Изучение влияния сулодексида на эндотелий-зависимую вазодилатацию мозговых сосудов у животныхсо стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом

Цель

Изучить влияние сулодексида на эндотелий-зависимую вазодилатацию (ЭЗВД) мозговых сосудов у животных с экспериментальным сахарным диабетом (ЭСД).

Материалы и методы

Исследование было выполнено на 45 крысах – самцах линии Wistar с массой 180–210 г, разделенных на 3 равные группы: группа интактных животных, группа с ЭСД, получавших физиологический раствор, группа животных с ЭСД, которым per os в течение 4 недель вводился сулодексид – 30 ЕВЛ (Vessel Due F фирмы Альфа Вассерман – Италия). ЭД моделировалась развитием ЭСД. ЭСД вызывали путем однократного внутривенного введения стрептозотоцина (50 мг/кг). В дальнейший эксперимент отбирались животные с уровнем глюкозы в крови 12–15 ммоль/л. Через месяц после моделирования ЭСД и введения сулодексида осуществлялось тестирование эндотелий-зависимой и эндотелий-независимой вазодилатации путем регистрации кровотока в сосудах мозга в проекции средней мозговой артерии [2], а также индексов Пурселло и Госслинга, до и после внутривенного введения ацетилхолина (АХ) («Acros organics», США) (0,001 мг/кг), L-аргинина (300 мг/кг) («Acros organics», США), нитроглицерина (НГ) (МТХ, Москва) (0,007 мг/кг), нитро-L-аргинина (10 мг/кг) («Acros organics», США). Регистрация кровотока во всех экспериментах осуществлялась с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 с рабочей частотой 25 мгц и рабочей компьютерной программы ММ-Д-К-Minimax Doppler v.1.9. (Санкт-Петербург, Россия). В серии иммуногистохимических исследований была изучена экспрессия антител к е-NOS и эндотелину-1. Иммуногистохимическую подготовку и исследование образцов проводили по рекомендациям производителя используемых в данной работе антител (компания Novocastra™). Для гистологического исследования через 4 недели от начала эксперимента под эфирным наркозом производили забор головного мозга крыс. Материал фиксировали в течение 48 ч в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4). После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике.

Далее с использованием моноклональных антител к эндотелину-1 (Endothelin-1 Receptor (ETA), Clone RJT 24, NCL-L-ETA P (HIER)) и моноклональных антител к эндотелиальной NOS (Nitric Oxid Synthase, Clone RN5, NCL-NOS-3 F P (HIER)) и непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов определяли экспрессию и оптическую плотность полученных образцов. Микрофотосъемку производили цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива ×40, ×100 и окуляра ×10. Оценивали процентное отношение иммунопозитивных клеток к общему количеству эндотелиальных клеток мозга.

Результаты всех опытов обрабатывались методами базисного статистического анализа в программе STATISTICA/w7.0 фирмы StatSoft, Inc. (США) для Windows.

Результаты и их обсуждение

Результаты, отражающие реакции мозговых сосудов (по изменению скорости мозгового кровотока), эластичность (индекс Госслинга) и сопротивление церебральных сосудов (индекс Пурселло) в ответ на введение анализаторов (ацетилхолина, нитро- L-аргинина, L-аргинина) у животных контрольной группы без ЭСД, у животных с ЭСД, получавших физиологический раствор, животных с ЭСД, получавших в течение месяца после введения стрептозотоцина сулодексид, представлены в таблицах 1 и 2. У животных с ЭСД по сравнению с животными интактной группы при введении ацетилхолина отмечалось значительное снижение ЭЗВД (в 2,58 раза) и практически неизменная эндотелий-независимая вазодилатация (при введении нитроглицерина), что согласуется с литературными данными [3].

У животных на фоне ЭСД наблюдали также достоверное повышение индексов сопротивления сосудов (индекс Пурселло) и эластичности сосудистой стенки (индекс Госслинга), что согласуется с литературными данными [4]. Очевидно, у животных с ЭСД меньше выделяется оксида азота, наблюдается меньшее увеличение кровотока (меньшее расширение сосудов), а в ответ на введение блокатора e-NOS – меньшее падение кровотока, чем у животных интактной группы. Степень сужения мозговых сосудов и падение кровотока в них в последнем случае зависят от уровня исходной активности e-NO-синтазной системы, т.е. чем она активнее синтезирует NO, тем больше при блокаде NO-синтезирующего фермента будет сужение сосудов и падение кровотока. Другим показателем, свидетельствующим о наличии ЭД, являлся L-аргининовый парадокс [5]. Суть L-аргининового парадокса можно сформулировать следующим образом: при нарушении функции эндотелия отмечается повышение уровня асимметричного диметиларгинина (АДМА), конкурентно нарушающего транспорт L-аргинина в эндотелиоцит и угнетающего e-NOS [5]. Дополнительное введение эндогенного L-аргинина на фоне эндотелиальной дисфункции приводило к преодолению этих барьеров и усилению синтеза, выброса NO и к более выраженной вазодилатации, тогда как в норме, т.е. в отсутствие больших количеств АДМА в крови, дополнительное введение L-аргинина не вызывало значимого увеличения синтеза NO, т.к. эндотелиоцит получает достаточное количество субстрата для продукции оксида азота.

В нашем исследовании, при дополнительном введении L-аргинина, мы наблюдали его вазодилатирующее действие у животных с ЭСД, тогда как у интактных животных, а также у животных с ЭСД, получавших сулодексид, введение L-аргинина вызывает менее выраженную вазодилатацию. Таким образом, у животных с ЭСД, получавших сулодексид, ЭЗВД была значительно выше, чем у животных с ЭСД, получавших физиологический раствор (табл. 1).

У животных с ЭСД, получавших в течение 4 недель сулодексид, наблюдались более низкое сопротивление и более высокая эластичность мозговых сосудов (индексы Пурселло и Госслинга), по сравнению с животными с ЭСД без фармакологической коррекции. Несмотря на то, что регистрация сопротивления и жесткости сосудов осуществляется на небольшой сосудистой области, получены отчетливые данные о повышении жесткости сосудов при ЭСД и выраженном действии на этот фактор риска исследуемого препарата. Эти данные могут служить еще одним подтверждением положительного влияния сулодексида на вазодилатирующую функцию эндотелия (табл. 2).

Таким образом, снижение вазодилатирующей функции эндотелия у животных с ЭСД скорее обусловлено нарушением функционирования e-NO-синтазной системы, о чем свидетельствует меньшая вазодилатация (меньшее увеличение скорости кровотока) при введении ацетилхолина и меньшая вазоконстрикция при введении блокатора e-NO-синтазы N-L-аргинина.

При проведении иммуногистохимического исследования было отмечено, что в группе животных с ЭСД отмечалось слабое окрашивание к моноклональному антигену Clone RN5(e-NOS) иммунопозитивных клеток гематоэнцефалического барьера во всех отделах головного мозга и более выраженное окрашивание к моноклональному антигену Clone RJT (эндотелин-1). В группе животных, получавших сулодексид на фоне ЭСД, степень экспрессии антигенов отличалась от группы животных без фармакотерапии и приближалась по степени окрашивания к животным интактной группы (табл. 3).

При оценке оптической плотности уровень экспрессии Clone RN5 (еNOS) в группах животных с ЭСД был на 56,8% ниже, чем у интактных животных. У животных же, получавших сулодексид, данный показатель достоверно не отличался от группы интактных животных (табл. 4).

При оценке оптической плотности уровень экспрессии Clone RJT (эндотелин-1) в группе животных с ЭСД был на 39,9% выше, чем у интактных животных. При изучении морфологического материала мозга животных с ЭСД, получавших сулодексид, уровень оптической плотности Clone RJT недостоверно отличался от группы интактных животных.

Таким образом, снижение экспрессии еNOS и увеличение экспрессии эндотелина-1 как специфических маркеров эндотелиальных нарушений дает возможность говорить о развитии ЭД при ЭСД, а также о выраженном эндотелиопротективном действии сулодексида, который значительно увеличивал концентрацию eNOS, снижал уровень эндотелина-1 и, очевидно, вследствие этого улучшал ЭЗВД.

Выводы

1. При ЭСД наблюдалась выраженная ЭД, сопровождающаяся уменьшением количества eNOS и увеличением эндотелина-1, что, в свою очередь, приводило к снижению вазодилатирующей функции эндотелия, а также повышению сопротивления и жесткости сосудов.

2. Сулодексид увеличивал количество eNOS и снижал содержание эндотелина-1 в сосудах мозга животных с ЭСД, что улучшало вазодилатирующую функцию эндотелия у крыс с гормональной патологией на фоне введения сулодексида.