироваться в течение долгого времени, что дает практически неограниченный источник преадипоцитов для исследования.

Линии предшественников жировых клеток подразделяют на мультипотентные фибробласты и унипотентные преадипоциты. Мультипотентные фибробласты (CHEF/18, RCJ3.1, 10T1/2, 1246, Balb/c 3T3,NIH 3T3 и 3T3-Swissalbino) сохраняют способность к дифференцировке в различные типы клеток. Унипотентные преадипоциты (3T3-F422A, 1246, Ob1771, TA1, 30A5, SGBS и 3T3-L1) уже прошли первую стадию дифференцировки, но сохраняют способность к пролиферации и могут как терминально дифференцироваться в адипоциты, так и оставаться в недифференцированном состоянии. Именно линии унипотентных прогениторных клеток являются наиболее изученными моделями исследования молекулярных процессов перехода преадипоцитов в адипоциты. Подавляющее число исследований проводится с использованием линии 3T3-L1, полученной субклонированием клеток 3T3 из дезагрегированных эмбрионов мышей Swiss [22]. Дифференцированные клетки 3T3-L1 в культуре обладают большинством ультраструктурных характеристик адипоцитов жировой ткани животных [23]. Инъекции преадипоцитов 3T3-L1 мышам вызывают формирование нормальных жировых отложений [24].

Конфлюентные преадипоциты 3T3-L1 дифференцируются синхронно в присутствии индукторов адипогенеза в среде культивации. Максимальная степень дифференцировки была показана при действии смеси инсулина, глюкокортикоидов, агента, повышающего уровень внутриклеточного цAMФ и фетальной бычьей сыворотки [25]. Инсулин действует через инсулиновый рецептор и рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (insulin-like growth factor 1, ИРФ-1). Интересно, что сходство инсулина с ИРФ-1 позволяет использовать последний вместо инсулина в адипогенных коктейлях [26]. Синтетический глюкокортикоид дексаметазон традиционно используется для стимуляции сигнального пути рецептора глюкокортикоидов (ГР). Изобутилметилксантин (IBMX, иногда MIX), ингибитор цAMФ-фосфодиэстеразы, используется для повышения концентрации цАМФ внутри клетки и активации цАМФ-зависимых протеинкиназ.

Приблизительно через 24 ч после индукции адипогенным коктейлем преадипоциты проходят постконфлюентный митоз. Ко 2-му дню дифференцировки клетки завершают деление и входят в специфическую фазу блокировки роста, называемую GD [27]. Предполагается, что митотическое деление необходимо для того, чтобы освободить ДНК для связывания транскрипционных факторов с регуляторными элементами генов, экспрессирующихся в зрелых адипоцитах [28, 29]. После вступления в GD клетки принято считать дифференцированными. К 3-му дню в клетках уже экспрессируются поздние маркеры дифференцировки: липогенные и липолитические ферменты и другие белки. Позднее клетки принимают округлую форму, и начинается формирование липидных капель. Окончательно адипоциты дифференцируются к 5–7 дням от индукции.

Транскрипционные факторы адипогенеза

Транскрипционные факторы определяют выбор пути развития клетки за счет управления экспрессией множества генов, в том числе и генов других факторов транскрипции, определяющих дальнейшую специа­лизацию. Адипогенный каскад (рис. 1) по составу вовлеченных в процесс транскрипционных факторов и активируемых ими генов адипогенной программы можно разделить на две основных «волны». «Первая волна» инициируется адипогенными стимулами и включает в себя такие факторы, как C/EBPβ и C/EBPδ, факторы KLF (Krüppel-подобные факторы), CREB (белок, связывающий цАМФ-зависимый элемент). Транскрипционные факторы первой «волны» индуцируют экспрессию факторов «второй волны» – C/EBPα и PPARγ. Предполагается, что главную роль в осуществлении адипогенной программы играет экспрессия и активация липид-активируемого ядерного рецептора PPARγ (peroxisome proliferators-activated receptorγ). Его экспрессия является необходимым и достаточным условием для дифференцировки в адипоцитарном направлении. Эктопической экспрессии PPARγ достаточно для индукции адопоцитарной дифференцировки фибробластов, и кроме того, не было идентифицировано ни одного фактора, способного вызывать адипогенез в отсутствие PPARγ [30].

Белки C/EBP были первыми описанными факторами транскрипции, которые играют критическую роль в процессе адипогенеза. Они также одними из первых после добавления дифференцировочного коктейля увеличивают свою экспрессию и индуцируются в основном под воздействием IBMX (сигнальный каскад цAMФ). Последовательность экспрессии этих факторов в адипогенной дифференцировке определяет каскад, в котором очень ранняя индукция C/EBPβ и C/EBPδ приводит к индукции C/EBPα. Данная концепция подтверждается последовательностью связывания данных транскрипционных факторов с несколькими адипоцитарными промоторами в ходе процесса дифференцировки.

Мыши со сниженной экспрессией C/EBPβ имеют меньший объем жировой ткани, что, впрочем, может быть вызвано нарушениями липогенеза. Скорее всего, недостаток C/EBPβ может компенсироваться C/EBPδ, так, мыши с двойным нокаутом по C/ebpb и C/ebpd имеют еще меньшую массу жировой ткани [31].

Ключевые события «первой волны» адипогенной дифференцировки, такие как индукция C/EBPβ, вызываются увеличением внутриклеточного цАМФ [32, 33, 34]. Связывающий цАМФ-зависимый элемент белок (CREB) – важный для адипогенеза и содержащий bZIP-домен транскрипционный фактор, поскольку именно он индуцирует экспрессию C/EBPβ [35, 33, 36]. CREB изначально был описан как внутриклеточная мишень цАМФ, чья транскрипционная активность регулируется цАМФ-зависимой протеинкиназой A (PKA).

На первом этапе адипогенной дифференцировки большую роль играет инсулин. Фибробласты и предшественники бурых жировых клеток, не экспрессирующие рецептор инсулина, не способны к адипогенной дифференцировке [37]. Другие участники сигнального каскада инсулина также имеют решающее значение для адипогенеза. «Выключение» субстрата инсулинового рецептора (IRS) снижает уровень адипогенной дифференцировки [38]. Двойной нокаут по Irs1 и Irs2 полностью блокирует адипогенез [39]. Ингибирование активности киназ PI3K и Akt1 или Akt2 снижает адипогенную дифференцировку. Двойной нокаут по Akt1 и Akt2 приводит к липоатрофии, а MEF из этих животных не способны к дифференцировке [40]. Важность инсулинового пути подчеркивает также то, что известный случай семейного липодистрофичного диабета вызван именно мутацией в гене Akt2 [41].

Установлено несколько возможных механизмов действия инсулина на адипогенез. Во-первых, связываясь со своим рецептором, он запускает внутриклеточный сигнальный каскад, приводящий к активации киназы Akt и фосфорилированию анти-адипогенные транскрипционные факторы FOXO1 и FOXA2, что вызывает их выход из ядра и деактивацию [42, 43]. Во-вторых, инсулин вызывает фосфорилирование белка CREB. Это приводит к его активации, осуществляя своеобразную связь между инсулиновым и цАМФ-зависимым каскадами. Наконец, инсулин приводит к активации гена Srebf1, играющего значительную роль на последующих стадиях адипогенеза [44].

Глюкокортикоиды, участники третьего каскада дифференцировки, являются неотъемлемыми индукторами адипогенной дифференцировки [45]. Точная роль глюкокортикоидного рецептора в процессе дифференцировки до недавнего времени сводилась к регуляции экспрессии гена преадипоцитарного секретируемого фактора Pref1, однако новые методы исследования позволили раскрыть его функции в регуляции большого числа адипоцит-специфических генов. Недавно было показано, что ГР совместно с C/EBPβ связываются с ДНК в нескольких тысячах геномных участках, имеющих свойства энхансеров, уже через несколько часов после индукции дифференцировки. Полученные данные позволяют говорить о новой роли ГР и C/EBPβ в адипоцитарной дифференцировке.

Во «второй волне» дифференцировки основную роль играют факторы C/EBPα и PPARγ. Анализ C/ebpa-/- мышей затруднен в силу их высокой гипогликемии и смертности сразу после рождения и требует искусственного восстановления экспрессии C/ebpa в печени. Мыши же с восстановленной экспрессией C/ebpa в печени были практически лишены жировой ткани [46]. Примечательно, что C/EBPα и PPARγ могут взаимно индуцировать экспрессию, связываясь с регуляторными элементами генов Pparg и C/ebpa, кроме того, полногеномные исследования показывают, что C/EBPαможет связывать до 60% участков связывания PPARγ [47]. Таким образом, C/EBPα и PPARγ работают совместно при активации адипоцитарной метаболической программы, а также облегчают связывание друг друга с хроматином и рекрутируют кофакторы [48].

PPARγ – ядерный рецептор, относящийся к семейству PPAR. Белки этого семейства выполняют роль транскрипционных регуляторов внутриклеточных процессов во многих тканях. Как и все рецепторы семейства PPAR, PPARγ активен только в форме гетеродимера с RXR (retinoid X-receptors, рецепторы ретиноидов X) [49]. Существует две различные (γ1 и γ2) изоформы PPARγ, причем изоформа γ2 высокоспецифична для жировой ткани. PPARγ активируется позднее других транскрипционных факторов и играет критическую роль в развитии и адипогенной дифференцировке. Как уже отмечалось выше, его экспрессия является необходимым и достаточным условием для дифференцировки фибробластов в адипоцитарном направлении.

Для функционирования PPARγ требуется наличие лиганда, поиск которого был в значительной степени неудачным. На протяжении первых двух дней дифференцировки клеток 3T3-L1 наблюдается цАМФ-зависимая активация лиганд-зависимого домена PPARγ, после чего быстро спадает. Это наблюдение показывает, что лиганд-зависимая активация PPARγ необходима для индукции адипогенеза, но не для поддержания PPARγ-зависимой экспрессии генов в зрелых адипоцитах. В ходе других исследований было обнаружено, что транскрипционные факторы SREBP1c и C/EBPβ могут повышать продукцию лигандов PPARγ. Все это, однако, не привело к идентификации эндогенных агонистов [34, 44]. В терапии метаболического синдрома (резистентность к инсулину, ожирение и гипертензия) и СД2 широко применяют тиазолидиндионы (TZD), действующие непосредственно на PPARγ. TZD являются синтетическими лигандами PPARγ [50].

Транскрипционные сети адипогенеза

Обнаружение факта совместного связывания ГР и C/EBPβ с энхансерами в геноме привело к предположению о наличии определенных участков в геноме (впоследствии названных «горячими участками» («hot spots»), в которых осуществляется взаимодействие сразу большого числа транскрипционных факторов с ДНК (рис. 2). Полногеномный анализ связывания 15 известных адипоцит-специфичных транскрипционных факторов (проанализированы в том числе факторы AP1, C/EBP, KLF, STAT) показал наличие более 12 тысяч таких участков, в которых наблюдается связывание одновременно пяти или более таких факторов. Было установлено, что это связывание осуществляется уже в первые 4 ч после индукции дифференцировки, а эти участки обладают всеми свойствами полноценных энхансеров [51].

Кроме того, связывание с этими участками функцио­нально коррелирует с индукцией экспрессии ранних адипоцит-специфичных генов, доказывая их функциональную значимость. Большинство из них расположено в местах транскрипционно-активного хроматина на ранних стадиях адипогенеза, что подтверждает их значимость на «первой волне» дифференцировки.

Таким образом, эти данные доказывают существование взаимодействия между многочисленными транскрипционными факторами непосредственно на хроматине in vivo, что может служить точками интегрирования различных адипогенных сигналов в масштабе всего генома. Это наблюдение приводит к значительному переосмыслению механизма распространения сигнальных каскадов в адипогенной дифференцировке.

PBX1 и PREP1

Одним из основных связывающихся с «горячими участками» в раннем адипогенезе факторов является транскрипционный фактор Pbx1 [51]. Pbx1 относится к семейству TALE и является гомеодомен-содержащим белком. Было показано, что снижение экспрессии Pbx1 в выделенных из жировой ткани мезенхимальных стромальных клетках приводит к значительному усилению способности к дифференцировке [52].

Pbx1 функционирует в форме многомерных комплексов. Одним из основных белков-партнеров Pbx1 является Prep1 (Pbx regulating protein 1). Prep1, как и Pbx1, относится к семейству гомеобокс-содержащих транскрипционных факторов TALE (three aminoacid loop extension, гомеодомен белков этого семейства имеет три дополнительные аминокислоты по сравнению с Hox) [53]. Prep1, взаимодействуя с Pbx1, влияет на специфичность его связывания с ДНК, а также значительно повышает аффинность. Prep1 и Pbx1 совместно участвуют в процессах эмбриогенеза, в частности, они образуют с фактором Hoxb1 тройной комплекс, регулирующий экспрессию генов в эмбриогенезе [54].

Нокаут, как Prep1, так и Pbx1 приводит к гибели мышиных эмбрионов на ранних стадиях развития [55, 56]. Понижение экспрессии гена Prep1 в клетках-предшественниках жировой ткани также приводит к усилению способности к дифференцировке (Пеньков и Егоров, не опубликовано). Мы предполагаем, что фактор транскрипции Prep1 совместно с Pbx1 участвует в формировании энхансеосомных комплексов, контролирующих пребывание клеток-предшественников в недифференцированном состоянии, и контроле раннего адипогенеза.

Заключение

В настоящее время в терапии СД2 и метаболического синдрома используются лекарственные средства направленного действия, искусственно синтезированные агонисты PPARγ – TZD, а полученные данные о транскрипционной программе адипогенной дифференцировки позволяют прогнозировать наследственную предрасположенность к этим патологическим состояниям. Однако многое в транскрипционной регуляции адипогенеза остается неизвестным. В частности, не до конца выяснен механизм формирования многомерных комплексов транскрипционных факторов и перестройки хроматина, вызывающие переход от недифференцированного состояния к дифференцированному.

В настоящем обзоре рассмотрены основные сигнальные пути и транскрипционные факторы, представляющие интерес в качестве новых мишеней для поиска лекарственных средств. Один из описанных факторов адипогенеза, PPARγ, – уже широко используется. В данном обзоре рассмотрена возможность использования других факторов, таких как факторы транскрипции Prep1 и Pbx1, в качестве таких мишеней.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Работа проведена в рамках выполнения научного проекта, поддержанного грантом Российского научного фонда (проект № 14-35-00026).

Авторы декларируют отсутствие двойственности (конфликта) интересов, связанных с рукописью.