Изучение количества циркулирующих прогениторных клеток эндотелия у больных сахарным диабетом 1 типа

Сахарный диабет (СД) - одно из наиболее распространенных, высокозатратных, инвалидизирующих хронических заболеваний. Несмотря на большое количество клинических исследований, убедительно доказавших взаимосвязь диабета и сердечно-сосудистых осложнений (UKPDS-United Kingdom Prospective Diabetes Study, DECODE-Diabetes Epidemiology:Collaborative Analysis of Diagnostic Criteria in Europe, ARIC-Atherosclerosis Risk in Communities Study, ADVANCE-Action in Diabetes and Vascular Disease-Preterax and DiamicroN MR Controlled Evaluation), клеточные механизмы развития ангиопатий у больных диабетом изучены еще недостаточно. Известно, что в основе сосудистых осложнений при диабете лежит дисфункция эндотелия (ДЭ). На клеточном уровне ДЭ связана с повреждением и ускоренным апоптозом эндотелиоцитов. Предполагается, что воздействие ряда цитокинов и факторов роста приводит к мобилизации и высвобождению циркулирующих прогениторных клеток (ЦПК) эндотелия из костного мозга. Попадая в кровоток, они мигрируют к местам повреждения сосудов и ишемии тканей, частично включаются в область дефекта эндотелия сосудистой стенки, частично участвуют в формировании новых сосудов (ангиогенезе). Впервые популяция предшественников (прогениторных) эндотелиальных клеток была изолирована из циркулирующей мононуклеарной фракции и характеризовалась низкой экспрессией или полным отсутствием на своей поверхности общего лейкоцитарного антигена CD45 и наличием антигена CD34, специфичного для предшественников [1]. В настоящее время антиген CD34 признан одним из важных маркеров мультипотентных гемопоэтических клеток [2]. Другой маркер – с-Кit - регулирует пролиферацию, дифференцировку и миграцию гематопоэтических клеток, в связи с чем он долгое время считался маркером только гематопоэтических стволовых клеток костного мозга. В костном мозге около 1-5% всех клеток экспрессируют c-Кit, а из фракции CD34-позитивных клеток костного мозга c-Кit экспрессируют около 70% клеток. Максимальный уровень экспрессии c-Кit приходится на прогениторные клетки эритроцитарного, мегакариоцитарного, гранулоцитарного и лимфоидного направления. Клетки периферической крови в основном не несут с-Кit, однако его экспрессия может обнаруживаться на клетках малочисленной популяции циркулирующих CD34-позитивных клеток костного мозга. Данных о количественном содержании циркулирующих с-Kit+ прогениторных клеток у больных СД 1 типа (СД1) не так много, чаще исследователи анализировали суммарную фракцию CD34-позитивных клеток. Противоречивые представления относительно иммунофенотипа ЦПК объясняются значительным перекрыванием поверхностных маркеров между эндотелиальными и гемопоэтическими предшественниками, различиями в протоколах и особенностями анализа при количественной оценке популяций ЦПК с помощью проточной цитофлюориметрии. Поэтому в дальнейшем мы будем использовать термин ЦПК - циркулирующие прогениторные клетки. Большинство ранее проведенных клинических исследований, посвященных оценке количества ЦПК, проводилось у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) и сопутствующим нарушением углеводного обмена, включая СД 2 типа (СД2) [3, 4]. Больные СД1 в отличие от больных СД2 имеют более молодой возраст и минимальное количество факторов риска ССЗ, которые могли бы повлиять на уровень ЦПК. Поэтому изучение механизмов развития ангиопатий при СД1 с участием ЦПК представляется более оправданным. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ Целью исследования явилось изучение количества ЦПК у больных СД1 в зависимости от качества контроля углеводного обмена и длительности заболевания. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: • определить в периферической крови больных СД1 и здоровых добровольцев количество прогениторных клеток следующих циркулирующих популяций: Lin-CD34+; Lin-c-Kit+ ; Lin-CD34+c-Kit-; Lin-CD34-c-Kit+; Lin-CD34+c-Kit+; • сопоставить количество ЦПК вышеуказанных популяций с уровнем глюкозы плазмы натощак, гликированного гемоглобина (HbA1c) и длительности СД1; • сопоставить уровень апоптоза ЦПК у больных СД1 и здоровых добровольцев. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследование было включено 45 больных СД1 и 14 здоровых добровольцев, сопоставимых с больными по возрасту и полу. Критериями исключения были: СД2, состояние кетоацидоза, острые и хронические воспалительные заболевания, онкологические и системные заболевания, тяжелая анемия и другие гематологические заболевания, алкоголизм, пороки сердца, инфаркт миокарда в анамнезе, инсульт, оперативные вмешательства (в том числе и малоинвазивные процедуры) менее 6 месяцев назад, рефрактерная артериальная гипертония (АД>180/100 мм рт. ст. на фоне гипотензивной терапии), ожирение, синдром диабетической стопы, диабетическая макроангиопатия, терминальная почечная недостаточность, диализ. Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования был утвержден на заседании локального этического комитета ФГБУ ЭНЦ МЗ России от 19 января 2009 г. (протокол №1). У больных СД1 средний возраст составлял 26,6+6,5 лет, средняя длительность диабета - 13,3+7,5 лет, средний уровень HbA1c - 8,4+2,0%. На момент включения в исследование у 11 человек (24%) определялась микроальбуминурия и у 1-го – протеинурия. Согласно международной классификации хронической болезни почек (ХБП), у 7 человек определялась ХБП 1-й стадии, у 4 – ХБП 2-й стадии и у 1-го - ХБП 3-й стадии. У 10 пациентов (22%) была выявлена диабетическая ретинопатия (из них у 7 была выполнена лазерная коагуляция сетчатки); 12 человек (27%) страдали хронической сердечной недостаточностью (ХСН) по диастолическому типу. Артериальная гипертензия была выявлена у 19 больных (42%). Гипотензивная терапия проводилась ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента. Основные клинические характеристики обследуемых групп представлены в таблице 1. Таблица 1. Клиническая характеристика групп, включенных в исследование. Данные представлены как (M±m (δ)) Показатели Здоровые добровольцы Больные СД 1 Всего, n=59 14 45 Возраст, годы 26,4±3,3 26,6±6,5 Мужской пол, n (%) 5 (36) 20 (44) Длительность СД1, (годы) - 13,3±7,5 Глюкоза плазмы натощак, ммоль/л 4,5±0,6 7,5±2,4 HbA1c, % 4,7±0,7 8,4±2,0 Артериальная гипертензия, n (%) - 19 (42) СКФ (MDRD мл/мин/1,73 м²) 98,0±7,9 105,9±24,2 ОХС, ммоль/л 4,3±0,7 4,8±1,4 ХС ЛПНП, ммоль/л 2,0±0,5 2,6±1,2 ХС ЛПВП, ммоль/л 1,9±0,5 1,7±0,6 ТГ, ммоль/л 1,0±0,4 1,1±0,8 Гемоглобин, г/л 133,0±7,8 139,7±13,5 Лейкоциты, 109 /л 6,9±0,7 6,7±1,6 Физические нагрузки, n (%) 7 (50) 24 (53) Примечание: ОХС – общий холестерин, ХС ЛПНП – холестерин липопротеинов низкой плотности, ХС ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности, ТГ – триглицериды. Всем участникам исследования проводилось стандартное клинико-лабораторное обследование, включавшее общий анализ крови, биохимический анализ крови, определение HbA1c. Содержание НbА1с методом жидкостной хроматографии на анализаторе Sapphire 400 (Niigata Mechatronics, Япония) проводилось по стандартной методике производителя. Инструментальное обследование включало ЭКГ, Эхо-КГ, нагрузочные пробы для исключения ИБС. Стадия ХБП определялась по скорости клубочковой фильтрации (СКФ). СКФ (мл/мин/1,73 м²) рассчитывалась по формуле MDRD [5]. Количество ЦПК и процент апоптотических ЦПК определяли методом проточной цитофлюориметрии на клеточном сортере MoFlo (DakoCytomation, США). Мононуклеарные лейкоциты выделяли центрифугированием в растворе Фиколла (Панэко, Россия). 2-5×106клеток инкубировали с флуоресцентно-меченными антителами Lin-FITC (BD Biosciences, США), CD34-APC (DAKO, Дания) и c-Kit-PE (DAKO) в течение часа. Для анализа апоптоза 1×106 клеток окрашивали аналогично, но без использования c-Kit-PE, и после отмывки клетки дополнительно окрашивали 15 мин Аннексином V-PE (AnV-PE) (BD) и 7-AAD (BD) в буфере для AnV (BD). После окраски клетки отмывали, ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера и анализировали. В результате анализа выделяли область клеток, не несущих линейных маркеров лейкоцитов (Lin-, рис. 1A). Среди этих клеток выделяли три субпопуляции: Lin-CD34+c-Kit-, Lin-CD34+c-Kit+ и Lin-CD34-c-Kit+ (рис. 1Б) и подсчитывали процент клеток каждой субпопуляции относительно всех мононуклеарных лейкоцитов. Процент Lin-CD34+ и Lin-c-Kit+ вычисляли как сумму двух из этих субпопуляций. Процент апоптотических клеток определяли для популяции Lin-CD34+ лейкоцитов (рис. 1В). При этом апоптотические клетки идентифицировали как клетки, окрашенные AnV-PE и не содержащие 7-AAD (AnV+7AAD-, рис. 1Г) Рисунок 1. Анализ субпопуляций ЦПК методом проточной цитофлюориметрии. А. Выделение областей лейкоцитов, не несущих линейных маркеров лейкоцитов (Lin-). Б. Анализ Lin- клеток в соответствии с экспрессией маркеров с-Kit (ось абсцисс) и CD34 (ось ординат). Отмечены области, экспрессирующие один или оба этих маркера: Lin-CD34+c-Kit-, Lin-CD34+c-Kit+ и Lin-CD34-c-Kit+. В. Выделение области Lin-CD34+ клеток. Г. Анализ Lin-CD34+ клеток в соответствии с экспрессией маркера мертвых клеток (7-AAD, ось абсцисс) и апоптотических клеток (AnV, ось ординат). Область апоптотических клеток отмечена как AnV+7AAD-. Все больные на момент госпитализации находились на режиме базис-болюсной инсулинотерапии аналогами человеческих инсулинов. Статистический анализ данных Регистрация данных, их редактирование и статистический анализ осуществлялись в пакете Microsoft Office и в системе анализа данных и извлечения информации Statistical Analysis System (SAS). Описательные числовые характеристики исследуемых переменных: средние, частоты, стандартные отклонения и стандартные ошибки рассчитывались с помощью процедур PROC SUMMARY, PROC UNIVARIATE, PROC FREQ. Обобщенный дисперсионно-ковариационный анализ с помощью процедуры PROC GLM использовался для оценки влияния непрерывных: возраст, уровень глюкозы, уровень HbA1c, длительность диабета; или двоичных: пол, наличие СД1 - показателей (категорий) на количество клеток Lin-CD34+, Lin-c-Kit+, Lin-CD34+c-Kit-, Lin-CD34+c-Kit+ и Lin-CD34-c-Kit+ и процент апоптоза. Использовались стандартные критерии значимости: χ-квадрат, t-тест Стьюдента (двухвыборочный и парный) и критерий Фишера (F) F-тест дисперсионного анализа. Вычислялись частные корреляции по Спирмену между блоками переменных при фиксировании третьих переменных (пол, возраст, ИМТ). Для выявления независимых взаимосвязей между параметрами использовались многомерные регрессионные уравнения и множественный линейный регрессионный анализ. Нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Количество ЦПК у больных СД1 Количество ЦПК исследуемых популяций у здоровых добровольцев и больных СД1 представлено в табл. 2. Как следует из табл. 2, в целом вся группа больных СД1 характеризовалась сниженным количеством ЦПК по сравнению с группой контроля. Так, количество ЦПК суммарной фракции Lin-CD34+ в группе больных СД1 оказалось статистически значимо снижено на 42%, клеток Lin- c-Kit+ - на 19%; клеток Lin-CD34+c-Kit- - на 42%; клеток Lin-CD34+c-Kit+ - на 41%. По количеству клеток Lin-CD34-c-Kit+ достоверных различий не было выявлено. Таблица 2. Количество ЦПК в периферической крови пациентов, включенных в исследование. Данные представлены как (M±m (δ)) Популяции ЦПК (клеток/млн/лейкоцитов) Здоровые добровольцы Больные СД1 Ниже в группе больных, % Достоверность различий, р Lin-CD34+ 74,1±58,5 43,1±23,7 42% 0,006 Lin- c-Kit+ 203,2±96,9 165,2±80,5 19% 0,178 Lin-CD34+c-Kit- 34,3±30,4 19,8±10,4 42% 0,007 Lin-CD34-c-Kit+ 163,4±11,0 141,8±78,4 НД 0,460 Lin-CD34+c-Kit+ 39,8±35,1 23,3±16,3 41% 0,022 Схожие данные были получены в работе Palombo et al. (2011), в которой у больных СД1 (HbA1c=7,7±1,1%) в сравнении с группой контроля продемонстрировано снижение популяции ЦПК CD34+ на 34,5% [6]. Авторы также обнаружили обратную корреляционную взаимосвязь ЦПК с толщиной комплекса интима-медиа (r=-0,31, p<0,05), объясняя это повышенным привлечением прогениторных клеток в атеросклеротические зоны. В работе Głowin´ska-Olszewska et al. (2013) с участием 52 больных СД1 (HbA1c=8,5±1,4%), авторы не обнаружили различий по количеству клеток суммарной фракции CD34+-клеток в сравнении со здоровыми, но выявили снижение ЦПК популяции CD34+CD144+(VE-cadherin+) у больных СД1 в сравнении со здоровыми лицами и продемонстрировали взаимосвязь этой популяции с поток-зависимой вазодилатацией (r=-0,31, p=0,03) [7]. Среди возможных механизмов снижения ЦПК обсуждаются нарушение процессов мобилизации прогениторных клеток из костного мозга [8], повышенное "потребление" этих клеток в зонах ишемии, повреждения эндотелия, нарушение функциональных характеристик ЦПК при воздействии гипергликемии, увеличенный апоптоз ЦПК [2]. Кроме этого, отдельно дискутируется нарушение мобилизации ЦПК из костного мозга, обусловленной специфическим типом костномозговой нейропатии [9]. Предполагают, что диабет приводит также к костномозговой микроангиопатии с морфологическими особенностями, подобными другим типичным диабетическим микрососудистым осложнениям, включая утолщение базальной мембраны, капиллярное разрежение и повышенный апоптоз эндотелиоцитов и прогениторных клеток сосудов [10]. Взаимосвязь качества контроля углеводного обмена и количества ЦПК у больных СД1 Известно, что гипергликемия является основным фактором, повреждающим стенку сосудов у больных диабетом. При проведении корреляционного анализа мы не обнаружили взаимосвязи между количеством ЦПК и уровнем глюкозы плазмы натощак. Однако была выявлена статистически значимая отрицательная корреляционная зависимость между количеством ЦПК и уровнем HbA1c: для суммарной фракции Lin-CD34+ клеток (F=7,4, р=0,009), для популяции Lin-CD34+c-Kit- клеток (F=6,6, р=0,01), для клеток Lin-CD34+c-Kit+ (F=5,2, р=0,02) (рис. 2, 3, 4). Рисунок 2. Взаимосвязь относительного количества Lin-CD34+ клеток с уровнем HbA1c, n=45. Рисунок 3. Взаимосвязь относительного количества Lin-CD34+c-Kit- клеток с уровнем HbA1c, n=45. Рисунок 4. Взаимосвязь относительного количества Lin-CD34+c-Kit+ клеток с уровнем HbA1c, n=45. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, в которых также была продемонстрирована взаимосвязь количества ЦПК с неудовлетворительным контролем углеводного обмена у больных диабетом [3, 4]. Обнаруженная нами отрицательная взаимосвязь количества ЦПК и уровня HbA1c, а также данные литературы подтверждают высокую значимость контроля гликемии, как важнейшего фактора профилактики микро- и макрососудистых осложнений у больных диабетом как 1, так и 2 типов [6, 11]. Длительность СД1 и количество ЦПК По некоторым сведениям, длительность СД ассоциируется со снижением количества ЦПК. Большинство авторов склоняются к мнению, что снижение числа прогениторных клеток у больных с длительным анамнезом СД обусловлено длительным оксидативным стрессом, вследствие хронической гипергликемии. Обсуждаются нарушение локальной продукции оксида азота (NO), избыточная генерация эндотелий-зависимого супероксида, инактивирующего синтезированные молекулы NО и стимулирующего окисление липопротеидов низкой плотности, а также способствующего повреждению мембран эндотелиоцитов пероксинитритом и гидроксильными радикалами [12]. В нашем исследовании при распределении больных по длительности диабета на группы от 0 до 5 лет, от 6 до 10 лет и более 10 лет статистически значимых различий выявлено не было. Апоптоз ЦПК Установлено, что апоптозные тельца эндотелиоцитов оказывают дозозависимую стимуляцию пролиферации эндотелиальных прогениторных клеток. Есть предположение, что продукты апоптоза являются физиологическими «манками» для циркулирующих прогениторных клеток, стимулируют их пролиферацию и мобилизацию из костного мозга в кровь. При этом сведения о взаимосвязи нарушений углеводного обмена у больных диабетом и уровня апоптоза ЦПК немногочисленны и неоднозначны. В исследовании Loomans С.J. et al. (2004) авторы не обнаружили отличий по уровню апоптоза культивируемых ЦПК у здоровых и больных СД1 [13]. В отдельных исследованиях кроме снижения ЦПК (CD34-/CD133+/KDR+) у больных СД2 в сравнении с больными без СД2 было продемонстрировано увеличение циркулирующих ранних апоптотических прогениторных клеток (CD34+/7AAD-/AnnexinV+). В нашей работе мы не обнаружили статистически значимых различий по уровню апоптоза среди всех Lin-CD34+ ЦПК в сравниваемых группах. Взаимосвязи уровня апоптоза ЦПК с параметрами углеводного обмена выявлено не было. ВЫВОДЫ 1. Количество ЦПК в периферической крови больных СД1 достоверно снижено в сравнении со здоровыми добровольцами. 2. Количество ЦПК имеет достоверную обратную корреляционную зависимость с уровнем HbA1c, что свидетельствует о значимой роли гипергликемии в нарушении формирования прогениторных клеток эндотелия сосудов, необходимых для репарации сосудов. 3. Длительность СД1 не влияет на количество ЦПК. 4. Уровень апоптоза ЦПК в сравниваемых группах больных СД1 и здоровых добровольцев не отличается. Таким образом, выявленное в нашей работе снижение количества циркулирующих прогениторных клеток эндотелия у больных СД1, имеющее взаимосвязь не столько с длительностью заболевания, сколько с качеством метаболического контроля, позволяет предположить наличие глюкозозависимого нарушения механизмов репарации эндотелия сосудов. Этот процесс, безусловно, усугубляет прогрессирование сосудистых осложнений диабета, наряду с другими известными механизмами глюкозотоксичности по отношению к стенке сосудов. ИНФОРМАЦИЯ О ФИНАНСИРОВАНИИ РАБОТЫ И КОНФЛИКТЕ ИНТЕРЕСОВ Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведением исследования и публикацией данной статьи. Настоящее исследование проведено в рамках научной работы по платформе «Эндокринология». БЛАГОДАРНОСТИ Авторы выражают благодарность Шаронову Г.В. (ФФМ МГУ имени М.В.Ломоносова) за выполнение протокола проточной цитофлюориметрии.