Изучение ассоциаций полиморфных маркеров генов факторов некроза опухоли и их рецепторов rs1800629 TNFa, rs909253 Lta, rs767455 TNFR1, rs1061624 TNFR2 с формированием сахарного диабета 2 типа

Cахарный диабет 2 типа (СД2) – самое распространенное эндокринное заболевание, которое представляет собой одну из острейших медико-социальных проблем, так как ведет к ранней инвалидизации и повышению смертности среди населения вследствие развития различных осложнений [1]. В настоящее время более 415 млн человек в возрасте от 20 до 79 лет в мире страдают СД, в 90% случаев это СД2. В России более 4 млн человек больны СД, из них 3,7 млн – СД2 [2]. По частоте инвалидизации и смертности СД стоит на 3-м месте после сердечно-сосудистых заболеваний и онкопатологии. Между тем, результаты контрольно-эпидемиологических исследований, проведенных ФГБУ «Эндокринологический научный центр» (ЭНЦ) МЗ РФ в период с 2002 по 2010 гг., показали, что истинная численность больных СД в России приблизительно в 3–4 раза больше официально зарегистрированной и достигает 9–10 млн человек, что составляет около 7% населения [3].

СД2 относят к мультифакториальным заболеваниям. Согласно литературным данным, роль генетических факторов в развитии СД2 составляет 15–50% [4]. Научные исследования последних лет показали, что важное значение в развитии СД2 играют цитокины, которые способствуют развитию инсулинорезистентности, причем одними из ключевых медиаторов ее развития являются факторы некроза опухоли [5]. Обладая множеством медико-биологических эффектов (оказывают иммуномодулирующее, цитотоксическое и провоспалительное действие, стимулируют липолиз, активируют систему гемостаза, индуцируют апоптоз и др.), факторы некроза опухоли (фактор некроза опухоли-α (TNFα), лимфотоксин-α (Ltα)) могут влиять на развитие и прогрессирование СД2 [6].

Так, гиперпродукция TNFα приводит к снижению чувствительности к действию инсулина и, как следствие, изменению метаболизма глюкозы в жировой, мышечной тканях и печени. Также установлено, что при наличии ожирения и инсулинорезистентности TNFα, синтезируемый в жировой и мышечной ткани, обнаруживается в больших количествах и обладает возможностью проявлять пара- и аутокринные свойства [7]. Ltα является хемоаттрактантом для нейтрофилов, стимулирует в них образование пероксид-ионов, усиливает фагоцитоз и адгезию к эндотелию, стимулирует активность фибробластов, а также провоцирует выработку стресс-гормонов, влияет на метаболизм глюкозы [8]. Свои медико-биологические эффекты факторы некроза опухоли (TNFα, Ltα) реализуют через специфические рецепторы 1-го и 2-го типа (TNFR1 и TNFR2 соответственно). TNFR1 несет ответственность за острый воспалительный ответ и экспрессируется в большинстве типов клеток. TNFR2 участвует главным образом в реализации метаболических эффектов факторов некроза опухолей, а именно регулирует жировой и углеводный обмен. Таким образом, факторы некроза опухоли через свои рецепторы могут влиять на развитие и прогрессирование СД2.

С молекулярно-генетических позиций СД2 изучается достаточно активно как за рубежом, так и в Российской Федерации [9]. Однако результаты работ, посвященных изучению связей генов-кандидатов факторов некроза опухоли и их рецепторов с развитием СД2, неоднозначны в разных популяциях. Так, например, показано, что аллель А rs1800629TNFα является фактором риска формирования СД2 в иранской (OR=2,34) [10], индийской (OR=3,21) [11] и бразильской (OR=1,82) [12] популяциях. Среди населения Хорватии и Венгрии данных ассоциаций выявлено не было [13], а в популяции Мексики установлено, что фактором риска развития СД2 является генотип GGrs1800629 TNFα (OR=3,64) [14].

Роль полиморфных маркеров генов факторов некроза опухоли и их рецепторов в отношении СД2 в нашей стране изучена недостаточно, что диктует необходимость проведения данных исследований в различных популяциях Российской Федерации.

Цель

Целью настоящей работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров факторов некроза опухоли и их рецепторов (rs1800629 TNFα, rs909253 Ltα, rs767455 TNFR1, rs1061624 TNFR2) с формированием СД2 среди населения Центрального Черноземья РФ.

Материалы и методы

Проведен анализ результатов наблюдений 544 человек: 236 пациентов с установленным диагнозом СД2 и 308 человек контрольной группы. В выборки больных СД2 и контроля включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Диагноз СД2 устанавливался после детального клинического, лабораторного обследования пациентов в отделении эндокринологии Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа на основании критериев Комитета экспертов ВОЗ (1999) и Федеральной целевой программы «Сахарный диабет» (2002). В группу контроля включались индивидуумы без наличия СД2. Все пациенты подписали информированное согласие на проведение исследования.

Исследуемые группы были сопоставимы по основным биологическим показателям: полу, возрасту и индексу массы тела (табл. 1).

Таблица 1. Медико-биологические и клинико-лабораторные характеристики исследуемых групп, х±SD

Примечание: х – среднее, SD – стандартное квадратичное отклонение

Материалом для молекулярно-генетического исследования послужила венозная кровь в объеме 8–9 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Выделение геномной ДНК из периферической крови проведено методом фенольно-хлороформной экстракции.

Анализ всех локусов (rs1800629 TNFα, rs909253 Ltα, rs767455 TNFR1, rs1061624 TNFR2) осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторе IQ5 производства компании Bio-Rad с использованием ДНК-полимеразы Thermusaquaticus производства фирмы «Силекс-М», г. Москва и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» г. Москва (табл. 2). Генотипирование осуществлялось методом дискриминации аллелей с использованием TaqMan зондов. Обозначения полиморфных маркеров даны в соответствии с базой данных dbSNP.

Таблица 2. Условия амплификации, последовательности праймеров и флуоресцентных зондов

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы STATISTICA 6.0. Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами. Для оценки соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использовали критерий χ2.

Статистический анализ распределения частот генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (χ2) с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI). При сравнительном анализе качественных показателей, характеризующих больных СД2 и контрольную группу, использовали непараметрическую статистику (критерий Манна-Уитни) [15].

Этическая экспертиза

По результатам рассмотрения протокола исследования этическим комитетом Белгородского государственного университета решено «Разрешить проведение исследования «Клинико-генетическое исследование больных сахарным диабетом 2 типа»» (Белоусова О.Н., кафедра медико-биологических дисциплин), протокол №3 от 14.05.2009.

Результаты и обсуждение

Изучение частот генотипов изучаемых генетических маркеров показало, что для всех рассмотренных локусов в контрольной выборке и в группе больных СД2 эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (p>0,05), а наблюдаемая гетерозиготность (Н0) не отличается от ожидаемой гетерозиготности (НЕ) (р>0,05).

Анализ методом «случай-контроль» (больные СД2 – здоровые лица) показал наличие статистически значимой ассоциации полиморфного маркера rs909253Ltα с развитием СД2: генотип GG повышает риск развития СД2 (OR=2,36, р=0,01) (табл. 3).

Таблица 3. Распределение полиморфных маркеров генов факторов некроза опухоли и их рецепторов у больных СД2 и в контрольной группе

Примечание: H0 и HE – наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность

Следует отметить, что полученные нами данные соответствуют литературным материалам о биологическом значении Ltα в организме. Так, согласно работе Brian E. C. (2009), он обладает выраженным провоспалительным, цитотоксическим, иммуномодулирующим действиями, и именно эти механизмы его действия имеют одно из важных значений в этиопатогенезе СД2 [16]. При этом следует подчеркнуть, что генотип GG rs909253Ltα контролирует повышенную продукцию Ltα. Поэтому у индивидуумов с данным маркером мы можем ожидать и более выраженные этио патогенетические эффекты Ltα [17]. Следует отметить, что нами впервые установлено важное значение локуса rs909253 Ltα при СД2 среди населения России.

По другим исследуемым генетическим полиморфизмам достоверных различий в частотах аллелей и генотипов не обнаружено (p>0,05).

При анализе возраста манифестации СД2 установлено, что индивидуумы с генотипом AArs767455TNFR1 имеют более ранний возраст манифестации СД2 (х±SD=47,01±0,92) по сравнению с больными с генетическими вариантами AG и GGrs767455TNFR1 (х±SD=48,99±0,72, р=0,01) (табл. 4).

Таблица 4. Медико-биологические и клинические характеристики больных СД2 в зависимости от генотипов локуса rs767455TNFR1, х±SD

Примечание: х – среднее, SD – стандартное квадратичное отклонение

Полученные данные свидетельствуют о значимом влиянии rs767455TNFR1 на возраст манифестации СД2. Согласно литературным данным [18], рецептор фактора некроза опухолей 1-го типа (TNFR1) опосредует все виды действия факторов некроза опухолей, тем самым участвуя в реализации широкого спектра биологических процессов в организме (митогенные факторы в апоптозе адипоцитов, стимуляция секреции лептина и регуляция функции митохондрий, участие в регуляции обмена углеводов и жиров, индукция инсулинорезистентности в жировой ткани и мышцах, подавление секреции инсулина β-клетками островков поджелудочной железы), имеющих важное значение в этиопатогенезе СД2 [19]. Как свидетельствуют данные литературы, генотип АА rs767455TNFR1 связан с усилением экспрессии рецептора фактора некроза опухолей 1-го типа [20], что может обуславливать ранний возраст манифестации СД2.

Заключение

Таким образом, резюмируя полученные в настоящей работе данные, следует отметить, что впервые продемонстрировано важное значение полиморфных маркеров генов Ltα (rs909253Ltα) и рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (rs 767455 TNFR1) в формировании СД2 на выборке из русских жителей Центрального Черноземья России. Генотип GG rs909253Ltα является фактором риска развития СД2 (OR=2,36), индивидуумы с генотипом AA rs767455TNFR1 имеют более ранний возраст манифестации СД2 по сравнению с больными, имеющими генетические варианты AG и GGrs767455TNFR1 (р=0,01).

Дополнительная информация

Финансирование исследования

Финансирование исследования осуществлялось за счет Стипендии Президента РФ.

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов

Чурносов М.И. – концепция и дизайн исследования, написание текста; Белоусова О.Н. – сбор и обработка материала, написание текста; Сиротина С.С. – анализ полученных данных, написание текста.