Ассоциация полиморфного маркера-23HphI гена INS с сахарным диабетом 1 типа

Сахарный диабет 1 типа (СД1) является многофакторным заболеванием, вызываемым аутоиммунным разрушением β-клеток, которое приводит к полному прекращению эндогенного синтеза инсулина [1]. В развитии СД1 играют существенную роль как генетические факторы, так и факторы окружающей среды [2]. Исследования аутопсийного материала ткани поджелудочной железы показали, что разрушение β-клеток вызывается лимфоцитарной инфильтрацией островков Лангерганса дендритными клетками (DC), макрофагами и Т-лимфоцитами (CD4+ и CD8+). При этом не затрагиваются α-клетки, секретирующие глюкагон, и δ-клетки, секретирующие соматостатин [3]. Еще одним доказательством развития именно аутоиммунного процесса являются выявляемые в сыворотке крови антитела, специфичные для собственных белков организма [4], самые важные из которых представлены антителами к инсулину, GAD65 (декарбоксилаза глутаминовой кислоты) и IA2 (внутриклеточная тирозинфосфатаза). В патогенез СД1 вовлечены оба типа Т-лимфоцитов, при этом Т-хелперы (CD4+) распознают внеклеточные антигены (связанные с MHC класса II) и стимулируют воспаление посредством высвобождения цитокинов, а цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) реагируют на эндогенные антигены (возможно, вирусные, связанные с MHC класса I) и уничтожают клетки-мишени.

К моменту манифестации заболевания значительная часть β-клеток уже оказывается уничтоженной, таким образом, прогноз риска развития заболевания и предупреждение возникновения СД1 являются ключевыми задачами, и понимание механизмов развития патологии может существенно приблизить к решению этих вопросов.

Более 30 лет назад были получены первые свидетельства вовлеченности хромосомной области 6p21, содержащей гены главного комплекса гистосовместимости (MHC) в развитие СД1 [5]. К началу эпохи полных геномных поисков было установлено и подтверждено как минимум четыре локуса предрасположенности к СД1: локус MHC (6p21) [5–9], ген проинсулина INS (11p15) [10–14], ген CTLA4 (2q31-q33) [15–17] и ген PTPN22 (1p13) [18–21], при этом было показано, что локусы HLA и INS определяют около 60-70% генетического риска развития СД1.

Ассоциацию с СД1 локуса INS объясняли разным числом повторов мини-сателлитного тандемного повтора VNTR, расположенного в 596 п.н. от гена INS в его промоторной области [13, 22–25]. Число повторов в составе VNTR может изменяться от 26 до более чем 200. В зависимости от их числа аллели VNTR (variable numbers of tandem repeat – тандемные повторы с изменяющимся числом копий) подразделяют на 3 класса. Аллели класса I содержат от 26 до 63 повторяющихся единиц, тогда как аллели класса III включают от 141 до 209 звеньев (рис. 1). Промежуточный по длине класс II редко встречается у европеоидов и состоит из аллелей, содержащих около 80 тандемных повторов [26]. В ряде работ была показана ассоциация определенных аллелей VNTR с уровнем экспрессии гена инсулина в тимусе и в β-клетках [23–25, 27–29]. У индивидов, носителей аллелей класса III уровень мРНК проинсулина в тимусе в 2-3 раза превышает аналогичные показатели у носителей аллелей класса I [13]. Предполагается, что более высокие уровни экспрессии гена INS в тимусе способствуют развитию центральной толерантности, что может объяснять защитную роль этого некодирующего полиморфного маркера. Во многих исследованиях для идентификации аллелей VNTR использовался полиморфный маркер –23HphI (dbSNP rs689) гена INS, который находится в полном неравновесии по сцеплению с VNTR, но, возможно, обладает также и независимым биологическим эффектом. Для русской популяции подобных исследований ассоциации полиморфного маркера –23HphI с СД1 до сих пор не проводилось.

В настоящем исследовании была поставлена задача изучить ассоциацию полиморфного маркера –23HphI гена INS с СД1 у русских больных, проживающих в Москве.

Материалы и методы

В работе использовали образцы крови от двух групп больных СД1 (177 человек) и здоровых индивидов (206 человек) русского происхождения, любезно предоставленные сотрудниками ФГУ Эндокринологический научный центр (г. Москва).

Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (г. Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (г. Москва). Флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (г. Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [30].

Амплификацию полиморфного участка –23HphI гена INS проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени» на термоциклере «ABI 7500 Fast» (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 0,01-процентный Твин-20, 2 мМ хлорида магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров (INS-1-FJ, 5’-ttccccgcacactaggtagag-3’ и INS-1-RJ, 5’-agggcacctggccttcag-3’), 100 нМ зондов (INS-1-FAM, FAM-5’-ccctgcctgtctcccagatcactg-3’-BHQ1 и INS-1-VIC, VIC-5’-ccctgcctgtcacccagatcactg-3’-BHQ1) 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50-100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95° C/2 мин – 1-й цикл; 94° C/10 сек, 60° C/60 – 40 циклов. Размер продукта амплификации – 197 п.н. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (χ2). Достоверными считали различия при p<0,05. Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали относительный риск (OR). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR>1 – как положительную ассоциацию (повышенный риск развития патологии), OR<1 – как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (пониженный риск развития патологии). Доверительный интервал (CI, confidence interval) представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра, в данном случае – значение OR. Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях "случай-контроль"» [31].

Результаты и обсуждение

Распределение частот генотипов полиморфного маркера –23HphI (A/T) гена INS в группе здоровых индивидов русского происхождения соответствовало распределению Харди-Вайнберга, существенных отличий от частот аллелей и генотипов в европейской популяции обнаружено не было. Этот полиморфный маркер находится в интроне 1 гена INS в 6 п.н. от 3`-участка сплайсинга первого интрона.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера –23HphI гена INS выявил статистически значимые различия в группе больных СД1 и группе здоровых индивидов. Достоверное увеличение частоты аллеля A (OR=2,03; p=4,0×10-5) в группе больных СД1 говорит об ассоциации аллеля A c повышенным риском развития данной патологии и повышенном риске развития СД1 у носителей генотипа AA (OR=2,03; p=3,7×10-4) (табл. 1). В то же время была установлена ассоциация аллеля T с пониженным риском развития СД1 (OR=0,49, p=4,0×10-5), что свидетельствует о корреляции носительства генотипа TT (OR=0,25; p=3,7×10-4) со сниженным риском развития этого заболевания. Таким образом, можно сделать вывод, что полиморфный маркер –23HphI гена INS у русских ассоциирован с СД1.

Ген INS находится в хромосомной области 11р15.5 между генами тирозингидроксилазы (ТН) и инсулиноподобного фактора роста II (IGF2) (рис. 1). Несмотря на множество исследований по изучению ассоциации с СД1 области VNTR, с которой связывается транскрипционный фактор Pur1, что, собственно, и влияет на уровень экспрессии инсулина, нельзя исключить возможного независимого влияния однонуклеотидных полиморфных маркеров, таких как –23HphI, A1140C и ряда других, на развитие заболевания.

Полиморфный маркер –23HphI расположен в полипиримидиновом тракте, служащем сигналом для сплайсинга 3`-конца интрона 1, который разделяет кодирующий и некодирующий экзоны. Замена А на Т может влиять на эффективность сплайсинга и приводить к появлению транскриптов с более длинным 5`-нетранслируемым участком, что в свою очередь может влиять на эффективность трансляции мРНК [32]. Различия в длинах транскриптов гена INS уже обнаруживали ранее, но авторы не обсуждали данные наблюдения [33]. В 2006 г. была предпринята попытка выяснить влияние полиморфного маркера –23HphI на транскрипцию гена INS [27]. Обнаружено 6 различных изоформ мРНК, три из которых подвергались правильному сплайсингу интрона 2, а три были лишены 5`-конца экзона 3 (кодирует С-пептид и А-цепь инсулина), что подтвердило более ранние наблюдения [28]. Вариант с заменой Т содержал значительно меньше нефункциональных изоформ с отсутствующим экзоном 2 и оставшимся интроном 1, чем вариант с аллелем А, что говорит о более эффективном сплайсинге пре-мРНК, содержащей аллель Т полиморфного маркера –23HphI. Эксперименты с клеточными линиями (клетки 293T и линии, полученные из β-клеток) показали, что пре-мРНК с аллелем T дает большее относительное содержание полнофункционального транскрипта проинсулина и более низкий уровень экспрессии, в то время как аллель A приводит к повышению экспрессии и к большему разнообразию изоформ. Недавно было обнаружено, что клонированные Т-лимфоциты, взятые у пациентов с СД1 и с предрасполагающим гаплотипом DR4, специфически узнают эпитоп A1-15 проинсулина [34–36]. Эти 15 аминокислот А-пептида кодируются 5`-концом экзона 3, который отсутствует в ряде изоформ, что, возможно, может влиять на развитие аутоиммунной толерантности (рис. 1). Несмотря на подтверждение эффекта альтернативного сплайсинга [29], необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения тканеспецифичных профилей экспрессии у человека, так как повышенная экспрес­сия большого количества изоформ проинсулина в β-клетках, которая ассоциирована с аллелем A, может стимулировать аутоиммунный ответ, а различные уровни экспрессии в поджелудочной железе и тимусе могут объяснить влияние генетических факторов на развитие СД1 [37]. Возможно, предрасполагающая роль аллеля А и сцепленного с ним VNTR класса I объясняется пониженной экспрессией изоформ проинсулина в тимусе (но не в β-клетках) и снижением эффективности центральной толерантности против всех возможных эпитопов инсулина, представляемых β-клетками. На участие именно антигенных детерминант инсулина в развитии СД1 указывает тот факт, что ассоциации полиморфных маркеров гена INS c СД 2 типа (СД2) обнаружено не было, и, вероятно, различия в уровнях экспрессии проинсулина носителями различных генотипов VNTR и полиморфного маркера –23HphI гена INS регулируются компенсаторными механизмами и не влияют на возникновение СД1 [38].

Непосредственным применением знаний об этом локусе является возможность использовать данные генотипирования для прогноза реакции на ввод инсулина, предполагаемого главного аутоантигена для СД1 [39], для стимулирования толерантности. Орально введенный инсулин, попадая в желудочнокишечную иммунную систему, предотвращает диабет у мышей линии NOD, но для людей подобные попытки терапии оказались безуспешными (исследование Diabetes Prevention Trial 1, DPT-1, [40]). Последующий углубленный анализ показал наличие положительного эффекта у пациентов с высоким титром аутоантител к инсулину [41]. Этот результат является крайне интересным, так как показано, что предрасполагающий генотип локуса VNTR, так же как и маркера –23HphI гена INS, ассоциирован с повышенным уровнем аутоантител к инсулину у пациентов с СД1 [42]. Возможность использования биомаркеров в индивидуализированной терапии в настоящее время тестируется в многоцентровом исследовании в рамках программы Type 1 Diabetes TrialNet [43]. Когда мы станем лучше понимать роль инсулина в развитии СД1, станет возможно на основании генетического анализа локуса INS проводить персонализированную терапию, направленную на стимулирование толерантности к инсулину.

Изучение ассоциации полиморфных маркеров гена INS ускорило исследования тканеспецифичной экспрессии аутоантигенов в тимусе [44], что открывает путь к развитию новых терапевтических подходов. Недавно были выделены и охарактеризованы клеточные линии клеток эпителия тимуса, экспрессирующих инсулин, это позволит выяснить механизм контроля транскрипции гена INS в тимусе (сильно отличающейся от такового в β-клетках) и даст возможность применять методы клинической медицины в терапии СД1 [45].