Роль метформина как донора оксида азота в регуляции углеводного обмена у пациентов с сахарным диабетом 2 типа

1998 г. лауреатами Нобелевской премии в области физиологии и медицины стали три американских ученых: Роберт Фарчготт (Robert F. Furchgott), Луис Игнарро (Louis J. Ignarro) и Ферид Мюрад (Ferid Murad). Премия вручена за открытие «Окиси азота как сигнальной молекулы в кардиоваскулярной системе». Факт образования газа в клетке, который, минуя мембраны, может управлять функциями других клеток, был признан неизвестным до той поры новым принципом передачи сигналов в организме. В последнее время оксиду азота (NO) отводится важная роль в регуляции метаболизма практически во всех органах и тканях, как в норме, так и при патологии. Согласно результатам исследований, NO положительно влияет на утилизацию глюкозы периферическими тканями и проведение сигнала инсулина [1]. В то же время до сих пор нет однозначного ответа: какие сигнальные пути вовлечены в проведение сигнала оксида азота вне эндотелиальных клеток сосудов. 

Как известно, время жизни NO составляет несколько секунд. Единственным ферментом, на который оксид азота влияет непосредственно, приводя к вазодилятации, является гуанилатциклаза эндотелия сосудов, производящая циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) [2]. На сегодняшний день сделано предположение и об аналогичной роли NO динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) в регуляции биологических процессов по причине их высокой стабильности. Данные структуры имеют формулу Fe(NO)2(L)2, где L – лиганд тиоловой природы (цистеин, глютатион или тиоловые группы белка). Лиганды нетиоловой природы – карбоксильная, нитрозильная или имино-группы также могут принимать участие в образовании ДНКЖ, но их стабильность существенно ниже. Увеличение образования динитрозильных комплексов железа наблюдается при возрастании продукции NO в макрофагах, эндотелиальных клетках, нейронах, β-клетках островков Лангенгарса и гепатоцитах [3]. Тиол-содержащие ДНКЖ (как в мономерной, так и димерной форме) положительно влияют на расслабление сосудов и обеспечивают длительное снижение артериального давления у человека. В настоящее время на модели раны крысы показано, что введение низкомолекулярных динитрозильных комплексов железа с тиоловыми лигандами оказывает ранозаживляющее действие у крыс с эндометриозом. Вводимые ДНКЖ в этом случае активируют апоптоз и полностью блокируют развитие эндометриозного процесса [4–6]. B. D'Autreaux с соавт. в своем исследовании в 2006 г. продемонстрировали роль ДНКЖ в нитрозативном стрессе [7]. 

Доноры NO положительно влияют на утилизацию глюкозы клетками организма. Так, растворимый донор NO – нитропруссид – оказывает стимулирующее действие на поглощение глюкозы мышцами у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2) [8]. В ряде проведенных исследований доказано, что L-аргинин, эндогенный источник NO, также может оказывать положительное влияние на уровень глюкозы при СД2 [9]. 

В консенсусе совета экспертов Российской ассоциации эндокринологов по инициации и интенсификации сахароснижающей терапии больных СД2 важная роль отводится метформину (Мф), как при монотерапии, так и в различных комбинациях с другими пероральными сахароснижающими препаратами (ПССП) и инсулином [10]. В работе В.А. Сереженкова и соавт. [11] в опытах in vivo на мышах с использованием спиновой ловушки для NO – диэтилдитиокарбамата (ДЭТК), после внутрибрюшинного введения Мф выявлено образование NO и ДНКЖ. Положительное влияние Мф на биодоступность NO показано и в клинических исследованиях. У пациентов, принимающих Мф в стандартной дозировке 1700 мг, выявляется статистически достоверное увеличение концентрации нитрита (прямого метаболита NO) в плазме и метгемоглобина (результат реакции NO и гемоглобина) в цельной крови наравне с улучшением показателей углеводного обмена [12].

Целью данной работы являлось оценить влияние биодоступности NO на параметры углеводного обмена у пациентов с СД2 на фоне терапии Мф и без применения препарата, а также доказать возможность получения дозозависимого образования NO при метаболизировании Мф в моделях in vivo.

Материалы и методы

В серии исследований in vivo беспородным мышам весом 20–23 г внутрибрюшинно вводился Мф фирмы Sigma (США). В основной серии опытов Мф вводили в дозе 0,5; 1,1; 5,6 мг на животное. Для улавливания NO в организме мышей использовали гидрофобные комплексы железа (Fe) с ДЭТК (Fe-(ДЭТК)2), образующие с NO ЭПР-регистрируемые парамагнитные мононитрозильные комплексы железа (МНКЖ-ДЭТК). ДЭТК и Fe вводили через 25 минут после инъекции метформина. Через 15 минут проводили декапитацию животного, извлекаемые ткани (печень и кишечник) весом 300 мг помещали в ампулы диаметром 4 мм и замораживали в жидком азоте для последующего анализа методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). В другой серии экспериментов in vivo Мф вводили внутрибрюшинно в тех же дозировках, но без введения животным Fe и ДЭТК. Данная серия экспериментов служила контролем, для уточнения возможных реакций NO с эндогенными источниками железа и тиолов. 

В клиническую часть исследования было включено 80 пациентов (63 женщин и 17 мужчины) в возрасте 54,5±5,7 лет с впервые установленным диагнозом СД2, не получавших терапию по поводу данного заболевания. После первичного обследования была сформирована основная группа – 54 пациента (43 женщины и 11 мужчин) и группа контроля  – 26 пациентов (20 женщин и 6 мужчин). Группа контроля была сформирована с учетом возможности наблюдения за пациентами без назначения пероральных сахароснижающих препаратов (ПССП). Гликированный гемоглобин (HbA1c)у пациентов группы контроля составил 6,6–7,0%. Основной группе, помимо рекомендаций по питанию и расширению физической активности, назначался Мф в дозе 1700 мг в сутки. HbA1c основной группы варьировал в пределах 6,6–8,0%. Период наблюдения за пациентами составил 15 недель. До начала основного периода наблюдения и в конце исследования всем пациентам проводилось антропометрические исследования (измерение индекса массы тела (ИМТ), окружности талии (ОТ)). У всех пациентов была взята кровь на HbA1c, общий холестерин, триглицериды, липопротеиды высокой плотности, также методом ЭПР исследовались уровень нитритов, метгемоглобина и нетрансферрин-связанного железа (НСЖ). К концу исследования в основной группе наблюдалось 48 пациентов (41 женщина и 7 мужчин), в контрольной – 17 (13 женщин и 4 мужчины). Всеми пациентами было подписано информированное согласие на участие в исследовании.

Результаты

В серии опытах in vivo в ткани тонкого кишечника и печени после введения Мф в дозе 0,5; 1,1 и 5,6 мг наблюдали накопление комплекса МНКЖ-ДЭТК, которые характеризуются g фактором, равным 2,035. Концентрация NO, включенного в эти комплексы, составила в кишечнике 0,4; 0,89; 17 мкмоль/л, в печени – 0,2; 2,9; 14,3 мкмоль/л соответственно (рис. 1).

При введении Мф опытным мышам без Fe и ДЭТК в ткани кишечника в спектре ЭПР наблюдали анизотропный сигнал ДНКЖ с gсреднее=2,03 (рис. 2).

До начала приема Мф у 84,3% пациентов основной группы НbА1с был выше 7,0%, у 15,7% параметр находился в диапазоне от 6,6% до 7,0%. В конце исследования у 68,5% больных уровень НbА1с регистрировался ниже 7,0%, у 31,5% превышал значение 7,0%, однако у всех наблюдаемых отмечалось снижение этого показателя. При измерении уровня нитрита методом ЭПР до момента назначения Мф получены низкие концентрации или полное отсутствие сигнала у некоторых пациентов (М=0,1 мкмоль/л). По истечении срока наблюдения в сыворотке пациентов было отмечено статистически значимое увеличение концентрации нитритов (0,1±0,19 мкмоль/л – изначально, 0,62±0,14 мкмоль/л – после), и незначительное увеличение метгемоглобина (0,98±0,26 – изначально, 2,22±0,69 мкмоль/л – после лечения) [12]. Стоит добавить, что после назначения Мф, помимо статистически значимого увеличения уровня нитрита в плазме и метгемоглобина в сыворотке, наравне с улучшением показателей углеводного обмена, выявлялись типичные ЭПР – спектры нетрансферрин-связанного железа (рис. 3). 

В группе контроля, несмотря на тенденцию к улучшению показателей углеводного обмена и снижению ИМТ, нами не было отмечено увеличения концентрации нитрита в плазме и метгемоглобина в сыворотке крови. На рис. 4 приведено сравнение уровня нитрита пациентов контрольной группы, HbA1c которых после 15-недельного наблюдения оставался в пределах 6,6–7,0%, а также пациентов основной группы, достигших показателей HbA1c в пределах 6,6–7,0% на фоне назначения Мф (n=14). 

Обсуждение

Изучение регуляции внутриклеточных систем, вовлеченных в процесс утилизации глюкозы в условиях инсулинорезистентности (ИР), является одной из ключевых задач, стоящих перед исследователями патогенеза СД2. Многофакторность патогенеза СД2 и его осложнений существенно ограничивает возможность ускоренной разработки и внедрения в клиническую практику новых безопасных групп сенситайзеров инсулина, способных эффективно конкурировать с уже имеющимися на мировом фармакологическом рынке препаратами. С другой стороны, расширение существующих групп препаратов за счет новых химических соединений, с учетом повышения их эффективности, снижения токсичности, разовой дозы, частоты приема поможет в дальнейшем расширить показания к их применению в ряде клинических ситуаций у пациентов с СД2.

Проведенное исследование показало, что особое внимание может быть сосредоточено вокруг доноров NO. Полученные результаты в биологической части исследования однозначно доказывают, что препарат первой линии в лечении СД2 – Мф является таким донором NO. Согласно общедоступным сведениям по фармакодинамике Мф, за весь период изучения и применения не был определен специфический рецептор препарата. Полученная нами линейная зависимость образования МНКЖ – ДЭТК в печени и кишечнике (рис. 5) в зависимости от дозы вводимого Мф, а также обнаружение динитрозильных комплексов железа (рис. 2) позволяют сделать вывод, что Мф – донор NO, действует не на конкретный рецептор, а через универсальный посредник – ДНКЖ, являющийся внутренним переносчиком эффектов NO. 

Доказательством служат результаты клинической части исследования, где показано увеличение концентрации показателей биодоступности NO наряду с улучшением параметров компенсации углеводного обмена у пациентов, находящихся на терапии Мф, и отсутствие такой динамики в группе пациентов с СД2, следующих только рекомендациям по рациональному питанию и расширению уровня физической активности (нефармакологическая терапия). Появление сигнала нетрансферрин-связанного железа интерпретируется как наличие в системе достаточных эквивалентов окислительного стресса, способных поддерживать образование свободных радикалов при СД2. 

Принимая во внимание результаты проведенных исследований, в будущем возможен пересмотр классификации препаратов из группы сенситайзеров и выделение отдельной группы ПССП, объединенной эффектом увеличения биодоступности NO у больных СД2.

Авторы декларируют отсутствие конфликта (двойственности) интересов при написании данной статьи.