HLA-гаплотипы, аутоантитела к бета-клеткам: роль в прогнозировании сахарного диабета 1 типа (результаты 11-летнего наблюдения)

С 70-х годов ХХ века, когда была установлена аутоиммунная природа сахарного диабета 1 типа (СД1), не прекращаются попытки научиться его излечивать [1, 2]. Известная уже в течение 20 лет модель патогенеза СД1 Джорджа Айзенбарта к настоящему времени претерпела несколько уточнений (рис. 1) [3].

Предполагается, что до 50% случаев СД1 обусловлено генами HLA 2 класса [3, 4]. Генетическая предрасположенность является тем условием, на фоне которого «разворачиваются» впоследствии стадии заболевания. В общей сложности выделено более 20 генетических локусов, отвечающих за развитие СД1. Наибольший вклад среди остальных вносят: гены инсулина, гены CTLA-4, PTPN-22, выполняющие ключевую роль в координации иммунного ответа и др. [5] (CTLA-4 играет основную роль в механизме ответа Т-клеток на презентацию антигена, кодирует ко-стимулирующую молекулу, экспресс­ирующуюся на поверхности активизированного Т-лимфоцита. PTPN-22 кодирует тирозиновую фосфатазу Т-лимфоцитов, которая является внутриклеточным белком, экспрессия которой специфична для клеток иммунной системы и является одним из «негативных регуляторов» иммунной системы). Взаимодействие предрасполагающих генов с факторами окружающей среды происходит не только при инициации аутоиммунного процесса, а весь период до развития заболевания. На следующей стадии развивается инсулит, в результате которого происходит аутоиммунное разрушение b-клеток с появлением Т-активированных лимфоцитов, цитокинов и специфических антител. Течение ауто­иммунного процесса волнообразно с периодами затихания и новыми обострениями. В дальнейшем происходит снижение инсулиновой секреции, нарушение толерантности к углеводам и развивается манифестный СД1.

Отсюда возникает дилемма в прогнозировании и превентивной терапии СД1: на ранних стадиях аутоиммунного процесса эффективность превентивной терапии наиболее высока, однако, к сожалению, возможности методов прогнозирования низкие (в основном, по генетическим маркерам). На поздней доклинической стадии, когда существует почти 100-процентная вероятность развития заболевания, профилактические мероприятия малоэффективны [3].

На протяжении последних 20 лет в детском отделении ФГУ ЭНЦ проводятся исследования по прогнозированию развития СД в семьях больных. Рассчитаны индивидуальные риски в семьях и в популяциях. Так, в Российской популяции риск развития заболевания составляет 0,4%. Средний риск для родственников 1 степени родства больных СД1 составляет 5%. Он зависит от возраста манифестации диабета у членов семьи и равен 1,6% при возникновении заболевания у пробанда после 20 лет и 6,5% при манифестации диабета до 20 лет. Для HLA-идентичных сибсов риск развития СД1 составляет 16–18% [6, 7]. Абсолютный риск при наличии предрасполагающих гаплотипов колеблется от 18 до 50%, при появлении положительных аутоантител риск возрастает до 70%, а при появлении сниженной инсулиновой секреции – до 90% в течение 5–10-летнего наблюдения [8, 9].

Цель

Проспективное наблюдение групп риска по развитию СД1 (здоровые сибсы больных СД1) для выявления роли генетических и аутоиммунных нарушений в развитии заболевания.

Материалы и методы

В 143 дискордантных семьях больных СД1 у здоровых сибсов (n=171 чел., средний возраст – 11,9±5,8 лет) проведено исследование предрасполагающих и протективных гаплотипов (HLA-DRB1, DQ-генов) в комбинации с иммунологическими маркерами (ICA – аутоантитела к цитоплазматическим структурам β-клеток, IAA – аутоантитела к инсулину, GAD – аутоантитела к глутаматдекарбоксилазе).

Молекулярно-генетические исследования (изучение HLA-DRB1, DQ-генов) проведены у 599 больных СД1 случайной выборки (средний возраст – 7,5±6,2 лет). Контрольную группу составили 200 человек.

Обработку полученных данных проводили общепринятыми методами медицинской статистики с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0.

Результаты и их обсуждение

Первым этапом нашей работы было выделение предрасполагающих и защитных гаплотипов в отношении СД1 в Российской популяции на основании проведения молекулярно-генетических исследований у 599 больных СД1 детей и подростков. На рисунке 2 показаны частоты гаплотипов у больных СД1 и в популяции, а также относительный риск, характеризующий силу данного маркера. Выделено 5 предрасполагающих гаплотипов DRB1*4-DQA1*301-DQB1*302 (OP=4,7), DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201 (OP=2,7), DRB1*4-DQA1*301-DQB1*304 (OP=4,0), DRB1*1-DQA1*101-DQB1*501 (OP=1,9), DRB1*16-DQA1*102-DQB1*502/4 (OP=2,4) и 3 протекторных: DRB1*15-DQA1*102-DQB1*602/8 (OP=0,08), DRB1*11-DQA1*501-DQB1*301 (OP=0,14), DRB1*13-DQA1*103-DQB1* 602/8 (OP=0,16). Наши данные соответствуют европейским, где наиболее высокий риск определяют два гаплотипа: DRB1*4-DQA1*301-DQB1*302, DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201. На основании ранее проведенных исследований 105 дискондартных и 65 ядерных семей были выделены предрасполагающие и защитные гаплотипы у больных СД1, ассоциации для некоторых не были достоверны, и они были причислены в разряд нейтральных. Сейчас, благодаря увеличению выборки, ряд гаплотипов из нейтральных перешел в предрасполагающие: DRB1*16-DQA1*102-DQB1*502/4 (OP=2,4), DRB1*1-DQA1*101-DQB1*501 (OP=1,9).

На следующем этапе работы мы проанализировали, насколько отличается частота встречаемости предрасполагающих и защитных гаплотипов среди больных СД1 и их здоровых сибсов (рис. 3) в семьях больных. Оказалось, что частота предрасполагающих гаплотипов была на порядок ниже у здоровых сибсов по сравнению с больными: DRB1*4-DQA1*301-DQB1*302, DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201 – 45,6% и 31% по сравнению с 61,5% и 51,7% соответственно, что значительно превышает средний уровень заболеваемости среди сибсов – 6,4% и на порядок выше по сравнению с популяцией. Но в то же время частота защитных гаплотипов DRB1*15-DQA1*102-DQB1*602/8/DRB1*13-DQA1*103-DQB1*602/8 была выше у здоровых сибсов по сравнению с больными – 22,8% по сравнению с 4,9%, такая же, как в популяции – 22% (χ2=7,93-19,98 (p<0,001)). Это позволяет предполагать, что свою роль в подверженность заболеванию среди сибсов вносят и защитные гаплотипы, «как бы снижая у них уровень заболеваемости».

Далее была проанализирована частота выявляемости комбинаций генотипов (гаплотипов), определяющих более высокий риск развития заболевания, которые унаследовали здоровые и больные сибсы от своих родителей. По данным зарубежных исследований, наиболее высокий риск развития СД1 определяется гетерозиготным генотипом DQA1*0501-DQB1*0201/DQA1*0301-DQB1*0302 (DQ2/DQ8). Средний или умеренный риск определяется сочетанием гаплотипа высокого риска со всеми другими. А низкий риск отмечается у тех лиц, которые не имеют гаплотипов высокого риска и у которых отмечается наличие защитных и нейтральных гаплотипов [10]. По результатам наших исследований оказалось, что комбинации из 2 предрасполагающих гаплотипов (DQ2/DQ8) встречались в 2,5 раза чаще у больных – 32,9 и 13,5%, а отсутствие комбинаций предрасполагающих гаплотипов (Х/Х) наблюдалось в 2 раза чаще у здоровых сибсов по сравнению с больными – 18,9 и 36,8% соответственно. Комбинации DQ2/Х и DQ8/Х у здоровых и больных сибсов встречались с одинаковой частотой – 49,7 и 47,6% соответственно (χ2=6,95–12,29 (p<0,0001)). Возможно, необходимо увеличение выборки для получения более надежных данных, что выявит предположительно значимые различия.

На основании полученных данных HLA-типирования российской популяции были сформированы три группы риска среди здоровых сибсов из 143 дискордантных семей. Группу высокого риска (DQ2/DQ8) составили 13,5% здоровых сибсов. Группу среднего риска (DQ2/Х и DQ8/Х) – 49,7%, группу низкого риска (Х/Х) – 36,8%. По данным европейских исследований European Nicotinamide Diabetes Intervention Trial, комбинация гаплотипов высокого риска встречалась в 26%, среднего риска – в 49%, а низкого – в 15% случаев у родственников первой степени родства, что несколько отличается от результатов нашего исследования, что, возможно, связано с большой выборкой обследованных – 30 тыс. человек [8].

Следующим этапом нашей работы являлась диагностика инсулита в этих группах на основании исследования иммунологических маркеров (рис. 4). Для антител к глутаматдекарбоксилазе и к инсулину выявлено снижение частоты их встречаемости по мере уменьшения степени генетического риска. Так, GAD достоверно чаще определялись в группе с генотипом DQ2/DQ8 по сравнению с группой среднего и низкого генетического риска (65, 37,9, 18% соответственно; p<0,05). Антитела к инсулину, соответственно, выявлялись в 19, 12,9 и 3,7% случаев (p<0,05). Коэффициент корреляции Спирмена между частотой встречаемости антител к глутаматдекарбоксилазе и степенью генетического риска составил 0,32, р=0,00014. Для ICA такой закономерности не получено. Выявленная ассоциация комбинаций гаплотипов высокого риска с аутоантителами к инсулину и глутаматдекарбоксилазе подтверждена и другими международными исследованиями [11].

Известно, что наличие множественных антител определяет более высокий риск заболевания. Поэтому было проведено изучение частоты встречаемости комбинаций антител в группах различного генетического риска (рис. 5). Частота выявления одного, двух и трех видов антител также снижалась по мере снижения степени генетического риска. В группе высокого риска частота встречаемости 2 и 3 видов антител была выше, чем в группе среднего и низкого риска (26,1, 14,1, 11,1% соответственно, p>0,05; 8,7, 2,4, 0% соответственно; p<0,05), в группе низкого риска три вида аутоантител вообще не встречались. Один вид антител также чаще встречался в группе высокого риска по сравнению с другими (52,1, 27,6, 26,2% соответственно). По данным известного исследования Diabet Prevention Trial (DPT-1), для прогнозирования СД1 важно сочетание таких антител, как GAD и ICA – их титр и персистенция, а наличие антител к инсулину ассоциировано с низким риском развития заболевания [11]. По результатам исследований финских ученых, кумулятивный риск развития СД1 у ICA- и IAA-позитивных родственников 1 степени родства составил 59,6% в течение 5-летнего наблюдения по сравнению только с ICA-положительными – 10,8% [12].

По нашим данным, частота встречаемости определенных комбинаций, например как ICA+GAD, статистически значимо снижалась по мере снижения степени генетического риска – 13, 8,2 и 1,6% (p<0,05). В определенной степени такая же зависимость наблюдалась и для комбинации GAD с IAA – 8,7, 1,2 и 3,2% (p<0,05). Получена слабая корреляционная зависимость по Спирмену между количеством выявляемых антител и степенью генетического риска – r=0,17, р=0,029.

Наиболее убедительным доказательством роли генетических и иммунологических факторов в прогнозировании СД1 является изучение эволюции ранних доклинических стадий – наиболее сложный этап, требующий длительного проспективного наблюдения.

За 11-летний период наблюдения манифестация СД1 произошла у 11 человек (6,4%), что совпадает с данными финских ученых, где также у 6,8% из наблюдавшихся в течение 15-летнего периода сибсов произошла манифестация заболевания (51 человек из 775 обследованных) [13]. В нашем исследовании из групп высокого и среднего риска заболели 8,7 и 8,3% соответственно, а из группы низкого риска – 3,2%. Таким образом, среди заболевших в 82% случаях определялись гаплотипы высокого риска (генотип DQ2/DQ8 встречался в 18,2%, генотипы DQ2/Х и DQ8/Х – в 63,6% случаев) и только 18,2% заболевших не имели предрасполагающих гаплотипов. Полученные данные еще раз подтвердили, что наличие предрасполагающих гаплотипов важно для прогнозирования заболевания, однако и отсутствие этих гаплотипов не исключает в небольшом проценте развития СД, что может быть обусловлено влиянием других предрасполагающих генов [5]. Таким образом, в наших исследованиях генотипы HLA-DQ2/DQ8; DQ2/X; DQ8/X прогнозируют примерно с 8-процентной вероятностью риск развития СД1 на протяжении 11-летнего периода.

Кроме того, при анализе заболевших отмечено, что 73% были положительными по антителам, а 27% – отрицательными по аутоантителам на момент обследования. Интересно, что все сибсы из группы высокого генетического риска за 1–5 лет до манифестации были отрицательными по антителам, в то время как из группы среднего риска – в 85,7%, а из группы низкого риска – все 100% случаев имели положительные аутоантитела. При этом в группе среднего риска ICA определялись в 16,7%, GAD – в 66,6%, комбинация GAD+ICA – в 16,7% случаев, а в группе низкого риска в 100% случаев выявлялись только ICA в достаточно высоких титрах. Отсутствие антител у заболевших сибсов из группы высокого риска может быть объяснено ее небольшим количеством (n=2). Кроме того, отсутствие антител в доклинической стадии и при манифестации СД1 можно объяснить волнообразным течением аутоиммунного процесса или уже прошедшим разрушением основной массы β-клеток (уменьшением на их поверхности антигенных детерминант, вызывающих иммунологические реакции). По данным ряда исследований, прогностическая чувствительность определения GAD составляет 68% у сибсов и 50% в популяции, а кумулятивный риск – 61 и 24% соответственно в течение 15-летнего наблюдения [13].

Для оценки значимости аутоантител в диагностике ранних доклинических стадий СД1 была проанализирована частота их встречаемости у здоровых сибсов, у заболевших сибсов (до манифестации заболевания) и у больных в начальном периоде СД1 (рис. 6). Аутоантитела чаще определялись у заболевших до манифестации заболевания, чем у больных СД1 и у здоровых сибсов (сибсы, не развившие заболевание в течение всего периода наблюдения): 72,7, 48,6 и 31% соответственно (p<0,05). Такая же закономерность наблюдалась при анализе отдельных видов аутоантител, статистически значимая для антител к глутаматдекарбоксилазе, отмечаемая у заболевших и здоровых сибсов по сравнению с пациентами в начальном периоде СД1, у которых инсулит уже мог затихнуть в силу времени (средняя длительность заболевания на период забора крови на антитела у них составила 3 мес.): 54,5, 27 и 34,6% соответственно (p<0,05). Полученные данные свидетельствовали об аутоиммунном процессе, происходящем более активно на доклинической стадии у заболевших сибсов до манифестации СД и подтвердили важность иммунологических маркеров в прогнозировании СД1.

Приведем два клинических примера эволюции антител у заболевших сибсов.

Пример первый (рис. 7). У здорового сибса 5 лет за 4 года до манифестации СД1 был выявлен умеренно повышенный титр антител к глутаматдекарбоксилазе – 1,13 Eд/л, нарастающий в течение 1 года с последующим снижением до нормального уровня в течение второго года на фоне соблюдения диеты и приема никобиона. Однако после перенесенного ОРВИ стало наблюдаться нарастание титра GAD с последующим развитием заболевания. При этом ICA, IAA были отрицательными. Перед манифестацией отмечалось снижение уровня С-пептида до 0,17 нг/мл. Этот пример демонстрирует волнообразное течение инсулита и роль вирусной инфекции в его обострении с последующей манифестацией СД1.

Второй пример (рис. 8): у здорового сибса 8 лет за 18 месяцев до развития заболевания был зарегистрирован очень высокий титр ICA — 120 Ед с дальнейшим нарастанием до 140 Ед и последующим резким падением до 20 Ед. Принято считать, что падение титра антител является благоприятным прогностическим фактором в отношении ближайшей манифестации заболевания. Однако у ребенка через 6 месяцев развился СД. При этом при манифестации заболевания также отмечался отрицательный титр IAA и GAD к инсулину и глутаматдекарбоксилазе, как и в предыдущем примере. По-видимому, падение титра антител было вызвано в данном случае уменьшением пула β-клеток. С практической точки зрения это представляет интерес, поскольку быстрое падение титра антител с высоких значений должно настораживать врача в возможности манифестации СД1 в ближайшее время.

Для сравнения с заболевшими сибсами на рисунке 9 представлен мониторинг антител к островковым клеткам у отдельных здоровых сибсов. При этом важно отметить, что в большинстве случаев при высоких титрах ICA, выявленных при первичном скрининге, происходило их снижение при дальнейших визитах в большинстве случаях, но за более длительный период (в течение 1–2 лет) или, как в случае с сибсом 1, сочеталось с отрицательными титром других антител. При мониторинге ICA следует отметить, что только в 14% случаях сибсы оставались положительными по антителам, в 16% – отрицательными и только в 8% случаев происходила сероконверсия в положительную сторону.

Полученные данные еще раз подтвердили, что наличие DQ2, DQ8 гаплотипов у здоровых сибсов прогнозирует высокий риск развития СД1, однако и отсутствие этих гаплотипов не защищает полностью от развития заболевания. Эти данные необходимо учитывать при проведении медико-генетического консультирования. Наличие при этом положительных аутоантител в значимом титре свидетельствует о возможном влиянии других генетических факторов, кодирующих разные звенья аутоиммунного процесса и требующих дальнейшего изучения. Среди заболевших частота выявления и титр аутоантител были выше, чем у сибсов, не развивших заболевание, что свидетельствует о важности иммунологических маркеров в прогнозировании СД1. Кроме того, необходимо учитывать волнообразное течение аутоиммунного процесса на ранних стадиях СД, что требует тщательного мониторинга иммунологических показателей.

Оценка риска развития СД1 на основе определения молекулярно-генетических и мониторинга иммунологических маркёров является первым этапом в разработке профилактических мероприятий, направленных на отсрочку или предотвращение развития заболевания.