Клинико-морфологические параметры и маркеры репарации нейропатических язвенных дефектов при синдроме диабетической стопы

Синдром диабетической стопы (СДС) является поздним осложнением сахарного диабета (СД). Язвенные дефекты при этом осложнении относятся к хроническим раневым дефектам. Основными факторами риска их возникновения являются нейропатия, включая дистальный сенсомоторный и автономный компоненты и/или нарушение магистрального кровотока нижних конечностей [1]. Ситуация осложняется присоединением инфекции, особенно в сочетании с нарушением кровотока в пораженной конечности [2]. Образовавшееся нарушение целостности кожных покровов - язвенный дефект - изначально находится в крайне неблагоприятных условиях. Многочисленными исследованиями подтвержден нарушенный ответ на внедрение инфекционного агента [3, 4] и дефицит большинства факторов роста [5], участвующих в процессах заживления. Усугубляет ситуацию несоблюдение режима разгрузки, которое приводит к таким морфологическим изменениям в ране, как повреждение цитоплазматического матрикса, разрушение мелких сосудов, воспаление и некроз [6]. Вследствие этого, патофизиологические механизмы репарации нарушаются, процесс принимает затяжное хроническое течение с замедлением сроков заживления. Так, по данным разных авторов, заживление в течение 3 месяцев наступает лишь у 24-34% пациентов [7, 8]. Немаловажным является позднее обращение пациента за специализированной помощью. По данным проспективного исследования EURODIALE, которое оценивало организацию помощи больным с СДС в различных странах Европы, в 27% случаев больные обращались за помощью спустя 3 месяца после возникновения раны [9]. По нашим данным, этот показатель составляет 17%. Это означает, что группа больных сСДС имеет дополнительную градацию по длительности существования раны. Следует отметить, что клинические проявления раневых дефектов разной длительности при схожих базовых характеристиках (локализация, размеры, степень выраженности ишемии конечности и инфицирования раны), не имеют существенных отличий. Стратегия лечебных мероприятий не учитывает различную длительность существования ран и базируется на стандартах их ведения. Между тем, из клинической практики известно, что ответ на проводимые лечебные мероприятия бывает различным, даже при условии максимального соблюдения рекомендаций. При этом практически нет данных, оценивающих морфологические особенности раневых дефектов разной длительности, особенно с точки зрения их репарационного потенциала. ЦЕЛЬ Сравнить клинико-морфологические параметры и маркеры репарации нейропатических язвенных дефектов при синдроме диабетической стопы (нСДС) различной длительности. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследовании приняли участие пациенты, обратившиеся за помощью в отделение диабетической стопы ГБУЗ Эндокринологический диспансер Департамента здравоохранения города Москвы. Критерии включения в исследование были следующими: • пациенты с СД 1 или 2 типа старше 18 лет; • наличие нейропатического язвенного дефекта; • отсутствие видимых клинических признаков инфекционно-воспалительного процесса; • отсутствие критической ишемии; • подписанное информированное согласие. Всем пациентам проводилась оценка неврологических нарушений. Вибрационная чувствительность оценивалась при помощи биотезиометра на уровне 1 плюснефаланговых сочленений обеих стоп. Полученные значения выражались в вольтах (В). Анализировался усредненный показатель вибрационной чувствительности обеих нижних конечностей. Нормальным считается уровень вибрации ≤7 В. Для суммарной оценки состояния болевой, температурной, тактильной чувствительности, коленных и ахилловых рефлексов использовался нейропатический дисфункциональный счет (шкала НДС) по стандартной методике [10]. Состояние магистрального кровотока оценивалось при помощи пальпации тибиальных артерий с выполнением ультразвуковой допплерографии и вычислением лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ). Ультразвуковое дуплексное сканирование артерий нижних конечностей и транскутанная оксиметрия пораженной стопы выполнялись по показаниям. Морфологические методы исследования Биопсийный материал забирался из краев и из центра раны после промывания ее физиологическим раствором и очищения от некротических масс. Скальпелем срезался верхний слой раны в объеме до 0,5 см3, фиксировался в 10% нейтральном растворе формалина и заливался в парафин. Серийные парафиновые срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Морфометрическая оценка состояла из определения относительной площади некроза, грануляций и фиброза (в %). Также оценивалось количество гиалинизированных сосудов, выраженное в баллах (от 0 до 3). Балл «0» ставился в том случае, если в биоптате отсутствовали гиалинизированные сосуды, «1» - при наличии менее 10%, «2» - при наличии от 10 до 40%, «3» - при наличии  40% гиалинизированных сосудов. В качестве маркеров пролиферации были выбраны ядерный белок Ki67, гладкомышечный актин (SMA) и цитокератин (CK). Ki 67 экспрессируется в большинстве фаз митотического цикла и является универсальным маркером пролиферативной активности клеток. Определение его содержания используется в различных областях медицины, включая онкологию. В случае хронизации течения раневого процесса, по его уровню можно оценить регенеративный потенциал тканей раны. SMA – это белок, который экспрессируется гладкомышечными клетками и миофибробластами. В свою очередь, миофибробласты являются одними из ключевых клеток в заживлении ран. То есть, SMA может служить маркером наличия миофибробластов, непосредственно участвующих в заключительной стадии заживления. Эпителизация завершает заживление раны, что может быть оценено по экспрессии СК [11]. Иммуногистохимические реакции ставились по общепринятой методике с демаскировкой антигенов в ретривере на серийных парафиновых срезах биоптата раны. Блокирование эндогенной пероксидазы проводилось 3% пероксидом водорода в депарафиновых срезах. В качестве первичных специфических антител использовались антитела к Ki 67 (Dako, Denmark, 1:100), SMA (Springbioscience, USA, 1:100) и CK (Dako, Denmark, 1:100). Cтавили положительные и отрицательные контрольные реакции. Результаты иммуногистохимических реакций оценивались в процентах окрашенных клеток на 300 клеток одного вида, принятых за 100%. Всеми больными было подписано информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования был одобрен локальным Этическим комитетом ГБУЗ «Эндокринологический диспансер ДЗМ» (протокол № 56 от 06 июня 2014 г.) Статистическая обработка Данные представлены как средние со стандартным отклонением (M ± SD). Для сравнения групп применялся дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса. Сравнение двух независимых переменных выполнялось при помощи U-критерия Манна-Уитни. Разница считалась значимой при уровне p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В исследовании приняли участие 26 пациентов с нейропатической формой СДС. У 2 пациентов были взяты материалы из двух ран разной длительности, поэтому количество образцов составило 28. В таблице 1 отражена клиническая характеристика обследованной группы. Таблица 1. Клиническая характеристика обследованной группы. Количество пациентов , n 26 Количество образцов, n 28 СД1/СД2, n (%) 3 (13)/17 (87) Возраст, годы (M±SD) 55,5±6, 5 Пол (М/Ж), n (%) 21/7 (75/25) Длительность СД, годы (M±SD) 13,8±8,0 Инсулинотерапия, n (%) 18 (64) HbA1c, % (M±SD) 8,2±1,6 Пролиферативная ретинопатия, n (%) 6 (21) Диабетическая нефропатия, ХБП С4-5, n (%) 7 (27) Нейропатический дисфункциональный счет (НДС), баллы (M±SD) 14,0±4,2 Вибрационная чувствительность (ВЧ), вольты (M±SD) 49,4±10,2 Пациенты были среднего возраста, преимущественно с длительно существующим СД 2 типа. Подавляющее большинство больных получали инсулинотерапию (64%). У 21% (6 человек) была диагностирована пролиферативная ретинопатия, у 27% - диабетическая нефропатия: из них с резким снижением скорости клубочковой фильтрации у 19% (5 пациентов), на стадии терминальной почечной недостаточности – у 8% (2 пациента). У всех пациентов отмечены выраженные нарушения периферической чувствительности. Биоптаты, полученные от пациентов, были разделены на 3 группы в зависимости от длительности существования ран: группа 1 (9 образцов) ≤90 дней медиана длительности – 40 (20-90) дней; группа 2 (10 образцов) – от 90 до 365 дней медиана длительности – 180 (120–335)дней; группа 3 (9 образцов) >365 дней медиана длительности 555 (370-2190) дней. Основанием для такого разделения послужил тот факт, что в международной практике широко используется оценка процента заживления ран за 3 месяца (90 дней), 6, 9 или 12 месяцев (в нашем исследовании эти образцы объединены) и свыше года. При этом хронической считается рана, длительность которой превышает 8 недель [12]. В таблице 2 приведены данные клинических параметров обследуемых групп. Таблица 2. Сравнительная характеристика клинических параметров обследуемых групп Параметр Группа 1 (N=9) Группа 2 (N=10) Группа 3 (N=9) p Возраст, годы 53,7±2,7 51,7±5,9 59,9±5,6 р1-3=0,019 р2-3=0,01 Длительность СД, годы 15,0±11,0 14,0±8,2 14,2±8,8 НД HbA1c, % 8,9±1,3 7,9±1,8 7,7±1,6 НД ВЧ, вольты 49,0±10,0 48,0±11,0 48,0±10,0 НД НДС, баллы 14±3,8 14,5±4,4 13,7±4,7 НД НД - не достоверно Таким образом, сравнительный анализ выявил, что больные с длительностью ран больше года (группа 3) были достоверно старше пациентов с наличием ран меньшей длительности. По остальным клиническим параметрам различий между группами не выявлено. Результаты микроскопического анализа образцов представлены в табл. 3. Таблица 3. Результаты микроскопического анализа образцов Параметр Группа 1 (N=9) Группа 2 (N=10) Группа 3 (N = 9) p Некроз, % 33,7±21,7 11±3,9 12,8±6,1 р1-2=0,013 р1-3=0,02 Грануляции, % 45,2±21,1 53,5±21,1 32,8±26,3 НД Фиброз, % 21,1±21,0 35,5±19,8 54,4±23,9 р 1-3=0,006 р 2-3=0,035 Гиалиноз сосудов, баллы 2,0±0 1,9±0,3 1,9±0,3 НД НД - не достоверно Как представлено в табл. 4, группа больных с наименьшей длительностью характеризовалась достоверно более высоким содержанием некротических тканей, умеренным количеством грануляций и относительно невысокой выраженностью фиброза. Во 2-й группе с длительностью ран до года помимо значимого снижения содержания некроза по сравнению с 1-й группой, отмечено увеличение грануляционной ткани и фиброза. Для группы больных с длительностью существования ран, превышающей 1 год, было характерно невысокое содержание некротической ткани, сопоставимое с таковым в группе 2, уменьшение количества грануляций по сравнению с группами 1 и 2 и значимое, по сравнению с группой 1, увеличение фиброза. Степень выраженности гиалиноза сосудов была сопоставимой в обеих группах. На рис. 1 и 2 представлены фотографии макро- и микропрепаратов нейропатических язвенных дефектов различной длительности. А1 А2 В1 В2 Рис. 1. Нейропатические язвенные дефекты разной длительности. А – макропрепараты нейропатических язвенных дефектов: А1 - длительностью 180 дней; А2 - длительностью больше 365 дней. В – микропрепараты нейропатических язвенных дефектов (окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×100; условные обозначении:  - участки некроза,  - грануляции,  - фиброз): В1 - длительностью 180 дней с полями некроза и грануляций; В2 - длительностью больше 365 дней с превалированием фиброза. На представленных фотографиях хорошо видно, что внешний вид нейропатических язвенных дефектов различной длительности при сопоставимости базовых характеристик (локализация, отсутствие видимых признаков инфекции) мало отличим. Однако на микрофотографиях биопсийных образцов, окрашенных по гематоксилину и эозину, хорошо заметны отличия. Если в ране длительностью меньше года (рис. 1А2) практически в равной степени представлены участки грануляций и некроза, то в микроскопической картине язвенного дефекта длительностью больше года превалирует фиброзная ткань (рис. 1В2). Во всех 3 группах был проведен иммуногистохимический анализ для определения уровня экспрессии Ki 67. Как указывалось выше, по экспрессии этого ядерного белка можно косвенно судить о репарационном потенциале раны. Согласно данным, представленным на рис. 2, раневые дефекты меньшей длительности обладают большей способностью к регенерации, чем раны длительностью, превышающей 1 год. Рис. 2. Экспрессия Ki 67 в грануляционной ткани при нейропатических язвенных дефектах различной длительности. Кроме того, следует отметить, что значения этого показателя имеют достаточно широкий разброс. Так, в группе 1 есть образцы с показателями Ki 67, сопоставимыми с показателями группы 3 (рис. 2). Эти данные требуют дальнейшего уточнения. На рис. 3 представлены микрофотографии экспрессии Ki 67 в ранах длительностью до и после года. А В Рис. 3. Микрофотографии экспрессии Ki 67 в ядрах клеток грануляционной ткани ран длительностью меньше (А) и больше года (В), увеличение ×400. Стрелками указаны Ki 67 На рис. 4 представлены данные экспрессии SMA и CK в ранах разной длительности. Рис. 4. Экспрессия SMA и CK в грануляционной ткани при нейропатических язвенных дефектах различной длительности. SMA (smooth muscle actin) – гладкомышечный актин; CK – цитокератин. Полученные данные по экспрессии указанных маркеров не имели достоверных отличий. Поэтому, на наш взгляд, можно говорить лишь о тенденции к более низким значениям в группе с наибольшей длительностью язвенных дефектов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Раневой дефект проходит в своем развитии, независимо от этиологии, следующие стадии: воспаление, регенерация, эпителизация. При неосложненном течении длительность 1-й фазы воспаления не превышает 3-5 суток, 2-й может достигать 30 дней, а эпителизация растягивается на многие месяцы [13]. Процесс репарации является многокомпонентным. Для адекватного и полноценного синтеза грануляционной ткани необходимо полное очищение раны от микробных агентов, наличие в необходимом количестве факторов роста и рецепторов к ним, отсутствие факторов, замедляющих процесс репарации, наличие факторов, способствующих процессам репарации, включая разгрузку пораженной конечности. В случае с трофическими изменениями при синдроме диабетической стопы мы имеем дело с хроническими ранами, в которых нарушены физиологические процессы и сроки заживления. Кроме того, для этих пациентов характерна поздняя обращаемость за специализированной помощью, что является дополнительным фактором, ухудшающим прогноз. В проведенном исследовании мы ставили целью провести сравнительную оценку клинико-морфологических параметров ран разной длительности, а также их репарационного потенциала, вне зависимости от причин, приведших к замедлению сроков заживления, в ряде случаев значительному. У пациентов, получающих помощь в амбулаторном режиме, к таким причинам можно отнести целый ряд неблагоприятных условий, включая отсутствие частого профессионального контроля за состоянием раны, достаточно «свободный» режим повседневной активности, самостоятельную обработку раны и т.д. На наш взгляд, анализ этих факторов является очень важным и требует отдельного исследования. Однако, учитывая принципиальное значение соблюдения режима разгрузки, следует отметить, что всем пациентам исследуемой группы был предписан необходимый их состоянию вид разгрузки в соответствии со стандартами оказания помощи больным с СДС. Вопрос о ранах у пациентов группы контроля до конца не решен. Это связано с тем, что процессы репарации в острых послеоперационных или ожоговых ранах отличны от таковых в хронических длительно незаживающих ранах. Раны голеней вследствие венозной и/или артериальной недостаточности, а также пролежни имеют иную патофизиологическую основу и соответственно другие факторы, нарушающие их заживление. По полученным данным, раны, длительность которых не превышала 3 месяцев, в основном содержали грануляционную ткань, которая замещала представленные в значительном количестве некротические массы. Индекс пролиферации по Ki 67 демонстрирует истощение пролиферативных процессов в ранах, существующих больше года. Это приводит к дифференцировке фибробластов в фиброциты, последующему синтезу коллагена и развитию фиброза. В свою очередь, фиброз по механизму порочного круга блокирует регенерацию [14]. Поэтому морфологические и патогенетические особенности течения незаживающих больше года ран ставят вопрос обоснованности хирургического иссечения фиброзной ткани. Функция миофибробластов при неосложненном течении раны заключается в стягивании краев раны и закрытию дефекта кожи [14]. В ситуации с хроническими ранами их количество снижается, вероятно, за счет дифференцировки в фиброциты. Клиническая картина длительно существующей незаживающей раны может служить подтверждением данного предположения. Одним из возможных ограничений исследования с клинической точки зрения можно считать недостаточную мощность выборки. Однако использование иммуногистохимических методов анализа, ввиду сложности его исполнения, допускает наличие небольшого количества образцов для проведения сравнительного анализа данных. При этом для получения статистической достоверности различий применяются специальные методы статистической обработки материала, что и было выполнено в нашей работе. Таким образом, на основании полученных данных, можно сделать заключение о том, что нейропатические язвенные дефекты разной длительности отличаются по своиv морфологическим характеристикам и репарационному потенциалу. СДСн длительностью меньше 1 года характеризуются более выраженной регенераторной способностью и меньшей степенью фиброза. Для нейропатических язвенных дефектов длительностью больше 1 года характерна неполная репарация и склонность к фиброзу, что предполагает дифференцированный подход к выбору методов лечения. ИНФОРМАЦИЯ О ФИНАНСИРОВАНИИ И КОНФЛИКТЕ ИНТЕРЕСОВ Работа проведена при поддержке ГБУЗ Эндокринологический диспансер ДЗМ (Москва) и ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Москва). Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.