Патогенетическое значение однонуклеотидных полиморфизмов гена рецептора к глюкозозависимому инсулинотропному полипептиду в развитии нарушений углеводного обмена при ожирении

Абдоминальное ожирение (АО) и сахарный диабет 2 типа (СД2) занимают лидирующие позиции среди распространенности хронических заболеваний [1]. Известно, что отягощенная наследственность является основным фактором риска развития СД2 [2]. Выявление пациентов с предрасположенностью к АО и СД2 имеет большую клиническую значимость, поскольку эти заболевания могут быть обратимыми, и при своевременном лечении можно добиться исчезновения или уменьшения выраженности основных проявлений.

На продукцию инсулина, помимо постпрандиальной стимуляции глюкозой, влияют гормоны желудочно-кишечного тракта – инкретины [3]. Глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (GIP), одной из основных функций которого является стимуляция секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы в ответ на пероральное поступление жиров и углеводов, секретируется К-клетками тонкого кишечника, преимущественно в двенадцатиперстной и тощей кишке [4].

Эффекты инкретина реализуются путем активации G-зависимого рецептора инкретина (GIPR) [4], присутствующего в большинстве тканей человека [5], в том числе поджелудочной железе и эпителии кишечника. Согласно данным научной периодики, у пациентов с СД2 снижается секреция инсулина, стимулированная питательными веществами [6]. Многочисленные исследования направлены на изучение причин нарушения секреции инкретинов или снижения чувствительности рецепторов к ним при нарушениях углеводного обмена [7]. Так, доклинические исследования показали, что снижение ответа на терапию GIP может быть вызвано пониженной экспрессией или дефектами его рецептора [8]. В связи с вышесказанным, в фокус нашего внимания попали однонуклеотидные полиморфизмы гена GIPR, локализованные в интронном участке (rs2302382 в интроне 1) и в области предполагаемого промотора – 5’-нетранслируемой области (5’-UTR rs8111428) [9], которые в значительной степени могут влиять на активность этого гена.

Цель

Таким образом, целью исследования явился поиск ассоциаций полиморфизмов rs2302382 и rs8111428 гена GIPR с повышенным риском развития СД2 при ожирении, а также оценка взаимосвязи вариантов генотипов изучаемых полиморфизмов с сывороточными уровнями инсулина и С-пептида у больных ожирением в славянской популяции Калининградской области, в зависимости от состояния углеводного обмена.

Материалы и методы

В исследование были включены 163 пациента (61 мужчина, 102 женщины) с ожирением алиментарно-конституционального характера с абдоминальным типом локализации. Пациенты были разделены на две исследуемые группы: группа 1 – 72 пациента с АО (индекс массы тела (ИМТ) 43,70±9,32 кг/м2, возраст 46,5±10,1 лет, 29 мужчин, 43 женщины), страдающие СД2; группа 2 – 91 пациент с АО (ИМТ 36,13±6,72 кг/м2, 43,93±8,35 лет, 32 мужчины, 59 женщин) без СД2. Наличие СД2 и АО устанавливалось на основании детального клинико-инструментального обследования в условиях специализированного стационара, руководствуясь критериями диагностики сахарного диабета и других типов гипергликемии Всемирной организации здравоохранения (1999–2013) [10].

В контрольную группу были включены 109 условно здоровых добровольцев с нормальными антропометрическими и биохимическими показателями (ИМТ 22,6±2,7 кг/м2, 39,5±7,6 лет, из них 66 мужчин и 43 женщины). Все группы обследованных лиц были сопоставимы по возрастным и гендерным характеристикам и принадлежали к группе славянских популяций. Со всеми пациентами было подписано добровольное информированное согласие на исследование. Разрешение на проведение исследования получено в локальном этическом комитете (протокол №4 заседания Локального этического комитета Инновационного парка БФУ им. И. Канта от 23 октября 2013 года).

Материалом для исследования служила венозная кровь, из которой были выделены образцы геномной ДНК с использованием коммерческих наборов «ДНК-Экстран-1» согласно протоколу производителя (ЗАО «Синтол»). Генотипирование проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием амплификатора LightCycler 480 Instrument II («Roche», Швейцария) и наборов для определения полиморфизмов rs2302382 и rs8111428 гена GIPR (ЗАО «Синтол»). Протокол ПЦР состоял из следующих этапов: нагрев реакционной смеси при 95°С – 3 мин и амплификация в течение 40 циклов в следующем режиме: 95°С – 15 сек, 63°С – 40 сек.

Биохимические показатели (сывороточные уровни глюкозы, общего холестерина, триглицеридов, липопротеинов высокой и низкой плотности (ЛПВП, ЛПНП)) определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Furuno СА-180 («Furuno Electric Company», Япония) с использованием тест-систем DiaSys («DiaSys Diagnostic Systems», Германия).

Для оценки инсулинорезистентности рассчитывали индекс HOMA-IR по формуле: НОМА-IR = (Инс х Гл)/22,5, где Инс – инсулин (мкЕд/мл); Гл – глюкоза сыворотки натощак (ммоль/л). Сывороточные уровни инсулина и С-пептида определяли методом иммуноферментного анализа на автоматическом анализаторе Lazurite при помощи тест-систем DRG® Insulin ELISA (EIA-2935) и DRG® C-Peptide ELISA (EIA-1293).

Статистическая обработка полученных результатов была осуществлена с помощью программы Statistica 10. Проверку на соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга, а также сравнение частот аллелей и генотипов в выборках проводили с применением критерия χ2, принимая уровень статистической значимости за 95% (р<0,05). Об ассоциации аллелей или генотипов (частоты которых в группах обследуемых достоверно отличались) с риском развития СД2 судили по величине отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Значения OR рассчитывали с помощью программы «Калькулятор для расчета отношения шансов» (http://gen-exp.ru/calculator_or.php). Ассоциация с высоким риском определялась, если значение OR было больше (>) 1, соответственно, при величине OR меньше (<1) аллель или генотип был ассоциирован с низким риском развития СД2 при АО.

Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между независимыми выборками применяли ранговый критерий Манна-Уитни. Наличие связи между изучаемыми показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждения

Для детальной характеристики пациентов, включенных в исследование, были исследованы биохимические показатели углеводного и липидного обменов (табл. 1). Отмечен ожидаемо высокий уровень глюкозы в группе пациентов с АО, страдающих СД2. Следует отметить, что показатели липидного обмена не выходили за пределы референсных значений в обеих группах с АО.

Таблица 1. Основные биохимические показатели исследуемых групп, Mе (Q1–Q3)

Примечание: * – p<0,05, ** – p<0,001, значимость определена при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни для двух несвязанных выборок

При исследовании однонуклеотидного полиморфизма rs2302382 гена GIPR было установлено, что распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди–Вайнберга: в контрольной группе (χ2=2,51, p=0,11), больных АО с СД2 (χ2=3,45, p=0,06) и группе пациентов с АО без СД2 (χ2=4,21, p=0,06). Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма rs2302382 гена GIPR представлено в табл. 2.

Таблица 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма rs2302382 гена GIPR в исследуемых группах

Примечание: * – p<0,05. При исследовании полиморфизма rs8111428 гена GIPR распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди–Вайнберга во всех группах обследуемых: здоровые добровольцы (χ2=2,36, p=0,07), больные АО с СД2 (χ2=0,01, p=0,96) и пациенты с АО без СД (χ2=0,48, p=0,49).

Сравнительный анализ распределений частот аллелей и генотипов больных АО с СД2 и группы здоровых добровольцев показал ассоциацию генотипа АА полиморфизма rs2302382 гена GIPR с повышенным риском развития СД2 при АО (OR=3,03, 95% CI: 0,73–12,51, p=0,049). Vogel C. и соавт. (2009) была выявлена взаимосвязь между полиморфизмом rs2302382 гена GIPR с ожирением, тогда как другие исследователи эту ассоциацию не обнаружили [12]. Учитывая противоречивые данные научной периодики, нами было оценено распределение частот аллелей и генотипов в группе пациентов с АО без нарушений углеводного обмена. Выявлено, что генотип СА встречался чаще у пациентов с АО без СД2 и в контроле по сравнению с группой больных АО, страдающих СД2. Установлена взаимосвязь генотипа СА полиморфизма rs2302382 гена GIPR с пониженным риском развития СД2 при АО (OR=0,54, 95%CI: 0,29–1,02, p=0,049).

При исследовании полиморфизма rs8111428 гена GIPR распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди–Вайнберга во всех группах обследуемых: здоровые добровольцы (χ2=2,36, p=0,07), больные АО с СД 2 (χ2=0,01, p=0,96) и пациенты с АО без СД (χ2=0,48, p=0,49). Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма rs8111428 гена GIPR представлены в табл. 3.

Таблица 3. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма rs8111428 гена GIPR в исследуемых группах

Примечание: * – p<0,05

Как уже упоминалось, основная роль GIP заключается в глюкозозависимой стимуляции продукции инсулина [6]. Кроме того, GIP обладает способностью регулировать секреторную активность β-клеток натощак [15]. Доказано, что снижение «инкретинового эффекта» является ранней характеристикой СД2 [6]. Исследованиями многих авторов выявлена значительная лиганднезависимая или базальная активность рецептора GIPR, что может играть важную роль в регуляции уровня глюкозы в крови [13–16]. Предполагают, что о функциональной роли GIPR можно судить не только по постпрандиальной секреции гормонов поджелудочной железы (инсулина и С-пептида), а также и по их уровням натощак, что косвенно может отражать базальную активность GIPR [13, 14, 15]. Физиологическое значение такой конститутивной активности рецептора не совсем понятно, однако известно, что полиморфные варианты GIPR могут способствовать изменению его базальной активности [17]. В частности, установлено влияние полиморфизмов гена GIPR на изменение уровня С-пептида в сыворотке крови, что предполагает важную роль конститутивной активности GIPR в регуляции показателей углеводного обмена [15].

В связи с этим, на следующем этапе исследования мы предприняли попытку выявить взаимосвязь между полиморфными вариантами гена GIPR (rs2302382 и rs8111428) с содержанием гормонов поджелудочной железы – С-пептида и инсулина у больных ожирением, в зависимости от наличия/отсутствия СД2. Результаты оценки содержания гормонов поджелудочной железы: С-пептида и инсулина в сыворотке крови больных ожирением представлены в табл.4.

Таблица 4. Содержание гормонов поджелудочной железы: С-пептида и инсулина в сыворотке крови больных ожирением, Mе (Q1-Q3)

Примечание: *- p<0,05, ** - p<0,001, значимость определена при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни для двух несвязанных выборок

Нами обнаружено повышение сывороточного содержания С-пептида у носителей генотипа СА полиморфизма rs2302382 гена GIPR по сравнению с аналогичными показателями носителей генотипа СС (как у пациентов с АО с СД2, так и без него) (р<0,05) (табл. 5). Контрольная группа была однородной по исследуемому показателю, вне зависимости от варианта генотипа полиморфизма rs2302382 гена GIPR.

Таблица 5. Сывороточный уровень С-пептида в зависимости от генотипа полиморфизма rs2302382 гена GIPR у больных ожирением, Mе (Q1-Q3)

Примечание: *- p<0,05, значимость определена при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни для двух несвязанных выборок

При анализе сывороточного уровня инсулина, в зависимости от варианта генотипа полиморфизма rs2302382 гена GIPR, оказалось, что уровень инсулина в группе пациентов с АО с СД2, имеющих генотип СА, превышал таковой у пациентов, имеющих генотип СС (табл. 6).

Таблица 6. Сывороточный уровень инсулина в зависимости от генотипа полиморфизма rs2302382 гена GIPR у больных ожирением, Mе (Q1-Q3)

Примечание: *- p<0,05, значимость определена при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни для двух несвязанных выборок

Аналогичная статистика прослеживалась для группы больных АО без СД2: уровень инсулина был значимо выше у лиц, являющихся носителями генотипа СА полиморфизма rs2302382 гена GIPR, по сравнению с носителями генотипа СС (см. табл. 6).

Сывороточное содержание С-пептида и инсулина во всех группах обследуемых лиц, ранжированных по вариантам генотипов полиморфизма rs8111428 гена GIPR, было сопоставимым (табл. 7, 8).

Таблица 7. Сывороточный уровень С-пептида в зависимости от генотипа полиморфизма rs8111428 гена GIPR у больных ожирением, Mе (Q1-Q3)

Примечание: *- p<0,05, значимость определена при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни для двух несвязанных выборок

Таблица 8. Сывороточный уровень инсулина в зависимости от генотипа полиморфизма rs8111428 гена GIPR у больных ожирением, Mе (Q1-Q3)

Примечание: *- p<0,05, значимость определена при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни для двух несвязанных выборок

Таким образом, нами установлена ассоциация генотипа АА однонуклеотидного полиморфизма rs2302382 гена GIPR с повышенным риском развития СД2 при АО, генотипа СА – с пониженным. У всех обследованных лиц с АО, являющихся носителями генотипа СА полиморфизма rs2302382 гена GIPR, наблюдалось повышение сывороточных уровней гормонов поджелудочной железы – инсулина и С-пептида.

Принимая во внимание выявленную ассоциацию этого же генотипа с пониженным риска развития СД2 при АО, мы можем предположить, что полиморфизм rs2302382 гена GIPR оказывает воздействие на передачу сигнала, опосредованного инкретином. Поскольку полиморфизм rs2302382 гена GIPR находится в первом интроне в предполагаемой регуляторной области [9], можно предположить, что ассоциированные генотипы оказывают свое влияние на секрецию инсулина через регуляцию транскрипции гена инкретинового рецептора – GIPR.

Заключение

1. Генотип АА полиморфизма rs2302382 гена GIPR ассоциирован с повышенным риском развития СД2 при абдоминальном ожирении, тогда как генотип СА – с пониженным.
2. Сывороточные уровни инсулина и С-пептида повышены у пациентов с абдоминальным ожирением, имеющих генотип СА полиморфизма rs2302382 гена GIPR, по сравнению с лицами, являющимися носителями других генотипов.
3. У всех групп обследованных лиц ассоциаций полиморфизма rs8111428 гена GIPR с повышенным риском развития СД2 при ожирении не установлено; выявлено также отсутствие ассоциаций вариантов генотипов полиморфизма rs8111428 гена GIPR с сывороточными уровнями инсулина и С-пептида.

Дополнительная информация

Финансирование исследование

Исследование выполнено в рамках субсидии на выполнение государственной работы «Организация проведения научных исследований» (№603), стипендии Президента РФ (СП-2254.2015.4) и программы «УМНИК» (№2919ГУ1/2014 код 0005018).

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие двойственности (конфликта) интересов, связанных с рукописью.

Информация о вкладе каждого автора

Скуратовская Д.А. – анализ полученных данных, написание текста, обработка материалов, генотипирование методом ПЦР, статистическая обработка полученных результатов; Василенко М.А. – формирование баз данных пациентов, анализ антропометрических показателей; Фаттахов Н.С. – анализ биохимических показателей пациентов; Кириенкова Е.В. – анализ полученных данных, постановка иммуноферментного анализа; Миронюк Н.И. – включение и исключение пациентов, вошедших в исследование, диагностирование наличия сахарного диабета 2 типа; Затолокин П.А. – сбор биоматериала в ходе плановых лапароскопических операций; Литвинова Л.С. – анализ полученных данных, написание текста.