Ассоциация полиморфизма rs7903146 гена TCF7L2 с низкими концентрациями аутоантител при латентном аутоиммунном диабете взрослых (LADA)

Ведение

Латентный аутоиммунный диабет взрослых (LADA) – медленно-прогрессирующее аутоиммунное заболевание [1], характеризующееся наличием аутоантител к компонентам островковых клеток и вместе с тем клинической картиной сахарного диабета 2 типа (СД2) в дебюте. Рядом авторов было выдвинуто предположение о том, что пациенты с LADA – гетерогенная популяция, в которой выделяются подгруппы с преобладанием признаков СД 1 типа (СД1) и с преобладанием признаков СД2. Данное деление также производится на основе количества и концентрации антител. Пациенты с LADA с высокой концентрацией антител имеют фенотип, схожий с пациентами с СД1: молодой возраст на момент начала заболевания, низкий уровень С-пептида натощак, что является признаком снижения функции поджелудочной железы и высокой вероятности последующей потребности в экзогенном инсулине, редко – признаки метаболического синдрома, а также наличие вариантов гаплотипов и генотипов HLA, высокоассоциированных с развитием СД1. Другая подгруппа LADA с низкой концентрацией аутоантител фенотипически больше напоминает пациентов с СД2 – старше возраст дебюта, повышенный индекс массы тела (ИМТ), дислипидемия, отсутствие высокопредрасполагающих генотипов HLA. В нескольких исследованиях были сделаны попытки выявить гетерогенность LADA, исследуя иммунные и генетические маркеры. Одним из изучаемых генов является ген TCF7L2 – ген транскрипционного фактора 7, подобного 2-му [2, 3]. Этот генетический маркер, как показано во многих исследованиях, ассоциирован с СД2 и не встречается при классическом СД1.

Ген TCF7L2 расположен в области 10q25.3. TCF7L2 является составной частью Wnt-сигнального пути [4]. С помощью этого сигнального механизма регулируются процессы развития, функциональной активности β-клеток. TCF7L2 может оказывать влияние на пролиферацию и дифференцировку β-клеток. Была продемонстрирована выраженная ассоциация полиморфизмов гена TCF7L2 – rs12255372 и rs7903146 с развитием СД2 [5, 6, 7], что не было отмечено при СД1 [8, 9].

Выполнен ряд работ по изучению ассоциации полиморфизма rs7903146 гена TCF7L2 с развитием LADA, при этом в литературе представлены противоречивые данные. В некоторых исследованиях продемонстрировано повышение у пациентов с LADA частот аллеля и генотипов полиморфизма rs7903146 гена TCF7L2, ассоциированных с СД2 [10-14]. Но в одном исследовании повышения частот аллелей и генотипов гена TCF7L2, ассоциированных с СД2, у пациентов с LADA обнаружено не было [15].

В нашем исследовании мы изучали возможную ассоциацию полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 с развитием LADA-диабета в русской популяции.

Цель

Определить в выборках больных LADA и здоровых индивидов частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2, а также провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов в выборках, изучить ассоциацию с развитием болезни.

Материалы и методы

Обследовано 96 пациентов (46 женщин и 50 мужчин) с различной длительностью LADA-диабета (от 1 месяца до 5 лет). Диагноз латентного аутоиммунного диабета взрослых устанавливался пациентам с дебютом заболевания в возрасте старше 30 лет, постепенным началом, наличием, по крайней мере, одного положительного ауто­анти­тела, ассоциированного с СД, отсутствием кетонурии, нормальными значениями базальной концентрации С-пептида.

У всех обследуемых пациентов были выявлены положительные аутоантитела. Контрольную группу составили практически здоровые лица (201 человек), сопоставимые по возрасту и полу с исследуемой группой пациентов. Медиана возраста пациентов на момент постановки диагноза составила 34 года [31,0; 42,0]. Критериями включения в контрольную группу были: данные об отсутствии нарушений углеводного обмена, отсутствие отягощенной наследственности по аутоиммунным заболеваниям. Выборка была этнически однородна.

Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «Эндокринологический научный центр» (протокол №17 от 24.10.2012). Все пациенты добровольно подписали информированное согласие на участие в исследовании..

Всем пациентам и здоровым лицам из группы контроля проведено типирование полиморфизма гена TCF7L2 rs7903146; методом случай-контроль выполнено исследование ассоциации rs7903146с заболеванием LADA. Наличие аллеля Т в генотипе обозначается в статье как Т+ (носитель аллеля).

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью Wizard Genomic DNA (Promega Inc., USA). Концентрацию ДНК определяли с помощью BioPhotometr (Eppendorf AG, Germany). Типирование rs7903146 проводили, используя TaqMan® SNP GenotypingAssay (ThermoFisherScientific, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Иммунологическое исследование включало определение аутоантител к цитоплазматическим структурам β-клеток (ICA), к глутаматдекарбоксилазе (GADA), к тирозинфосфатазе (IA-2A), к транспортеру цинка – Т8 (ZnT8). Количественное определение антител осуществляли твердофазным иммуноферментным методом ELISA (Medizym anti-IA2, Medipan; Isletest-GAD ELISA, Biomerica; Isletest – ICA ELISA, Biomerica; Medizym anti-ZnT8, Medipan).

Группа LADA была разделена на 2 подгруппы по концентрации аутоантител, ассоциированных с СД. Значения GADA, ICA, IA-2A выше 20 Ед/мл расценивались как высокие [16, 17]. Значения антител ZnT8 выше 30 Ед/мл (двукратное превышение референсных значений) расценивались как высокие.

Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием прикладных программ STATISTICA (StatSoftInc. США, версия 8.0). Описательные статистические данные представлены в виде: медианы и интерквартильного интервала Me [25; 75] и массовой доли %. Сравнение групп по количественным признакам осуществлялось непараметрическим методом по U-критерию Манна-Уитни. Сравнение групп по качественным признакам осуществлялось непараметрическим методом с помощью таблиц сопряженности с использованием точного двустороннего критерия Фишера или критерия χ2.

Нулевой гипотезой считается предположение об отсутствии различий между группами. Распределение частот генотипов проверяли на соответствие равновесию Харди–Вайнберга. Степень ассоциации оценивали с помощью показателя соотношения шансов (odds ratio). ОR вычисляли с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях "случай-контроль"»[18]. Достоверными считали различия при р<0,05. Определяли доверительный интервал для ОR (CI (95%)).

Результаты и обсуждение

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 в группах LADA и здорового контроля статистически достоверных различий обнаружено не было (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 у пациентов с LADA и в контрольной группе

Стратификация группы LADА на две подгруппы позволила выявить значимые различия. 35 человек с LADA-диабетом имели низкие концентрации одного или нескольких аутоантител (АТ), 61 – высокие концентрации.

В группе LADА с низкими концентрациями АТ по сравнению с группой LADA с высокими концентрациями аллель Т (р=0,03; OR=1,99; CI (95%)=1,07–3,71) и генотип Т+ (р=0,04; OR=2,41; CI (95%)=1,02–5,71) встречались чаще. Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 у пациентов c LADA с низкими и высокими концентрациями аутоантител, ассоциированными с развитием аутоиммунного СД

*LADA-низкие АТ – наличие у пациента низких концентраций одного или нескольких аутоантител; ** LADA- высокие АТ – наличие у пациента высоких концентраций аутоантител, ассоциированных с СД

При анализе распределения частот аллелей и генотипов rs7903146 гена TCF7L2 в группах LADA с низкими концентрациями АТ и здорового контроля аллель Т и генотип Т+ (р=0,02; OR=1,85; CI (95%)=1,10–3,13 и р=0,04; OR=2,14; CI (95%)=1,01–4,53 для Т-аллеля и Т+генотипа соответственно) также чаще встречались в группе LADA с низкими концентрациями АТ. Данные представлены в табл. 3.

Таблица 3

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 у пациентов c LADA с низкими концентрациями аутоантител, ассоциированными с развитием аутоиммунного СД, и в контрольной группе

*LADA-низкие АТ – наличие у пациента низких концентраций одного или нескольких аутоантител

Распределение частот аллелей и генотипов rs7903146 TCF7L2 в группе LADA с высокими концентрациями АТ и группе контроля значимо не отличались (р=0,76 для аллелей и р=0,9 для генотипов).

Таким образом, установлена ассоциация аллеля Т и генотипа Т+ с LADA-диабетом с низкими концентрациями АТ.

Обсуждение

СД1 и СД2 являются заболеваниями с полигенным наследованием. Наибольшее значение из известных генетических маркеров СД1 имеют гены, расположенные в области главного комплекса гистосовместимости (HLA). Считается, что LADA – это вариант СД1 с медленным прогрессированием. Это подтверждают исследования по изучению роли HLA при LADA, так, установлена ассоциация HLA класса II с развитием как LADA, так и СД1 [19, 20]. При этом наличие, как правило, только одного предрасполагающего гаплотипа в сочетании с протективным или нейтральным в генотипе больных LADA, вероятно, обуславливает менее агрессивное течение заболевания [21]. Ситуация изменилась с обнаружением ассоциации между полиморфизмами генаTCF7L2 и СД2 и ее отсутствием при СД1 [5–7]. Повышение частоты ассоциированных с СД2 генотипов обнаружено также у пациентов с LADA [10]. Было выдвинуто предположение, что LADA – это «гибридная» форма СД, а не просто частный случай СД1. Состоялись исследования по изучению ассоциации вариантов гена TCF7L2 при LADA, при этом в литературе представлены противоречивые данные. Cervin C с коллегами обнаружили у пациентов с LADA, как и у больных с СД2, повышение частот СТ/ТТ генотипов rs7903146 гена TCF7L2 (52,8%,р=0,03 и 54,1%, р=3х10-7 для LADA и СД2 соответственно) по сравнению с группой контроля (44,8%) и пациентами с СД1 (43,3%) [10]. В другом исследовании была установлена ассоциация Т-аллеля с развитием СД2 и LADA. Носители Т-аллеля имели более низкий ИМТ [11]. Другими авторами была обнаружена ассоциация ТТ-генотипа с LADA-диабетом (15% против 6%, р=0,03;OR=2,81, CI (95%)=1,11–7,23). У лиц с предрасполагающим генотипом были отмечены более низкие значения базального С-пептида (p<0,01) [12]. Zampetti S с соавт. описали у больных LADA с низким титром антител GADA и пациентов с СД2 повышение частот СТ/ТТ генотипов по сравнению с больными LADA с высоким титром GADA, больными СД1 и группой контроля (р≤0,04 для всех сравнений). У больных LADA-диабетом с низким титром антител GADA, а также у пациентов с СД2 отмечено повышение частоты Т-аллеля [13]. Bakhtadze E с соавт. указывают на увеличение частот генотипов СТ/ТТ у лиц с СД в возрасте от 15 до 34 лет с отрицательными антителами к GAD по сравнению с GADA-положительными пациентами (53% против 43%, р=0,0004) [14]. Тем не менее, по результатам одного из исследований ассоциация между полиморфизмом rs7903146 гена TCF7L2 и LADA не была установлена [16]. Многие исследователи не обнаружили подобной ассоциации гена TCF7L2 с СД1 [8, 9]. Однако Redondo MJ с соавторами в своей работе по изучению ассоциации вариантов TCF7L2 у детей с СД1 описывают следующее распределение генотипов: для пациентов с одним положительным АТ, n=15 – СС 40%, СТ 26,7%, ТТ 33,3%; для пациентов с ≥2 АТ соответственно, n=56 – СС 50%, СТ 42,9%, ТТ 7,1%, р=0,024 [22].

В нашем исследовании стратификация группы LADA на две подгруппы по уровню аутоантител позволила выявить статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов маркера rs7903146 гена TCF7L2 в группе LADA с низкими концентрациями аутоантител по сравнению с группой с высокими концентрациями и с группой контроля. Установлена ассоциация аллеля Т и генотипа Т+ с LADA-диабетом с низкими концентрациями АТ.

Таким образом, результаты исследования позволяют предполагать, что группа пациентов с LADA с низкими концентрациями аутоантител имеет генетически обусловленное сходство с СД2. LADA является не только гетерогенной, но и «гибридной» формой диабета, сочетающей не только клинические проявления СД1 и СД2, но и их генетические маркеры. Исследование в русской популяции проведено впервые.

Поскольку исследование проведено на небольшой выборке больных, полученные данные требуют дальнейшего анализа.

Дополнительная информация

Информация о финансировании

Финансирование осуществлялось в рамках научной программы ФГБУ «Эндокринологический научный центр»: «Геномные, постгеномные и протеомные технологии в изучении механизмов развития сахарного диабета и его осложнений».

Информация о финансировании и конфликте интересов

Данная работа является частью диссертационного исследования аспиранта ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Силко Ю.В., научный руководитель – д.м.н. Никонова Т.В. Авторы декларируют отсутствие иных явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи, о которых необходимо сообщить.

Участие авторов: Дедов И.И. – утверждение концепции и дизайна исследования; окончательная проверка и правка текста рукописи; Шестакова М.В. – непосредственное руководство научным исследованием, научная редактура рукописи; Никонова Т.В. – разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация результатов исследования, проверка и правка текста рукописи; Иванова О.Н. – выполнение лабораторных исследований, проверка и правка текста рукописи; Силко Ю.В. – сбор клинического материала, проведение проб, статистическая обработка результатов исследования, интерпретация результатов, написание текста рукописи; Степанова С.М. – выполнение лабораторных исследований, интерпретация результатов.