Полиморфизм генов II, V факторов свертывания крови и метилентетрагидрофолатредуктазы у больных с диабетической нефропатией: распространенность, клиническое и прогностическое значение

Диабетическую нефропатию (ДН), являющуюся следствием специфического (микроангиопатия) поражения почек при сахарном диабете (СД), относят к острейшим медико-социальным проблемам и приоритетам национальных систем здравоохранения большинства стран мира из-за ее распространенности (страдает по меньшей мере 30–40% больных СД 1 типа (СД1) и 20–30% − СД 2 типа (СД2)), а также практически облигатного прогрессирования, ведущего к развитию гломерулосклероза и хронической почечной недостаточности (ХПН) [1–3].

В настоящее время ДН − самая частая причина ХПН. В гемодиализных центрах развитых стран больные СД (35–40%) вытеснили на вторую-третью позицию пациентов с такими первичными заболеваниями почек, как гломерулонефрит, пиелонефрит и поликистоз [4–6]. Впечатляющие успехи клинической эндокринологии, достигнутые в последние десятилетия, обнажили парадоксальную ситуацию, которая складывается таким образом, что чем лучше мы лечим пациентов с СД, тем большее их число доживает до пожилого возраста и той стадии развития болезни, при которой высока вероятность развития ХПН. Ближайшее будущее сулит лишь усугубление проблемы − распространенность диабетического гломерулосклероза возрастет, и, по-видимому, необходимо быть готовыми к тому, что через 10-20 лет каждый второй, нуждающийся в заместительной почечной терапии, будет пациентом с ДН. В связи с этим становится понятной высокая потребность в фундаментальных и прикладных исследованиях, направленных на разработку вопросов патогенеза, диагностики, профилактики и лечения ДН.

В патогенезе ДН тесно переплетены метаболические, гемодинамические, гемостатические, иммунные и другие факторы, многие из которых генетически детерминированы. Однако, если о генетической предрасположенности к развитию определенного типа СД, его формы (например, моногенные формы или MODY-типы СД, митохондриальный диабет, а также его специфические формы, связанные с генетическими дефектами в действии инсулина) хорошо известно, то роль генетической конституции в подверженности (или, наоборот, защищенности) к реализации варианта заболевания с поражением почек изучена в значительно меньшей степени [7–10]. В частности, остается открытым вопрос о частоте встречаемости у больных ДН генетически обусловленных гематогенных тромбофилий, а также их клиническом и прогностическом значении.

Целью настоящего исследования явилось изучение распространенности, клинического и прогностического значения у больных ДН протромботических генотипов, господствующих в структуре врожденных тромбофилий.

Материалы и методы

В настоящей работе использованы данные, полученные при обследовании в стационарных условиях (показаниями к госпитализации являлись выраженная декомпенсация углеводного обмена или прогрессирование сосудистых осложнений) 90 пациентов с ДН, осложняющей в 54 случаях СД1 и в 36 − СД2. Программа исследования включала рутинные клинические и лабораторные тесты, принятые в эндокринологической и нефрологической клиниках. Клиническая ха­ра­ктеристика обследованных больных представлена в таблице 1.

Для суждения о нормальных параметрах изучаемых показателей обследовано 100 здоровых лиц (контрольная группа) с демографическими характеристиками, сходными с таковыми у больных СД1 [11].

Материалом для изучения частоты встречаемости однонуклеотидной замены С677Т в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), точечной мутации (G1691А) гена фактора V свертывания крови (FV), получившей название FV Leiden (лейденская мутация), а также мутации G20210A в 3′-нетранслируемой области гена фактора II свертывания крови (FII) послужили образцы геномной ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции. Для выявления полиморфизма гена FII и FV Leiden, а также для генотипирования варианта С677Т в гене MTHFR использовали метод полимеразной цепной реакции с по­следующим рестрикционным анализом. Продукты амплификации и рестрикции разделяли с помощью электрофореза соответственно в 2-процентном агарозном и 7-процентном полиакриламидном гелях, окрашивая бромистым этидием. В работе были использованы комплекты реагентов, включающие специфические праймеры и рестриктирующие эндонуклеазы, любезно предоставленные сотрудниками группы фармакогеномики (руководитель – М.Л. Филлипенко) Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск. При статистической обработке данных применяли пакет программ «Биостатистика» 4.03. Количественные данные представлены в виде медианы – 25 и 75 процентилей (Ме [LQ;UQ]), качественные − в виде n, % (число больных с данным признаком, процент от их количества в группе) или десятичной доли единицы. Нулевую гипотезу о равенстве долей (в том числе соответствие эмпи­рического распределения частот генотипов по всем изу­ченным локусам теоретически ожидаемому, рассчитанному по формуле Харди-Вайнберга) проверяли с помощью критериев χ2 и Ζ. Анализ повторных измерений проводили с помощью критерия Вилкоксона. Силу связи между изучаемыми количественными показателями и ее направленность выражали через коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для бинарных признаков по четырехпольной таблице вычисляли отношение шансов (ОR) c 95-процентным доверительным интервалом (95% ДИ).

Результаты и их обсуждение

Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов позволил выявить в проанализированных образцах геномной ДНК три генотипа полиморфного локуса MTHFR (табл. 2). При этом установленное распределение генотипов и частоты мутантного аллеля гена MTHFR во всех группах соответствовало ожидаемому с учетом равновесия Харди-Вайнберга. Гетерозиготный вариант однонуклеотидной замены – цитозина на тимин, приводящей к аминокислотной замене аланина на валин, в положении 677 (С677Т) у пациентов с ДН обнаруживался чаще, чем у здоровых. При этом у больных СД2 различие с контрольной группой по встречаемости данного протромботического генотипа достигало уровня статистической значимости.

Как известно, полиморфизм С677Т в гене MTHFR наследуется по аутосомно-рецессивному типу и сопряжен с нарушением реметилирования гомоцистеина и, как следствие, – с развитием гипергомоцистеинемии − одного из ключевых факторов риска гиперкоагуляционного синдрома и ангиопатии [12]. У больных хроническим гломерулонефритом гетерозиготный генотип С677T ассоциируется с высоким темпом утраты функционирующих нефронов и быстрым развитием терминальной стадии почечной недостаточности [13–14].

Результаты настоящего исследования позволяют обсуждать связь гетерозиготного варианта полиморфизма С677Т гена MTHFR у больных СД2 с формированием патологического фенотипа заболевания с поражением почек, так как у пациентов с однонуклеотидной заменой в гене MTHFR чаще (χ2=5,8; p=0,016) диагностировали IV стадию ДН по классификации Mogensen С.Е. и соавт. (1983), а 95% ДИ (1,29; 6,06) OR (2,84), располагающийся справа от единицы, указывает на то, что шанс развития ДН статистически значимо выше у пациентов с генетическим дефектом. Уровень гомоцистеина в крови больных СД с точечной мутацией в гене MTHFR превышал 15,0 ммоль/л и был взаимосвязан с повышением агрегации тромбоцитов, а также со снижением потенциала системы естественных антикоагулянтов (активность антитромбина III), что согласуется с данными литературы [12, 15–16]. В указанных работах убедительно показано, что концентрация гомоцистеина в крови пациентов с ДН обратно пропорционально связана с величиной клубочковой фильтрации и прямо пропорционально – с уровнем микроальбуминурии, однако нарушение метаболизма метионина с развитием гипергомоцистеинемии при ДН может не иметь связи с генетическим дефектом, а являться результатом нарушения почечной экскреции этой содержащей серу аминокислоты, т.е. быть не причиной, а следствием нефропатии.

При анализе полиморфизма гена FV распределение частот генотипов у больных ДН и лиц контрольной группы соответствовало распределению, прогнозируемому с учетом закона равновесия Харди-Вайнберга (табл. 3). Встречаемость аллеля 1691А (мутация FV Leiden), носительство которого предрасполагает к развитию тромбозов, связанных с врожденной резистентностью к активированному протеину С, у больных ДН, осложняющей СД1, была выше, чем в группе здоровых лиц. При этом гомозигот по мутантному аллелю гена FV ни в одном случае обнаружить не удалось. Мутация FV Leiden, при которой наблюдались прокоагулянтные сдвиги в состоянии системы гемостаза (количество и агрегационная функция тромбоцитов, концентрация фибриногена, протромбиновое отношение, каолиновое время), была ассоциирована с повышением вероятности развития у больных СД1 поражения почек (OR − 7,83, 95% ДИ − 2,87; 21,46). Так же как Wakim-Ghorayeb S.F. и соавт. [17], нам не удалось выявить различий между больными СД2 и здоровыми лицами по полиморфизму гена FV.

Результаты исследования полиморфизма G20210А гена FII представлены в таблице 4. Распределение этих генотипов во всех группах хорошо описывалось законом равновесия Харди-Вайнберга. Частота мутантного аллеля A20210 гена FII в контрольной группе составляла 3%, что соответствует верхнему уровню распространенности мутантного аллеля в Европе (1,8-3,5%) [18]. У обследованных нами больных СД2 генотип G/A встречался чаще, чем в контрольной группе (p<0,01). Протромботический генотип G/А, при котором наблюдается повышенное образование протромбина, ассоциировался с пятикратным повышением вероятности развития у больных СД2 поражения почек (95% ДИ OR − 3,12; 18,23), что противоречит результатам недавно опубликованного исследования, в котором показано отсутствие ассоциации полиморфизма G20210А гена FII с СД2 [17]. Однако прямому сравнению с указанным исследованием препятствует тот факт, что в него включались и пациенты без ДН.

У больных ДН риск образования микротромбов в капиллярах почек в 4 раза выше, чем у здоровых, поэтому высокая нефропротективная эффективность дезагрегантов и анти­коагулянтов у пациентов с СД, по-видимому, связана не только со способностью наиболее часто назначаемых препаратов ингибировать реакцию неферментативного гликозилирования структурных белков базальной мембраны клубочков (аспирин) и восстанавливать зарядоселективность почечного фильтра (сулодексид) [2, 4, 19], но и с их антитромботической активностью.

Предварительные результаты трехлетнего наблюдения за 45 пациентами с ДН позволяют отметить связь протромботических генотипов со скоростью депрессии функции почек. Так, изменение концентрации креатинина крови у больных СД c наличием изучаемых мутаций (n=30) составило 27,5 (20; 39) мкмоль/л, а динамика скорости клубочковой фильтрации была равной -10 (-33; 13) мл/мин (p<0,05 для всех сравнений), в то время как результаты анализа повторных измерений у пациентов без генетической аномалии (n=15) не были статистически и клинически значимыми.

Выводы

1. Мутации в генах (С677Т в гене метилентетрагидрофолатредуктазы, G1691A в гене фактора V свертывания крови и G20210A в гене фактора II свертывания крови), связанных с состоянием коагуляционного потенциала крови, встречаются у больных ДН с большей частотой, чем среди здоровых лиц.

2. Вероятность ДН у больных СД1 выше при наличии лейденской мутации (G1691А FV), а у пациентов с СД2 – повышается в связи с однонуклеотидной заменой С677Т в гене MTHFR и G20210A в 3′-нетранслируемой области гена FII.

3. Полиморфизмы генов FII (20210G/А), FV (1691G/А) и MTHFR (677С/Т) у больных ДН ассоциированы с ускорением темпа прогрессирования почечной недостаточности.