Эндотелиальные прогениторные клетки и сосудистый эндотелиальный фактор роста после рентгенэндоваскулярных вмешательств у больных сахарным диабетом 2 типа

Сердечно-сосудистые заболевания занимают лидирующую позицию среди причин смерти и инвалидизации пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2). Известно, что у пациентов с СД наблюдается ускоренное развитие и агрессивное течение заболеваний, ассоциированных с атеросклерозом. Несмотря на достигнутые успехи в лечении сердечно-сосудистых заболеваний с помощью эндоваскулярных методик, у больных СД2 частота развития кардиоваскулярных событий и ампутаций нижних конечностей остается высокой [1, 2]. Известно, что при постановке стента происходит повреждение части эндотелия. Своевременная эндотелизация необходима для восстановления функциональной целостности сосудистой стенки. По современным представлениям, восстановление поврежденной части эндотелия связывают с циркулирующими эндотелиальными прогениторными клетками (ЭПК). Данные клетки представляют собой популяцию клеток костного мозга, способных дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки и продуцировать проангиогенные факторы роста. В экспериментальных работах было показано, что ЭПК мигрируют в зону повреждения сосудистой стенки после баллонной ангиопластики и способствуют эндотелизации поврежденного сегмента [3]. Для определения этих клеток используется совместная экспрессия поверхностных маркеров CD34, CD133, VEGFR-2 (рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста-2), также известный как KDR (рецептор домена киназной вставки) [4]. Наиболее распространенным фенотипом ЭПК является популяция клеток, описываемая формулой CD34+VEGFR2+. Считается, что данные клетки более специфичны для клеток эндотелиальной линии и имеют больший потенциал в качестве биомаркера сердечно-сосудистых заболеваний [5]. В виде дополнительного маркера используют CD133, который встречается на более ранних ЭПК и не встречается на зрелых клетках. Имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что CD34+CD133+ клетки обладают более мощным регенеративным и ангиогенным потенциалом [6]. Кроме того, ЭПК характеризуются низким уровнем или отсутствием экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45 [4]. В контексте данного исследования для анализа мы определяли 2 субпопуляции ЭПК: CD34+VEGFR2+CD45- и CD34+CD133+CD45- клетки.

Количество ЭПК в периферической крови невелико. Однако при повреждении эндотелия или ишемии тканей происходит их многократное возрастание. Так, в ряде исследований показано, что после проведения чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ) отмечается повышение ЭПК [7, 8]. Поступление клеток в зону повреждения представляет собой сложный скоординированный многоступенчатый процесс, включающий мобилизацию, целенаправленную миграцию, адгезию и дифференцировку клеток с участием факторов роста, хемокинов и молекул адгезии. Одним из основных факторов, регулирующих поступление ЭПК в зону повреждения, является сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor, VEGF). В настоящее время описано несколько представителей семейства VEGF: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и плацентарный фактор роста (PIGF). VEGF-A был выделен первым и является наиболее важным и изученным представителем данного семейства, играющим ключевую роль в процессах ангиогенеза. Установлено, что VEGF активирует пролиферацию, дифференцировку, подавляет апоптоз ЭПК [9]. Биологическое действие этого фактора опосредуется путем связывания с тирозинкиназными рецепторами VEGFR-2, локализующимися на ЭПК и клетках эндотелия [10].

Установлено, что у больных СД снижено количество и нарушена функция ЭПК, что, в свою очередь, может быть предрасполагающим фактором для нарушения реэндотелизации поврежденного участка артерии [4, 11, 12]. Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению количества ЭПК у больных СД2, нет однозначного мнения об изменении количества ЭПК после эндоваскулярного вмешательства у данных больных.

Цель

Изучить количество ЭПК и концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-A) до и после рентгенэндоваскулярных вмешательств на коронарных артериях и артериях нижних конечностей у пациентов с СД2.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Проведено наблюдательное проспективное исследование.

Критерии включения

Возраст 45–80 лет, пациенты со стабильной стенокардией напряжения 2–4 ФК или критической ишемией нижних конечностей (КИНК), поступившие для выполнения баллонной ангиопластики со стентированием коронарных артерий или артерий нижних конечностей.

Критерии исключения

Сахарный диабет не 2 типа; острый коронарный синдром в течение предыдущих 6 месяцев; эндоваскулярные вмешательства или острое нарушение мозгового кровообращения в течение предыдущих 6 месяцев; гемоглобин менее 90 г/л; злокачественные новообразования, гемобластозы; тиреотоксикоз; терминальная стадия почечной или печеночной недостаточности; аллергические реакции на йодсодержащие контрастные препараты.

Условия проведения и продолжительность исследования

Исследование проводилось в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России с 2014 по 2015 гг. Всем пациентам было выполнено стандартное клинико-лабораторное и инструментальное обследование. Состояние углеводного обмена в группе больных СД2 оценивалось по уровню гликированного гемоглобина (HbA1c). У пациентов без СД2 скрининг на выявление нарушения углеводного обмена проводился по уровню HbA1c и глюкозы плазмы натощак. Пациенты с СД2 были обследованы на наличие микрососудистых осложнений. В настоящее исследование в основном были включены пожилые пациенты с тяжелыми макрососудистыми осложнениями. Согласно существующим рекомендациям, для данных пациентов целевой уровень HbA1c менее 8% [13].

Описание медицинского вмешательства

Пациентам проводился забор периферической венозной крови для определения количества ЭПК и уровня VEGF-A за 1–2 дня до рентгенэндоваскулярного вмешательства и на 2–4-й день после вмешательства.

Основной исход исследования

В рамках настоящего исследования проводилась оценка количества ЭПК и концентрации VEGF-A до и после рентгенэндоваскулярного вмешательства.

Методы регистрации исходов

Оценка циркулирующих ЭПК. Забор периферической венозной крови проводился в пробирки 4 мл Vacutainer (K3EDTA), окрашивание клеток выполняли не позже, чем через 2 ч после забора крови в двух аликвотах. Использовались панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями. Первая аликвота: FITC-меченый анти-CD34, PC5-меченый анти-CD45 и PE-меченый анти-CD133. Вторая аликвота: FITC-меченый анти-CD34, PC5-меченый анти-CD45 и PE-меченый анти-hVEGFR2/KDR. Окрашивание антителами полученных образцов крови проводили согласно протоколу, рекомендованному производителем. Лизис эритроцитов проводили в растворе Lysing Solution IOTest 3 (Beckmancoulter, Франция) в течение 10 минут при комнатной температуре. Суспензию клеток отмывали в фосфатно-солевом буфере. Цитофлюориметрический анализ проводили на приборе «FACS Сalibur» (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CellQuest». Анализировали 300–500 тысяч событий (клеток) для каждого образца.

Определение уровня VEGF-A

Образцы периферической венозной крови подвергались центрифугированию (2000 об/мин) и заморозке при –22°C. Исследование VEGF-A выполнено методом иммуноферментного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) на диагностическом наборе eBiosciense.

Анализ в подгруппах

Все пациенты были разделены на 2 группы: в 1-ю группу были включены пациенты с СД2, во 2-ю группу – пациенты без нарушения углеводного обмена. Затем, для оценки динамики ЭПК в зависимости от качества контроля гликемии (уровня гликированного гемоглобина), пациенты с СД2 были разделены на 2 группы: группа 1 – с уровнем HbA1c<8%, группа 2 – с уровнем HbA1c≥8%. В дальнейшем для анализа динамики ЭПК в зависимости от длительности заболевания пациенты 1-й группы были разделены на 2 группы. В группу 1 включены пациенты с длительностью СД2 до 10 лет, в группу 2 – с длительностью СД2 более 10 лет.

Этическая экспертиза

Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования одобрен на заседании этического комитета ФГБУ «Эндокринологический научный центр» от 23 октября 2013 г. (протокол №11).

Статистический анализ

Для статистической обработки материала использовалась программа SPSS Statistics 22 (SPSS Inc., США). Нормальность распределения проверялась критерием Шапиро-Уилка. Данные представлены в виде медианы [25-й; 75-й процентили]. Для описания качественных данных рассчитывали абсолютные (n) и относительные значения (%). Сравнение медиан независимых групп проводилось по Манну-Уитни, зависимых – по Уилкоксону. Для анализа связей между категориальными переменными использовали критерий хи-квадрат Пирсона и точный критерий Фишера. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

В исследование включено 68 пациентов (40 мужчин, средний возраст 67 [59; 74] лет). Группу 1 составили 39 пациентов с СД2, группу 2 – 29 пациентов без нарушения углеводного обмена (рис. 1).

Рис. 1. Участники исследования.

Группы были сопоставимы по возрасту, индексу массы тела (ИМТ), показателям липидного обмена, функции почек, сердечно-сосудистым событиям (табл. 1). В первой группе преобладали женщины, во второй – мужчины (60,9% и 78,9% соответственно, p=0,003). Курение отмечалось чаще у пациентов без нарушения углеводного обмена по сравнению с больными СД2 (69% и 28,2% соответственно, p=0,002).

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Примечание: *указана медиана (Me [Q25; Q75]).

При поступлении большинство пациентов получали двойную антиагрегантную терапию и гиполипидемическую терапию (табл. 2). В группе пациентов с СД2 пероральную сахароснижающую терапию получали 16 пациентов (41%), интенсифицированную схему инсулинотерапии – 16 пациентов (41%). На комбинированной терапии инсулином и пероральными сахароснижающими препаратами (ПССП) находились 7 пациентов (17%).

Таблица 2. Медикаментозная терапия

Пациенты обеих групп были сопоставимы по тяжести поражения коронарных артерий (табл. 3). В то же время у пациентов с СД2 чаще регистрировалось многососудистое поражение коронарных артерий, однако ввиду малого числа наблюдений статистической значимости по данному признаку получено не было.

Таблица 3. Характеристика поражения коронарных артерий

Стентирование коронарных артерий было выполнено 18 пациентам (46%) в группе СД2 и 18 пациентам (62%) во 2-й группе (табл. 4). Преимущественно выполнялось стентирование передней межжелудочковой артерии. Количество стентов на одного пациента в обеих группах составило 1–2. При стентировании всем пациентам в группе СД2 имплантировались стенты, выделяющие лекарство (СВЛ). В группе без СД2 15 пациентам имплантировались СВЛ, трем пациентам имплантировались голометаллические стенты. Непосредственный ангиографический успех был достигнут во всех случаях.

Таблица 4. Результаты стентирования коронарных артерий

Рентгенэндоваскулярное вмешательство на артериях нижних конечностей было выполнено 21 пациенту (53%) в 1-й группе и 11 (37%) – во 2-й группе. Пациенты обеих групп были сопоставимы по тяжести поражения артерий нижних конечностей. Преимущественно выполнялось стентирование поверхностной бедренной артерии. Большинству больных во время вмешательства выполнялась ангиопластика артерий голени (табл. 5). Количество стентов на одного пациента в 1-й и 2-й группе составило 1–2. В результате вмешательства во всех случаях был достигнут удовлетворительный ангиографический результат.

Таблица 5. Результаты стентирования и баллонной ангиопластики артерий нижних конечностей

Основные результаты исследования

Анализ результатов исследования эндотелиальных прогениторных клеток, сосудистого эндотелиального фактора роста в исследуемых группах.

При анализе изменения количества клеток до и после вмешательства было выявлено, что в группе пациентов, не страдавших СД2, наблюдалось статистически значимое повышение ЭПК. В то время как у больных СД2 после проведения эндоваскулярных вмешательств количество ЭПК не повышалось. Анализ изменения концентрации VEGF-A показал статистически значимое повышение данного фактора в обеих группах (табл. 6).

Таблица 6. Количество ЭПК и уровень VEGF-A до и после эндоваскулярных вмешательств в исследуемых группах

Дополнительные результаты исследования

Динамика ЭПК и качество контроля гликемии (уровня гликированного гемоглобина).

Пациенты с СД2 были разделены на 2 группы: группа 1 – с уровнем HbA1c<8% (17 человек), группа 2 – с уровнем HbA1c≥8% (22 человека). Пациенты обеих групп были сопоставимы по полу, возрасту, функции почек (табл. 7). У пациентов с HbA1c≥8% чаще диагностировалась диабетическая ретинопатия и отмечалась большая продолжительность заболевания.

Таблица 7. Характеристика пациентов с СД2

При анализе изменения количества ЭПК после эндоваскулярного вмешательства у больных СД2 с уровнем HbA1c<8% было получено статистически значимое повышение как CD34+VEGFR2+CD45-клеток, так и CD34+CD133+CD45-клеток. В то время как у пациентов с HbA1c≥8% достоверного повышения количества клеток не наблюдалось (табл. 8).

Таблица 8. Количество ЭПК в зависимости от гликемического контроля (уровня HbA1c)

Изменение количества ЭПК и длительность СД2.

Больные СД2 были разделены на 2 группы в зависимости от длительности заболевания. В группу 1 с длительностью СД2 до 10 лет включено 15 человек, в группу 2 с длительностью СД2 более 10 лет – 24. Обнаружено, что у больных с длительностью СД2 более 10 лет повышения количества клеток в ответ на вмешательство не наблюдалось. Вместе с тем, в группе 1 выявлено статистически значимое повышение клеток после вмешательства (табл. 9).

Таблица 9. Изменение количества ЭПК в зависимости от длительности СД2

Обсуждение

В настоящем исследовании было показано, что у пациентов с СД2 не наблюдалось повышения циркулирующих ЭПК после рентгенэндоваскулярных вмешательств. Патофизиологические процессы, инициируемые персистирующей гипергликемией, оказывают негативное влияние на все этапы жизни ЭПК. Оксидативный стресс, снижение биодоступности NO, воспаление нарушают мобилизацию, целенаправленную миграцию ЭПК в зону повреждения и ишемии. Кроме того, гипергликемия подавляет пролиферацию, дифференцировку и адгезию ЭПК [14, 15]. Вместе с тем, хроническая гипергликемия оказывает негативное влияние и на основной источник клеток – костный мозг (КМ). В то же время нельзя исключить, что одним из механизмов нарушения мобилизации ЭПК является развитие микроангиопатии и автономной нейропатии КМ [16]. Данные механизмы объясняют неадекватную мобилизацию ЭПК из КМ в присутствии высокого уровня VEGF у пациентов с СД2. В одной из ранних работ в России [11] изучалось количество циркулирующих ЭПК у больных ИБС с нарушением углеводного обмена. Выявлено, что наиболее значимое снижение прогениторных клеток наблюдается у пациентов со стабильной стенокардией и сопутствующим нарушением углеводного обмена, обнаружена отрицательная корреляция между количеством ЭПК и уровнем глюкозы крови.

В отечественной литературе имеется ряд исследований, посвященных влиянию рентгенэндоваскулярных вмешательств на количество циркулирующих клеток-предшественников. Так, в работе Выборова О.Н. [17] показано, что у больных со стабильной стенокардией количество CD34+клеток в периферической крови снижалось через сутки после коронарной ангиопластики со стентированием, а на 3–5-й день наблюдалось восстановление количества клеток-предшественников. Однако в данном исследовании СД являлся критерием исключения. В другом исследовании, посвященном изучению количества ЭПК (CD34+133+ и CD34+KDR+ клеток) до и после выполнения реваскуляризации миокарда или нижних конечностей, напротив, наблюдалось увеличение количества ЭПК через 6 месяцев после коронарной или периферической реваскуляризации. Так, после коронарной ангиопластики наблюдалось увеличение количества ЭПК вдвое, после реваскуляризации нижних конечностей количество ЭПК повышалось на 35–36% [18]. Вместе с тем, в данной работе также не изучалась динамика ЭПК у больных СД2. На сегодняшний день имеется несколько клинических исследований, посвященных изучению мобилизации ЭПК у больных СД2. В исследовании Lin Ling и соавт. [19] оценивали динамику циркулирующих ЭПК и факторов, стимулирующих мобилизацию ЭПК (VEGF и хемокинстромальный фактор-1 (SDF-1α)) у больных с острым инфарктом миокарда (ОИМ). В группе пациентов с СД2 отмечалось снижение мобилизации и снижение пикового повышения ЭПК по сравнению с пациентами без СД2, в то время как уровни VEGF и SDF-1α плазмы крови были выше в группе пациентов с СД2. В группе пациентов, не страдающих СД2, уровень циркулирующих ЭПК был повышен в 1-й день ОИМ, с последующим пиком на 5-й день и снижением в последующий период. У пациентов с СД2 аналогичная картина наблюдалась в 1-й день с повышением уровня ЭПК в последующем, однако пик повышения был выявлен на 7-й день. Кроме того, у больных СД2 наблюдалось снижение пика по сравнению с группой без СД2. В следующем исследовании также установлено снижение исходного количества клеток, задержка пикового повышения клеток у пациентов с СД2 по сравнению с лицами без нарушения углеводного обмена [20]. Однако в данных работах изучали динамику ЭПК у пациентов с ОИМ. В то время как в наше исследование были включены пациенты со стабильной стенокардией и КИНК, а пациенты с острым коронарным синдромом были исключены. В другом исследовании наблюдали динамику ЭПК при ОИМ в зависимости от интраоперационного контроля гликемии во время ЧКВ. Исследователи пришли к выводу, что интенсивный контроль гликемии во время проведения ЧКВ и в течение 24 ч после вмешательства повышает количество и способность ЭПК к дифференцировке, по сравнению с обычным контролем гликемии [21]. Полученные нами ранее результаты также показали нарушение мобилизации ЭПК после проведения эндоваскулярного лечения [22].

Кроме того, мы подтвердили предположение о влиянии длительно персистирующей гипергликемии (длительности заболевания) и неудовлетворительного гликемического контроля на мобилизацию ЭПК. В одном исследовании показана тесная взаимосвязь между гликемическим контролем и циркулирующими ЭПК: неудовлетворительный контроль гликемии ассоциировался с низким количеством циркулирующих ЭПК, в то время как при удовлетворительном контроле гликемии наблюдалось более высокое содержание количества циркулирующих ЭПК [23]. В исследовании Churdchomjan W. с соавт. продемонстрировано снижение количества циркулирующих ЭПК у больных СД2 с неудовлетворительным контролем гликемии (уровень HbA1c>7,0%) по сравнению с пациентами с удовлетворительным контролем гликемии (уровень HbA1c≤7,0%) [24]. В двух последующих работах исследователи наблюдали динамику ЭПК в зависимости от интенсивности гликемического контроля у больных СД2. Показано, что интенсивный гликемический контроль в течение 3 месяцев повышает количество и функциональную активность ЭПК [25, 26]. Одним из факторов, который, вероятно, влияет на мобилизацию ЭПК, является длительность заболевания. В нашем исследовании выявлена ассоциация динамики ЭПК с длительностью СД2. У пациентов с длительностью заболевания более 10 лет выявлено нарушение мобилизации ЭПК в ответ на вмешательство. В опубликованном ранее исследовании было обнаружено, что у пациентов с длительностью СД2 более 20 лет отмечалось наиболее низкое количество ЭПК по сравнению с пациентами с длительностью заболевания от 0 до 19 лет [27]. Таким образом, можно предположить, что на процесс мобилизации прогениторных клеток влияет не только наличие СД2, но и качество контроля гликемии и длительность заболевания.

На количество ЭПК могут оказывать влияние следующие классические сердечно-сосудистые факторы риска: дислипидемия, курение, ожирение [29]. Ранее указывалось, что группы были сопоставимы по ИМТ и показателям липидного профиля, в то время как количество курящих лиц преобладало в группе больных без СД2. Анализ количества ЭПК до и после реваскуляризации, в зависимости от статуса курения, показал отсутствие достоверных различий. Согласно некоторым данным, на количество ЭПК оказывают влияние и гендерные различия. Было показано, что у женщин количество и активность ЭПК выше, чем у мужчин [30]. В других же исследованиях не наблюдалось различий в количестве ЭПК между мужчинами и женщинами [31, 32]. Следует отметить, что женщины, включенные в данное исследование, находились в постменопаузе. Мы проанализировали динамику ЭПК в зависимости от пола, однако достоверных различий обнаружено не было.

Также изучалось влияние различных видов сахароснижающей терапии на количество ЭПК. В одном исследовании при добавлении инсулина гларгин или инсулина НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) к имеющейся пероральной сахароснижающей терапии наблюдалось увеличение количества ЭПК [33]. В другом исследовании изучали влияние метформина и препарата сульфонилмочевины (гликлазида) на количество ЭПК у больных с впервые выявленным СД2. На фоне монотерапии метформином наблюдалось увеличение количества ЭПК, однако комбинированная терапия метформином с гликлазидом была более эффективной в отношении увеличения количества ЭПК и улучшения их функции [34]. В следующей работе изучали влияние на количество ЭПК препарата из группы ингибиторов дипептидилпептидазы-4 (иДПП-4) ситаглиптина. У пациентов на терапии ситаглиптином наблюдалось увеличение количества ЭПК вдвое по сравнению с пациентами, находившимися на терапии глимепиридом, при этом в обеих группах был достигнут удовлетворительный гликемический контроль [35]. Похожие данные были получены у пациентов на терапии линаглиптином (иДПП-4) [36]. В нашем исследовании вид сахароснижающей терапии (инсулинотерапия или ПССП) не оказал достоверного влияния на количество ЭПК до и после эндоваскулярного вмешательства.

Ограничение исследования

Изученная нами выборка не является достаточно репрезентативной, поэтому полученные результаты не могут быть экстраполированы на всю популяцию больных СД2. В данной работе не изучались функциональные характеристики ЭПК. Отсутствие стандартизированной методики определения количества ЭПК также могло повлиять на результаты исследования.

Заключение

У пациентов с СД2 количество циркулирующих ЭПК не повышалось после рентгенэндоваскулярных вмешательств по сравнению с лицами без СД2. Одними из факторов, влияющих на мобилизацию ЭПК у больных СД2, являлись неудовлетворительный контроль гликемии и длительность заболевания.

Дополнительная информация

Финансирование работы

Финансирование исследования проводилась в рамках государственного задания Министерства здравоохранения РФ по теме НИР: «Молекулярно-генетические, биохимические и протеомные маркеры в прогнозировании развития сахарного диабета и его сосудистых осложнений, разработка перспективных методов лечения» NАААА-А16-116011310006-2.

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие двойственности (конфликта) интересов, связанных с публикацией данной рукописи.

Участие авторов

Дедов И.И., Калашников В.Ю, Смирнова О.М. – концепция и дизайн исследования, редактирование и окончательное утверждение статьи; Иванова О.Н., Степанова С.М., Ильин А.В. – выполнение лабораторных исследований, проверка и правка текста рукописи; Терехин С.А. – проведение рентгенэндоваскулярных вмешательств, проверка и правка рукописи; Мичурова М.С. – сбор клинического материала, статистическая обработка результатов исследования, интерпретация результатов, написание текста рукописи.