Риск развития хронической болезни почек у больных сахарным диабетом 2 типа детерминирован полиморфизмом генов NOS3, APOB, KCNJ11, TCF7L2

Хроническая болезнь почек (ХБП) является патологией, по темпам роста распространенности приобретающей характер неинфекционной эпидемии, наряду с такими заболеваниями, как сахарный диабет (СД) и ожирение. ХБП развивается у 13–15% лиц в общей популяции и гораздо чаще – до 40–50% – в группах риска, к которым относятся пациенты с СД 2 типа (СД2) [1]. По прогнозам Международной диабетической федерации, количество больных СД в мире к 2030 г. увеличится до 552 млн человек, из них 90% – пациенты с СД2. Тяжесть СД2 обусловлена генерализованным поражением сосудистой системы с развитием множественных микрососудистых (нефропатия, ретинопатия) и макрососудистых осложнений (ишемическая болезнь сердца (ИБС), периферический атеросклероз). Частота и темпы развития сосудистых осложнений, помимо модифицируемых факторов (гипергликемии, артериальной гипертонии (АГ), дислипидемии), зависят от индивидуальных генетических особенностей, характеризующих большую или меньшую чувствительность индивидуума к повреждающему действию патологических факторов при СД. 

Диабетическая нефропатия (ДН) – одно из наиболее грозных осложнений СД, ведущее к прогрессивному снижению фильтрационной функции почек, итогом которого является развитие хронической почечной недостаточности (уремии). Классическим признаком ДН является повышение экскреции белка с мочой – микроальбуминурии (МАУ), а далее протеинурии (ПУ). Особенностью изучения почечных осложнений у пациентов с СД2 является гетерогенность патологии почек при этом типе заболевания, что практически не позволяет дифференцировать классическую ДН, основанную на определении экскреции белка, как при СД 1 типа (СД1) [2]. В настоящее время с целью диагностики почечной патологии введен термин ХБП, который представляет собой обобщающее наднозологическое понятие и позволяет оценить наличие и тяжесть поражения почек вне зависимости от причины повреждения. Под ХБП понимают наличие одного или более лабораторных, структурных или функциональных признаков повреждения почек длительностью ≥3 месяцев или изолированное снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) <60 мл/мин/1,73 м2. В нашем исследовании мы ориентировались на общепризнанную в мире классификацию ХБП и определяли ее наличие как стабильное (более 3 месяцев) снижение СКФ <60 мл/мин/1,73 м2 [3]. 

Ведущей причиной развития всех сосудистых осложнений СД, в том числе ХБП, является хроническая гипергликемия. Однако у части пациентов поражение почек развивается и быстро прогрессирует, несмотря на удовлетворительный гликемический контроль, что указывает на влияние негликемических механизмов. Показана взаимо­связь уровня протеинурии, степени АГ и выраженности гломерулярного склероза [4]. В 1989 г. появились первые работы о возможности семейного наследования диабетической патологии почек [5]. Выделение данной категории больных позволило предположить значимое участие генетических факторов в развитии ДН и ХБП.

ХБП является второй, после сердечно-сосудистой патологии, причиной смертности больных с СД2. Контроль уровня гликемии и АД с использованием препаратов, блокирующих ренин-ангиотензиновую систему (РАС), могут замедлить прогрессирование, но не предупредить развитие патологии. Изучение генетической предрасположенности к ХБП представляет особую значимость именно с позиций прогнозирования и формирования групп риска на доклиническом этапе, когда патологические изменения потенциально обратимы. 

Современная стратегия исследования генетической предрасположенности к такой многофакторной патологии, как сосудистые осложнения СД, основана на изучении полиморфных маркеров генов-кандидатов – генов, продукты экспрессии которых участвуют в патогенезе данного заболевания. Полиморфный маркер (ПМ) гена – это вариабельный (изменяющийся) участок ДНК, связанный с неким фенотипическим признаком (например, АГ). Под ассоциацией генетического маркера с заболеванием понимают достоверные различия в распределении частот аллеля или парного набора аллелей (генотипа) у лиц с наличием и отсутствием патологии. 

Цель

Целью нашей работы было изучить распределение частот аллелей и генотипов комплекса полиморфных маркеров генов-кандидатов почечной патологии (I/D гена ACE, ecNOS4a/4b гена NOS3, I/D гена APOB, ε2/ε3/ε4 гена APOE, pro12ala гена PPARG2, rs5219 гена KCNJ11, rs12255372 гена TCF7L2 и rs13266634 гена SLC30A8) у пациентов с СД2 с наличием и отсутствием ХБП, и оценить информативность их исследования в качестве маркеров прогнозирования поражения почек при СД2. 

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 435 пациента с СД2 русской популяции, включенных по принципу «случай–контроль». Выборка была этнически однородна. Первая группа (n=253) формировалась при помощи неперекрывающихся критериев отбора: пациенты с ХБП при длительности СД2 менее 5 лет («ХБП+», n=78) и пациенты без ХБП с СД2 более 10 лет («ХБП-», n=175). В этой группе исследовали ПМ I/D гена ACE, ecNOS4a/4b гена NOS3, I/D гена APOB, e2/e3/e4 гена APOE. Во 2-й группе (n=182) пациенты были распределены на подгруппы «ХБП+» и «ХБП-» (n=38 и n=144) вне зависимости от длительности СД, исследовали ПМ pro12ala гена PPARG2, rs5219 гена KCNG11, rs12255372 гена TCF7L2, rs13266634 гена SLC30A8. Такой подход к созданию групп с использованием «полярных» фенотипов применялся в связи с тем, что ХБП, особенно при СД2, является многофакторным заболеванием, чтобы снизить маскирующее влияние негенетических факторов риска, из которых длительность воздействия гипергликемии является одним из наиболее значимых. Наличие ХБП определяли как стойкое снижение СКФ <60мл/мин/1,73 м2, рассчитанной по стандартной формуле MDRD. 

Все пациенты дали информированное согласие, проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ Эндокринологический научный центр.

Идентификация аллелей проводилась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (г. Москва). Олигонуклео­тидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (г. Москва). Амплификацию с известными условиями работы праймеров проводили с помощью ПЦР «в реальном времени» и на термоцикле. Температуру отжига праймеров варьировали в зависимости от амплифицируемого локуса. Условия ПЦР и последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в табл. 1.

Aмплифицированные аллели полиморфных локусов идентифицировали после электрофоретического разделения в 12% полиакриламидном или 2% агарозном геле, который затем окрашивали бромистым этидием. Наблюдаемое распределение генотипов проверяли на отклонение от равновесия Харди-Вайнберга. 

Статистический анализ распределения частот аллелей и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (χ2). Клинические параметры оценивали при помощи критерия Стьюдента, методом χ2 с поправкой Йейтса. Достоверными считали различия при p<0,05. Риск развития ХБП рассчитан по Клопперу-Пирсону. 

Результаты

Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 2. Все пациенты были сопоставимы по возрасту, полу, ИМТ. В группах «ХБП+» по сравнению с пациентами без ХБП отмечался достоверно более низкий HbA1c, что, по всей видимости, отражает возможность частого развития гипогликемий при снижении фильтрации, нежели лучший контроль углеводного обмена. У пациентов с ХБП отмечался более высокий уровень альбуминурии, триглицеридов и САД (основных негликемических факторов риска прогрессирования ХБП) и большая частота ретинопатии как следствие сочетанного поражения органов-мишеней. 

Распределение частот генотипов в выборке «ХБП-» по всем полиморфизмам соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Достоверную ассоциацию с развитием ХБП показали маркеры 4 генов. 

Маркер ecNOS4a/4b гена NOS3 (эндотелиальной синтетазы оксида азота): аллель 4а и генотип 4а/4а достоверно чаще встречались в группе пациентов «ХБП+», оказывая предрасполагающее влияние на риск развития ХБП: OR=2,26, ДИ 95% 1,45–3,54; OR=9,88, ДИ 95% 2,05–47,72 соответственно, аллель 4b и генотип 4b/4b, напротив, имели протективное значение: OR=0,44, ДИ 95% 0,29–0,69; OR=0,45, ДИ 95% 0,26–0,77 соответственно (табл. 3). 

Мы также провели анализ распределения генотипов маркера ecNOS4a/4b гена NOS3 в зависимости от уровня альбуминурии. Данные представлены на рис. 1. Достоверной ассоциации выявлено не было, что может указывать на различные генетические детерминанты основных клинических маркеров патологии почек – альбуминурии и СКФ. 

Маркер I/D гена APOB (аполипопротеина В): частота носительства генотипа DD гена APOB у пациентов с ХБП была достоверно ниже: 2,7% vs 12%, p=0,02. При использовании доминантной модели наследования установлено, что носительство генотипа DD гена APOB имеет протективное значение (OR=0,20, ДИ 95% 0,05–0,88), при этом в отсутствие данного генотипа риск развития ХБП повышается в 5 раз по сравнению с носителями генотипа DD (уровень значимости р=0,02, OR=5,0, ДИ 95% 1,14–21,98). Данные представлены в табл. 3.

Маркер rs12255372 гена TCF7L2: частота аллеля T и генотипа T/T была выше у пациентов с ХБП. При анализе рецессивной модели наследования генотип T/T предрасполагает к развитию ХБП с уровнем значимости р=0,03, OR=3,03, ДИ 95% 1,07–8,58, и напротив, носительство любого из генотипов G/G или G/T снижает вероятность развития осложнения OR=0,33, ДИ 95% = 0,12–0,94. Данные представлены в табл. 4.

Маркер rs5219 гена KCNJ11: аллель А достоверно чаще встречался у пациентов с ХБП, аллель G – в группе без ХБП. Установлена достоверная ассоциация этого маркера с развитием ХБП, уровень значимости р=0,03. Аллель А предрасполагает к развитию ХБП: OR=1,74, ДИ 95% 1,04–2,91, аллель G защищает OR=0,57 (95% ДИ 0,34–0,96). При анализе рецессивной модели наследования с уровнем значимости р=0,04, χ2=4,19 генотип А/А повышает риск развития ХБП OR=2,25, ДИ 95% 1,02–4,97, носительство любого из генотипов A/G или G/G защищает от ХБП OR=0,44, ДИ 95% 0,2–0,98. Данные представлены в табл. 4.

Статистически достоверной ассоциации маркеров других исследованных генов: ACE (гена ангиотензинпревращающего фермента), APOE (гена аполипопротеина Е), PPARG2 (гена рецептора активатора пролифератора пероксисом), SLC30A8 (гена белка-транспортера цинка типа 8) с развитием ХБП при СД2 в нашем исследовании не получено. 

Мы также оценили частоту развития ХБП у пациентов с различным набором генотипов риска исследованных генов. Данные представлены на рисунке 2. 

Для группы 1 (n=253) генотипы риска это: NOS – 4a/4a, APOB – I/I или I/D, APOEe3/e3, ACE – D/D (последние 2 гена, не показавшие достоверной ассоциации в нашем исследовании, – по данным литературы). Так, у пациентов с отсутствием генотипов риска ХБП развилась только у 4 пациентов, в пересчете на риски: OR=0,23, у пациентов с одним генотипом риска частота ХБП составила 25%, OR=0,77, с двумя генотипами риска – 19,4%, OR=0,47, с тремя – 35,4%, OR=1,62, и у пациентов с полным набором четырех генотипов риск ХБП был максимальным – 44%, OR=2,13. При распределении пациентов из 2-й группы (n=182) была получена аналогичная тенденция: при отсутствии генотипов риска генов TCF7L2 и KCNJ11 частота развития ХБП составила 17%, OR=0,35, у пациентов с одним генотипом риска – 31%, OR=2,04 и при наличии двух генотипов риск ХБП возрастал более чем в 13 раз – 67%, OR=13,81

Обсуждение

Работы, посвященные изучению генетических маркеров патологии почек у пациентов с СД2, немногочисленны и очень противоречивы. И связано это не столько с разнородностью этнических групп или межпопуляционными различиями результатов исследований. В первую очередь, само определение поражения почек у пациентов с СД2 вызывает значительные сложности. В условиях многофакторности поражения органов-мишеней при СД2, значительной частоты сопутствующей сердечно-сосудистой патологии, АГ, мочевой инфекции, широкого использования средств, блокирующих ренин-ангиотензиновую систему (РАС), что значимо влияет на оценку экскреции белка, выделение классической ДН крайне затруднительно. В этой связи использование классификации ХБП в качестве основного критерия формирования групп сравнения представляется нам наиболее оптимальным выбором. 

На чем основано влияние полиморфизма генов на развитие той или иной патологии и, соответственно, возможность изучения и оценки рисков? Полиморфный маркер гена представляет собой вариабельный участок ДНК, носительство определенного варианта которого вызывает изменение продукта экспрессии гена (активность фермента или белка-транспортера), что, в свою очередь, непосредственно или, чаще всего, опосредованно, изменяет некий фенотипический признак. Однако наличие аллеля или генотипа риска per se не приводит к развитию заболевания, только при определенной комбинации аллелей и генотипов генетическая предрасположенность может реализоваться в фенотип патологии под воздействием патологических средовых факторов. Поскольку вклад одного гена может быть ничтожно мал, наибольшие перспективы в изучении генетических факторов представляет комплексный полигенный подход. Как правило, в исследование включаются полиморфные маркеры тех генов, которые кодируют модуляторы изучаемой патологии, известные на основе патогенеза заболевания. 

В нашем исследовании достоверную ассоциацию с развитием ХБП показали маркеры генов, кодирующих ключевые медиаторы повреждения почек: факторы эндотелия (ген NOS3), факторы липидного обмена (ген APOB), факторы секреции инсулина (KCNJ11, TCF7L2). 

Традиционно в патогенезе патологии почек при СД важнейшую роль отводят эндотелиальной дисфункции, ведущей к гиперактивации РАС и нарушению продукции вазопротективных факторов. Синтез основного вазопротективного фактора эндотелия – оксида азота (NO) обеспечивает фермент NO-синтетаза. Влияние варианта 4a связано с нарушением экспрессии гена NOS3, что приводит к уменьшению выработки NO. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы: установлена ассоциация маркера ecNOS4a/4b гена NOS с развитием ХБП [6], с прогрессированием до терминальной стадии поражения почек, требующей проведения заместительной почечной терапии, OR=1,74, и с ДН у пациентов с СД2, OR=2,03 [7]. Для данного полиморфизма также описана ассоциация с различной сердечно-сосудистой патологий: атеросклерозом, ИБС, инфарктом миокарда (ИМ) и АГ при СД 2 [8].

Наиболее изученным геном, кодирующим вазоактивные факторы эндотелия, является ACE, полиморфизм типа вставка/отсутствие вставки (I/D, insertion/deletion). Данный полиморфизм связан с уровнем ангиотензинпревращающего фермента и, соответственно, регулирует продукцию ангиотензина II – ключевого фактора развития и прогрессирования гломерулосклероза. К настоящему времени накоплено множество данных о наличии ассоциации I/D полиморфизма ACE с сосудистыми осложнениями СД: ДН, ИБС и инфарктом миокарда. По данным метаанализа, включившего исследования за 10-летний период и 14727 пациентов с СД, генотип DD гена ACE является независимым фактором риска развития ДН при СД1 и СД2 [9]. В нашей работе статистически значимых различий между группами ХБП при СД2 выявлено не было, в отличие от проведенного нами ранее исследования, где полиморфизм I/D гена ACE показал сильную связь с развитием ДН при СД1 [10]. Это может быть обусловлено как недостаточной выборкой для проявления ассоциации при СД2, так и принципиально разным подходом к формированию групп сравнения, основанным на оценке экскреции белка – при СД1 и скорости фильтрации – при СД2. Возможно, основные клинические маркеры патологии почек – альбуминурия и СКФ, вследствие различных механизмов регуляции, могут иметь и различные генетические детерминанты. 

Ген APOB кодирует аполипопротеин В – структурный апобелок основных атерогенных фракций липидов – хиломикронов, липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), который является лигандом для рецепторов ЛПНП, опосредуя поступление холестерина внутрь клетки. В литературе широко обсуждается роль дислипидемии в качестве предиктора прогрессирования патологии почек [11]. Центральная роль, которую аполипопротеин В (apoB) играет в транспорте липидов, позволяет предположить, что носительство определенных аллельных вариантов гена APOB может быть одной из причин, определяющих индивидуальные различия в уровне липидов. Мы исследовали I/D полиморфизм сигнального пептида, связанный с делецией трех кодонов Лей-Ала-Лей в положении -14/-16. Изменения структуры сигнального пептида могут влиять на способность транспорта аpоВ через мембраны, тем самым повышая атерогенные свойства крови. Процессы гломеруло- и атеросклероза имеют общие механизмы развития. Для аллеля D, показавшего достоверную ассоциацию с ХБП в нашем исследовании, обнаружена ассоциация с развитием атеросклероза [12].

Ген APOE кодирует аполипопротеин Е, который также играет важную роль в метаболизме липидов. Его основная функция – транспорт холестерина к тканям от мест его синтеза или всасывания. Aполипопротеин E существует в трех изоформах: E2, E3 и E4, которые кодируются одним геном (APOE). В проведенном нами ранее исследовании была выявлена ассоциация полиморфного маркера ε2/ε3/ε4 гена APOE с развитием ДН при СД1 [13]. В зарубежных работах описана ассоциация данного маркера с развитием ДН при СД2 [14]. В нашей работе при СД2 значимой ассоциации с развитием ХБП установить не удалось. Вследствие наличия трех изоформ, данный маркер наиболее сложен в техническом выполнении, что требует значительного увеличения выборки для выявления статистически значимых различий. 

Однако наибольший интерес из полученных результатов, на наш взгляд, представляют маркеры генов, которые традиционно не связывались с патогенезом ХБП – KCNJ11 и TCF7L2.

Продукт гена KCNJ11– белок Kir6.2 – является одной из двух субъединиц АТФ-зависимых калиевых каналов, регулирующих секрецию инсулина путем изменения потенциала клеточной мембраны. Полиморфный маркер rs5219 гена KCNJ11 ассоциирован с различными фенотипами нарушений углеводного обмена: от гиперинсулинемии и неонатального диабета до снижения секреции инсулина при СД2. Влияние данного полиморфизма на риск развития сосудистых осложнений, в том числе, ХБП, активно обсуждается в связи с тем, что данный тип калиевых каналов обнаружен не только в β-клетках, но также в стенке сосудов [15]. Мутации в гене KCNJ11 приводят к структурной модификации белка Kir6.2, что возможно, определяет индивидуальные различия в степени восприимчивости к патологическим эффектам гипергликемии. 

Ген TCF7L2 кодирует транскрипционный фактор 7, подобный фактору 2, который является сигнальным белком передачи информации в клетке. TCF7L2 может оказывать влияние на пролиферацию и дифференцировку β-клеток, и, что крайне важно, участвует в транскрипции гена проглюкагона, увеличивая продукцию глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1). Традиционно TCF7L2 ассоциировали с развитием ожирения и маркерами воспаления. Позднее два однонуклеотидных полиморфизма – rs12255372 и rs7903146 гена TCF7L2 показали сильную ассоциацию с развитием СД2 [16]. Гипергликемия и воспаление являются ключевыми в патогенезе сосудистых осложнений и поражения почек при СД. Кроме того, нарушение секреции ГПП-1 в настоящее время рассматривается не только как фактор развития СД, но и наиболее перспективный предиктор и терапевтический субстрат поражения почек при СД [17]. Ассоциация гена TCF7L2 c ХБП показана на японской популяции [18]. Также хотелось бы отметить исследование, в котором изучали связь 18 генетических маркеров СД2 с развитием нефропатии, показавшее ассоциацию маркеров генов KCNJ11 и TCF7L2 с низким уровнем СКФ, но не с альбуминурией [19], что подтверждает нашу гипотезу о различных генетических детерминантах клинических маркеров ХБП.

Для ряда классических генов-кандидатов поражения почек (ACE, NOS3) показана сочетанная генетическая предрасположенность к развитию СД, что может свидетельствовать об общих патогенетических механизмах развития СД и его осложнений. Поэтому мы включили в поиск генетической предрасположенности к ХБП гены PPARG2 и SLC30A8.

Ген PPARG2 кодирует ядерный рецептор, посредством которого регулируется синтез жирных кислот, TNF-α, резистина, адипонектина, факторов адипогенеза. Комплекс PPARγ с ретиноидным Х рецептором (RXR) связывается с PPAR-связывающими структурными элементами в промоторных областях генов-мишеней, регулируя их экспрессию. Мутации в гене PPARG являются причиной PPARγ лиганд-резистентного синдрома, который проявляется комплексом клинических симптомов: инсулинорезистентности, дислипидемии, гипертензии, увеличения массы тела и нарушения гомеостаза глюкозы. Показана ассоциация полиморфизма гена PPARG2 с СД2 [20]. В нашем исследовании ассоциации гена с риском ХБП получено не было.

Продуктом гена SLC30A8 является белок-транспортер цинка типа 8 (ZnT-8), который регулирует концентрацию ионов цинка в β-клетках, необходимых для секреции инсулина. Цинк играет важную роль в регуляции созревания, хранения и секреции инсулина β-клетками. Вовлеченность гена SLC30A8 в развитие СД2 показана в нескольких крупномасштабных исследованиях [20]. К сожалению, выявить ассоциацию гена с риском ХБП нам не удалось. 

При подсчете отношения шансов развития ХБП было выявлено, что риск развития ХБП зависел от количества генотипов риска: при отсутствии генотипов риска (носительстве только защитных вариантов) – относительный риск ХБП был минимальным: OR=0,23 и 0,35 в 1-й и 2-й группе соответственно и прогрессивно возрастал по мере увеличения количества генотипов риска до OR=2,13 и 13,8. Безусловно, для построения шкал риска ХБП данных недостаточно – необходимы исследования на большей выборке пациентов. Тем не менее, результаты нашей работы еще раз подтверждают полигенный характер развития ХБП. 

Заключение

В результате исследования установлено, что развитие ХБП при СД2 генетически детерминировано. Выявлена достоверная ассоциация риска ХБП с генами, кодирующими факторы эндотелия (NOS3), факторы липидного обмена (APOB) и факторы секреции инсулина (KCNJ11, TCF7L2), продукты экспрессии которых участвуют в основных патогенетических механизмах поражения почек при СД. При комплексном анализе изученных маркеров определяющее значение имело накопление генотипов риска: при наличии только защитных генотипов риск ХБП был очень низким и прогрессивно повышался при накоплении генотипов риска, что позволяет предложить использовать данную панель полиморфных маркеров в качестве генетического диагностикума с целью прогнозирования ХБП и формирования групп риска развития патологии на доклиническом этапе.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов в связи с написанием данной статьи. 

Исследование проведено в рамках НИР при поддержке ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России.