В работе использовали образцы крови от двух групп больных СД1 (177 человек) и здоровых индивидов (206 человек) русского происхождения, любезно предоставленные сотрудниками ФГУ Эндокринологический научный центр (г. Москва).

Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (г. Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (г. Москва). Флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (г. Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [30].

Амплификацию полиморфного участка –23HphI гена INS проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени» на термоциклере «ABI 7500 Fast» (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 0,01-процентный Твин-20, 2 мМ хлорида магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров (INS-1-FJ, 5’-ttccccgcacactaggtagag-3’ и INS-1-RJ, 5’-agggcacctggccttcag-3’), 100 нМ зондов (INS-1-FAM, FAM-5’-ccctgcctgtctcccagatcactg-3’-BHQ1 и INS-1-VIC, VIC-5’-ccctgcctgtcacccagatcactg-3’-BHQ1) 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50-100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95° C/2 мин – 1-й цикл; 94° C/10 сек, 60° C/60 – 40 циклов. Размер продукта амплификации – 197 п.н. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (χ2). Достоверными считали различия при p<0,05. Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали относительный риск (OR). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR>1 – как положительную ассоциацию (повышенный риск развития патологии), OR<1 – как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (пониженный риск развития патологии). Доверительный интервал (CI, confidence interval) представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра, в данном случае – значение OR. Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях "случай-контроль"» [31].

Распределение частот генотипов полиморфного маркера –23HphI (A/T) гена INS в группе здоровых индивидов русского происхождения соответствовало распределению Харди-Вайнберга, существенных отличий от частот аллелей и генотипов в европейской популяции обнаружено не было. Этот полиморфный маркер находится в интроне 1 гена INS в 6 п.н. от 3`-участка сплайсинга первого интрона.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера –23HphI гена INS выявил статистически значимые различия в группе больных СД1 и группе здоровых индивидов. Достоверное увеличение частоты аллеля A (OR=2,03; p=4,0×10-5) в группе больных СД1 говорит об ассоциации аллеля A c повышенным риском развития данной патологии и повышенном риске развития СД1 у носителей генотипа AA (OR=2,03; p=3,7×10-4) (табл. 1). В то же время была установлена ассоциация аллеля T с пониженным риском развития СД1 (OR=0,49, p=4,0×10-5), что свидетельствует о корреляции носительства генотипа TT (OR=0,25; p=3,7×10-4) со сниженным риском развития этого заболевания. Таким образом, можно сделать вывод, что полиморфный маркер –23HphI гена INS у русских ассоциирован с СД1.

Ген INS находится в хромосомной области 11р15.5 между генами тирозингидроксилазы (ТН) и инсулиноподобного фактора роста II (IGF2) (рис. 1). Несмотря на множество исследований по изучению ассоциации с СД1 области VNTR, с которой связывается транскрипционный фактор Pur1, что, собственно, и влияет на уровень экспрессии инсулина, нельзя исключить возможного независимого влияния однонуклеотидных полиморфных маркеров, таких как –23HphI, A1140C и ряда других, на развитие заболевания.

Полиморфный маркер –23HphI расположен в полипиримидиновом тракте, служащем сигналом для сплайсинга 3`-конца интрона 1, который разделяет кодирующий и некодирующий экзоны. Замена А на Т может влиять на эффективность сплайсинга и приводить к появлению транскриптов с более длинным 5`-нетранслируемым участком, что в свою очередь может влиять на эффективность трансляции мРНК [32]. Различия в длинах транскриптов гена INS уже обнаруживали ранее, но авторы не обсуждали данные наблюдения [33]. В 2006 г. была предпринята попытка выяснить влияние полиморфного маркера –23HphI на транскрипцию гена INS [27]. Обнаружено 6 различных изоформ мРНК, три из которых подвергались правильному сплайсингу интрона 2, а три были лишены 5`-конца экзона 3 (кодирует С-пептид и А-цепь инсулина), что подтвердило более ранние наблюдения [28]. Вариант с заменой Т содержал значительно меньше нефункциональных изоформ с отсутствующим экзоном 2 и оставшимся интроном 1, чем вариант с аллелем А, что говорит о более эффективном сплайсинге пре-мРНК, содержащей аллель Т полиморфного маркера –23HphI. Эксперименты с клеточными линиями (клетки 293T и линии, полученные из β-клеток) показали, что пре-мРНК с аллелем T дает большее относительное содержание полнофункционального транскрипта проинсулина и более низкий уровень экспрессии, в то время как аллель A приводит к повышению экспрессии и к большему разнообразию изоформ. Недавно было обнаружено, что клонированные Т-лимфоциты, взятые у пациентов с СД1 и с предрасполагающим гаплотипом DR4, специфически узнают эпитоп A1-15 проинсулина [34–36]. Эти 15 аминокислот А-пептида кодируются 5`-концом экзона 3, который отсутствует в ряде изоформ, что, возможно, может влиять на развитие аутоиммунной толерантности (рис. 1). Несмотря на подтверждение эффекта альтернативного сплайсинга [29], необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения тканеспецифичных профилей экспрессии у человека, так как повышенная экспрес­сия большого количества изоформ проинсулина в β-клетках, которая ассоциирована с аллелем A, может стимулировать аутоиммунный ответ, а различные уровни экспрессии в поджелудочной железе и тимусе могут объяснить влияние генетических факторов на развитие СД1 [37]. Возможно, предрасполагающая роль аллеля А и сцепленного с ним VNTR класса I объясняется пониженной экспрессией изоформ проинсулина в тимусе (но не в β-клетках) и снижением эффективности центральной толерантности против всех возможных эпитопов инсулина, представляемых β-клетками. На участие именно антигенных детерминант инсулина в развитии СД1 указывает тот факт, что ассоциации полиморфных маркеров гена INS c СД 2 типа (СД2) обнаружено не было, и, вероятно, различия в уровнях экспрессии проинсулина носителями различных генотипов VNTR и полиморфного маркера –23HphI гена INS регулируются компенсаторными механизмами и не влияют на возникновение СД1 [38].

Непосредственным применением знаний об этом локусе является возможность использовать данные генотипирования для прогноза реакции на ввод инсулина, предполагаемого главного аутоантигена для СД1 [39], для стимулирования толерантности. Орально введенный инсулин, попадая в желудочнокишечную иммунную систему, предотвращает диабет у мышей линии NOD, но для людей подобные попытки терапии оказались безуспешными (исследование Diabetes Prevention Trial 1, DPT-1, [40]). Последующий углубленный анализ показал наличие положительного эффекта у пациентов с высоким титром аутоантител к инсулину [41]. Этот результат является крайне интересным, так как показано, что предрасполагающий генотип локуса VNTR, так же как и маркера –23HphI гена INS, ассоциирован с повышенным уровнем аутоантител к инсулину у пациентов с СД1 [42]. Возможность использования биомаркеров в индивидуализированной терапии в настоящее время тестируется в многоцентровом исследовании в рамках программы Type 1 Diabetes TrialNet [43]. Когда мы станем лучше понимать роль инсулина в развитии СД1, станет возможно на основании генетического анализа локуса INS проводить персонализированную терапию, направленную на стимулирование толерантности к инсулину.

Изучение ассоциации полиморфных маркеров гена INS ускорило исследования тканеспецифичной экспрессии аутоантигенов в тимусе [44], что открывает путь к развитию новых терапевтических подходов. Недавно были выделены и охарактеризованы клеточные линии клеток эпителия тимуса, экспрессирующих инсулин, это позволит выяснить механизм контроля транскрипции гена INS в тимусе (сильно отличающейся от такового в β-клетках) и даст возможность применять методы клинической медицины в терапии СД1 [45].