Взаимосвязь полиморфизма гена рецептора андрогенов и функции эндотелия у мужчин с сахарным диабетом 2 типа

Хорошо известно, что мужской пол является независимым фактором риска сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности [1, 2]. Эпидемиологические исследования показали, что многочисленные факторы кардиоваскулярных рисков – инсулинорезистентность, сахарный диабет, дислипидемия и центральное ожирение имеют значимую связь с уровнем тестостерона в плазме у мужчин [3, 4]. Наличие каждого из этих факторов по отдельности способствует возникновению дисфункции эндотелия, а их сочетание взаимно отягощает патологический процесс [5]. Имеющиеся на сегодняшний день данные о роли дефицита тестостерона в развитии и прогрессии эндотелиальной дисфункции у мужчин крайне немногочисленны и противоречивы.

Одним из механизмов, которые обусловливают различия в реализации биологических эффектов тестостерона, является полиморфизм CAG-повторов гена рецептора андрогенов (AR), обусловливающий чувствительность рецепторов к действию андрогенов. Ген AR состоит из восьми экзонов, для первого из которых характерно наличие последовательности повторов CAG (цитозин-аденин-гуанин). Триплет CAG кодирует аминокислоту глутамин, поэтому от числа тринуклеотидных повторов зависит количество глутамина в белке. Так, меньшему числу CAG-повторов соответствует меньшая степень конформационных изменений рецептора, что делает прочнее связь гормона и рецептора и приводит к повышению транскрипционной активности AR. Напротив, с увеличением числа CAG-повторов связь между андрогенами и рецептором становится слабее, и транскрипционная активность ARпадает. Хорошо известна связь числа CAG-повторов гена AR с разитием рака и доброкачественной гиперплазии простаты, а также нарушениями фертильности, в виде олигозооспермии [6–10]. Механизмы реализации эффектов тестостерона универсальны, и можно предположить, что полиморфизм гена рецептора андрогенов моделирует взаимодействие с внерепродуктивными органами – мишенями тестостерона. Ранее проводились работы на здоровых добровольцах, показавшие взаимосвязь низкого числа CAG-повторов гена AR с формированием нарушений артериальной вазореактивности вне зависимости от уровней общего и свободного тестостерона [11]. Многими исследованиями доказано ухудшение функции эндотелия у больных сахарным диабетом 2 типа (СД2) [12, 13]. В то же время рядом работ отмечено негативное влияние дефицита тестостерона на сердечно-сосудистую систему у мужчин [1, 2].

Вместе с тем в литературе отсутствуют данные о роли полиморфизма гена рецепторов андрогенов в формировании нарушений артериальной вазореактивности у мужчин с СД2.

Цель

Оценить взаимосвязь полиморфизмов CAG-повторов гена AR с показателями углеводного и липидного обменов, уровнями половых гормонов, а также биохимическими и ультразвуковыми маркерами дисфункции эндотелия у мужчин с СД2.

Материалы и методы

Нами было обследовано 88 мужчин в возрасте 40–65 лет, страдающих СД2. Средний возраст мужчин составил 53,4±5,3 года.

Все пациенты до начала процедур исследования подписали форму информированного согласия, одобренную Локальным этическим комитетом Ростовского Государственного медицинского университета. Всем пациентам проводили изучение анамнеза, физикальное обследование, производили забор крови утром (с 8 до 9 часов) натощак после 12-часового голодания. Определяли глюкозу, гликированный гемоглобин (HbA1c), липидограмму, гормоны крови – общий тестостерон, глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), эстрадиол, тиреотропный гормон, пролактин. В качестве биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции изучали уровни ICAM-1, VCAM-1, p-селектина, e-селектина, резистина. Биохимические исследования выполняли из свежей сыворотки крови, для проведения иммуноферментных исследований кровь центрифугировали и сыворотки замораживали при Т -20 °С. Для проведения генетического исследования венозную кровь отправляли в лабораторию ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ» (г. Москва). Кроме того, пациентам выполняли исследование артериальной вазореактивности плечевой артерии по методике D. Celermajer (1992).

Критериями исключения из исследования были экзогенный прием тестостерона в качестве заместительной терапии, наличие гипотиреоза или гиперпролактинемии как этиологических факторов развития гипогонадизма.

Для исследования биохимических показателей использовали анализатор Bayer ADVIA 1650. Определение гликированного гемоглобина выполняли на анализаторе Siemens HealthcARe Diagnostics DCA 2000+. Исследование общего тестостерона, ГСПГ, эстрадиола производили иммуноферментным методом с использованием тест-систем DRGElisa (Germany). Уровни пролактина, ТТГ, ЛГ, ФСГ определяли при помощи наборов «Алкор-Био» (Россия). Изучение концентрации маркеров эндотелиальной дисфункции ICAM-1, VCAM-1, p-селектина, e-селектина, резистина производили при помощи лабораторных наборов для ИФА eBioscience (Австрия).

Определение числа CAG-повторов в гене AR проводили методом ПЦР с последующим анализом полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК. В качестве исследуемого материала использовали геномную ДНК, выделенную из лейкоцитов цельной периферической крови с помощью набора реактивов WizARd® GenomicDNAPurificationKit (Promega, США) по протоколу производителя. Амплификацию фрагментов ДНК, содержащих CAG-повтор в экзоне 1 гена AR, проводили по стандартному протоколу с использованием пары праймеров (Allen et al., 1992). Фрагменты ДНК, полученные в ходе ПЦР, разделяли с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля в растворе бромистого этидия и визуализацией результатов с помощью УФ-документирующей системы.

Ультразвуковое исследование плечевой артерии (ПА) всем пациентам проводили с помощью теста реактивной гиперемии и пробы с сублингвальным приемом нитроглицерина. Для получения изображения ПА, измерения ее диаметра и скорости кровотока использовали ультразвуковую систему Philips HD 11, оснащенную линейным датчиком с фазированной решеткой (частота 7,0 МГц). В режиме двухмерного звукового сканирования фиксировали изменения в диаметре ПА и линейной скорости кровотока в ответ на увеличивающийся поток крови при проведении пробы с реактивной гиперемией (эндотелийзависимая реакция (ЭЗВ)) и в ответ на сублингвальный прием 500 мкг нитроглицерина (эндотелийнезависимая реакция (ЭНВ)). Компрессию сохраняли в течение 5 минут, затем резко снижали давление в манжете, вызывали быструю декомпрессию, что приводило к увеличению кровотока и изменению диаметра ПА. В ходе исследования диаметр ПА измеряли 10 раз: исходно, через 15 сек, 30 сек, 1 мин, 1 мин 30 сек, 2 мин, 3 мин, 4 мин, 5 мин после декомпресии и отсроченно. Линейную скорость кровотока (ЛСК) оценивали одномоментно с диаметром ПА. ЭЗВ как характеристику эндотелийзависимого ответа рассчитывали как отношение изменения диаметра ПА в течение реактивной гиперемии к диаметру артерии в покое, выраженному в процентах к исходному диаметру. ЭНВ как показатель эндотелийнезависимого ответа для каждого случая вычисляли аналогичным способом.

Все переменные были проверены на нормальность распределения по критерию Колмогорова-Смирнова. Клинические характеристики группы представлены в виде средних арифметических значений клинических признаков и их стандартных отклонений (M±m). Оценки линейной зависимости вариации переменных осуще ствлены с помощью комплекса моделей парной регрессии. Результаты регрессионного анализа представлены в виде β-коэффициентов регрессии. Вычисления проводились с использованием пакета прикладных программ SPSS 21.0. Результаты считали статистически достоверными при значении р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Общая характеристика пациентов представлена в таблице 1.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Примечание: Т – тестостерон

Среди обследованных пациентов 31 больной (34,4%) имел избыточную массу тела, а 55 мужчин (61,1%) – ожирение. Средний индекс массы тела (ИМТ) составил 31,5±3,6 кг/м2. Лишь 5 мужчин (5,5%) имели окружность талии (ОТ) менее 94 см, у остальных пациентов распределение жировой ткани было по абдоминальному типу. Средняя ОТ равнялась 109,3±10,1 см, средняя окружность бедер (ОБ) – 110,6±7,3 см. Артериальная гипертензия была диагностирована у 56 пациентов (63,6%), средний уровень систолического артериального давления (САД) – 141,2±14,6 мм рт. ст., диастолического артериального давления (ДАД) – 84,7±6,9 мм рт. ст., частота сердечных сокращений (ЧСС) – 74,8±7,5 ударов в минуту.

Средняя длительность СД составила 5,9±3,4 года, средний уровень НbА1с был 8,5±1,9%. Причем доля пациентов с уровнем НbА1с менее 7% составила 40,9% (36 человек), 25% (22 больных) имели НbА1с 7–8%. У 34% (30 мужчин) уровень НbА1с был более 8%. Средний уровень гликемии натощак в группе определен на уровне 9,1±2,8 ммоль/л. Среди обследованных больных 68,1% имели дислипидемию.

Анализ распределения частот числа CAG-повторов представлен на рисунке 1.

Рис. 1. Распределение частот CAG-повторов гена AR.

В изучаемой нами когорте пациентов число CAG-повторов находилось в диапазоне от 13 до 28, причем их наиболее распространенной частотой был 21 тринуклеотидный повтор, выявленный у 18 обследуемых. У 12 пациентов выявлены 20 и у такого же числа мужчин 22 CAG-повтора. Другие частоты тринуклеотидных повторов встречались реже.

Параметры функции эндотелия сосудов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты инструментального и биохимического исследований функции эндотелия

Примечание: ЭЗВ – эндотелийзависимая вазодилатация

При проведении пробы с реактивной гиперемией 46,6% (41 пациент) не имели ультразвуковых признаков нарушения сосудодвигательной функции эндотелия, что выражалось в ЭЗВ более 10%. Снижение сосудодвигательной функции эндотелия в ответ на пробу с реактивной гиперемией было выявлено у 53,4% (47 мужчин). Это подтверждено убедительными лабораторными данными. Так, средний уровень ICAM-1 составил 422,3±153,8 нг/мл, VCAM-1 – 936,8±362,2 нг/мл, резистина – 5,6±1,9 нг/мл, р-селектина – 752,2±155,4 нг/мл, е-селектина – 53,2±26,7 нг/мл.

Результаты оценки парных регрессий выявили ряд закономерностей, представленных в таблице 3.

Таблица 3. Результаты регрессионной оценки влияния длины CAG-повторов гена AR на биохимические и инструментальные параметры

Примечание: ИА – индекс атерогенности

Поскольку эффекты тестостерона реализуются через андрогеновый рецептор, а их выраженность зависит от его активности, важно было оценить взаимосвязь уровня общего тестостерона и полиморфизма гена AR. Выявлена значимая положительная связь (β=0,687, p=0,049) уровня общего тестостерона и числа CAG-повторов гена AR у пациентов с СД2. Эту закономерность можно объяснить компенсаторным увеличением продукции тестостерона для преодоления сниженной чувствительности к андрогенам по мере увеличения длины CAG-повторов гена AR. Полученные нами результаты на группе мужчин с СД2 отличаются от данных, описанных в исследованиях на здоровых добровольцах, для которых эти взаимосвязи не были выявлены [11, 12, 14].

Хорошо известно об ароматизации тестостерона в эстрадиол во многих тканях, в том числе и в жировой. Учитывая преимущественно абдоминальный тип ожирения у обследованных пациентов, можно было предположить наличие взаимосвязей уровня эстрадиола с числом CAG-повторов гена AR. Проведенный нами анализ не выявил значимого влияния полиморфизма гена AR на концентрацию эстрадиола в отличие от ряда работ [6, 15], показавших эту зависимость.

На сегодняшний день данные о влиянии андрогенов на липидный метаболизм крайне противоречивы. Поэтому одной из задач исследования было оценить влияние полиморфизма гена AR, моделирующего через активность андрогенового рецептора чувствительность к тестостерону. Число CAG-повторов гена AR имело обратную зависимость β=-0,125 (р=0,026) с показателем общего ХС, уровнем липопротеидов низкой плотности β=-0,102 (р=0,039) и индексом атерогенности β=-0,47 (р=0,01). В нашем исследовании полиморфизм гена AR статистически значимо не влиял на уровни ЛВП у мужчин, страдающих СД, что отличается от данных, полученных на здоровых добровольцах, выявивших положительную корреляцию числа CAG-повторов и уровня ЛВП [11].

Взаимосвязи уровней глюкозы и HbA1c с числом CAG-повторов гена AR оказались статистически не значимыми (p>0,05). Таким образом, можно судить об отсутствии значимого влияния длины полиморфизма CAG-повторов гена AR на показатели углеводного обмена у мужчин с СД2.

Интерес представляют результаты анализа биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции. Несмотря на важную роль таких молекул, как ICAM-1, VCAM-1, e-селектин в формировании дисфункции эндотелия, а также их взаимосвязь с концентрацией тестостерона, показанную в ряде работ [16, 17, 18], наше исследование не выявило их статистически значимой взаимо связи с длиной полиморфизма CAG-повторов гена AR. Однако число CAG-повторов значимо коррелировало с уровнями р-селектина (β=13,08; р=0,049) и резистина (β=0,23; р=0,032). Взаимосвязи концентраций резистина и р-селектина в зависимости от числа тринуклеотидных повторов в гене рецептора AR представлены на рисунках 2 и 3 соответственно.

Рис. 2. Диаграмма рассеяния концентрации резистина от предсказанных по числу CAG-повторов гена AR значений (регрессионный анализ).

Рис. 3. Диаграмма рассеяния концентрации р-селектина от предсказанных по числу CAG-повторов гена AR значений (регрессионный анализ).

Диаграммы рассеяния на рис. 2 и рис. 3 указывают на значимую взаимосвязь резистина и p-селектина с числом CAG-повторов гена AR, а, следовательно, и с чувствительностью рецепторов к действию андрогенов. Положительные значения регрессии показывают увеличение концентрации маркеров дисфункции эндотелия с удлинением CAG-повторов гена AR, что отражает снижение чувствительности андрогеновых рецепторов к действию тестостерона.

При оценке сосудодвигательной функции эндотелия, по данным пробы с реактивной гиперемией, были выявлены значимые отрицательные взаимосвязи полиморфизма гена AR с показателем прироста диаметра ПА в ответ на компрессию (β=-5,952, р=0,04), а также базового диаметра ПА (β=-0,49, р=0,024) и ЛСК (β=-3,88, р=0,018) при ЭЗВ. Отрицательная регрессия в данном случае указывает на ослабление сосудодвигательной функции эндотелия при увеличении числа CAG-повторов, что связано с уменьшением вазопротекторного действия тестостерона, реализуемого через активность гена AR.

Заключение

Большее число CAG-повторов в гене рецептора AR через ослабление чувствительности к андрогенам приводит к нарушению функции эндотелия у мужчин с СД2. Увеличение числа CAG-повторов в гене рецептора ARсопровождается снижением параметров ЭЗВ в ходе пробы с реактивной гиперемией вместе с усилением продукции p-селектина и резистина. Таким образом, увеличение количества CAG-повторов гена рецептора AR может быть расценено как предиктор развития и прогрессии сердечно-сосудистых поражений у мужчин с СД2. Необходимы дальнейшие исследования, которые позволят определить диапазон CAG-повторов гена рецептора AR, который бы являлся предиктором сердечно-сосудистых заболеваний и мог быть использован для отбора пациентов с высоким риском дисфункции эндотелия.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, в рамках гранта № 14-25-00052. Авторы статьи заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Хрипун И.А. – сбор материала, анализ полученных данных, написание текста; Воробьев С.В. – концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных; Коган М.И. – концепция и дизайн исследования, написание текста; Ниворожкина Л.И. – статистическая обработка данных.

Благодарности

Авторы выражают благодарность заведующей кафедрой математической статистики, эконометрики и актуальных расчетов РГЭУ, д.э.н. профессору Ниворожкиной Л.А. за статистическую обработку данных.