Полиморфизм гена CTLA4 (49A/G) в русской популяции у больных сахарным диабетом 1 типа и здоровых доноров

Сахарный диабет 1 типа (СД 1) – аутоиммунное заболевание, существенная роль в развитии которого принадлежит наследственной предрасположенности. Генетически обусловленная предрасположенность к развитию СД 1 связана в основном с полиморфизмом региона HLA класса II, однако существует целый ряд не относящихся к HLA генов, полиморфизм которых также может быть связан с развитием СД 1. Одним из генов-кандидатов является ген CTLA4 (cytotoxic T-lymdivhocyte associated antigen-4, поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов), белковый продукт которого участвует в регуляции активности Т-лимфоцитов и, следовательно, может играть важную роль в развитии аутоиммунных процессов. Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33, содержит 4 экзона и три интрона; полиморфизм гена обусловлен, в частности, полиморфизмом одиночного нуклеотида (SNP) +49A/G в первом экзоне (замена аденина на гуанин в 49 позиции последовательности первого экзона, приводящая к замене треонина на аланин в 17 позиции аминокислотной последовательности белка).

При исследовании различных популяций были получены данные, как подтверждающие [1–6], так и не подтверждающие [7–9] ассоциацию СД 1 с полиморфизмом +49 A/G гена CTLA4.

В данной статье представлены результаты работы по изучению распространения полиморфизма 49A/G гена CTLA4 (rs231775) в русской популяции у больных CД 1 и у здоровых доноров.

Материалы и методы исследования

В исследовании использовали коллекции периферической крови детей в возрасте 5–12 лет с диагнозом СД 1 (50 образцов, москвичи) и здоровых доноров крови (71 образец, москвичи).

ДНК выделяли методом Higuchi (1989) с некоторыми модификациями: 0,5 мл крови, взятой на EDTA, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках с 0,5 мл лизирующего раствора (0,32М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100) и центрифугировали в течение 1 мин при 10 000 об./мин. Супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора (50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5 мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твин 20 и 250 мкг/мл протеиназы К) при 37°С в течение 20 мин. Протеиназу К инактивировали кипячением в течение 5 мин в водяной бане. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при –20°С. Концентрация ДНК, определяемая по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем 50–100 мкг/мл.

Для генотипирования по локусам HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 применяли наборы реагентов производства НПФ ДНК-Технология (Москва).

Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 был применен метод сиквенс-специфических праймеров с определением продуктов амплификации в режиме «реального времени» [10].

Равное количество ДНК, выделенной из каждого образца, вносили в две амплификационные пробирки, содержащие праймер специфичный для аллеля A (пробирка с амплификационной смесью № 1) или аллеля G (пробирка с амплификационной смесью № 2), амплификационные смеси также содержали одинаковый обратный праймер и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Учет результатов проводили после окончания реакции амплификации. Результат генотипирования определяли по разнице пороговых циклов (ΔCt), полученных для амплификационных смесей № 1 и № 2. В случае гетерозиготы ΔCt была близка к нулю, в случае гомозигот ΔCt составляла более 5.

Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 были разработаны и синтезированы следующие праймеры: специфичный для аллеля A (5’- CAA ggC TCA gCT gAA CCT ggC TA –3’); специфичный для аллеля G (5’- CAA ggC TCA gCT gAA CCT ggC Tg –3’); общий праймер (5’- TCA CTg CCC TTg ACT gCT gAA ACA -3’). Также был синтезирован флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (FAM-5’- ggA CCT ggC CCT gCA CTC TCC Tg -3’-BHQ1). При разработке дизайна олигонуклеотидовов использовались базы данных нуклеотидных последовательностей Gen Bank, dbSNP и программное обеспечение Oligo 6.0.

Полимеразную цепную реакцию проводили в 35 мкл амплификационной смеси, содержащей 5 мкл образца ДНК и следующие компоненты: праймеры, специфичные для различных аллелей (14divM), общий праймер (14divM), флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (7 divM); 6 mM каждого dNTP; 84 mM TRIS-HCl (divH 8,6); 21 mM (NH4)2SO4; 3,1 mM – MgCl2, а также 5 единиц Taq-полимеразы. В целях повышения специфичности реакции применялся восковой «горячий старт».

Амплификацию и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТ-322» производства «НПФ ДНК-Технология». Температурный режим амплификации был следующим: денатурация при 94°C – 5 сек, отжиг, элонгация и детекция флуоресценции при 60°C – 20 сек (50 циклов).

Сравнение частот аллелей и генотипов для исследуемых групп проводилось с использованием точного критерия Фишера с применением поправки Бонферони.

Результаты и их обсуждение

Частота аллеля A для здоровых доноров составила 60%, для больных СД 1 – 43%. Частота аллеля G для здоровых доноров составила 40%, для больных СД 1 – 57%. Различия межде группами статистически значимы (P<0,01) (табл. 1).

Частота генотипа AA для здоровых доноров составила 35%, для больных СД 1 – 26%. Частота генотипа AG для здоровых доноров составила 51%, для больных СД 1 – 34%. Частота генотипа GG для здоровых доноров составила 14%, для больных СД 1 – 40% (различия статистически значимы) (табл. 2). Отклонения от равновесия Харди–Вайнберга в исследованных популяциях были незначительны.

Необходимо отметить следующее: ген CTLA4 был представлен генотипом 49GG у 7 из 10 больных СД 1, не несущих ни одного из «классических» маркерных гаплотипов HLA (DRB1*04-DQA1*301-DQB1*302 и DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201). В то же время генотип CTLA4 49A/G был обнаружен лишь у 6 из 52 здоровых доноров, не несущих ни одного из «классических» маркерных гаплотипов HLA.

В качестве практических рекомендаций можно предложить для формирования в детском возрасте групп «повышенного риска» по развитию СД 1, наряду с изучением полиморфизма HLA класса II, проводить изучение полиморфизма +49A/G гена CTLA4 (rs231775).

Выводы

Полученные для русской популяции (дети) данные показывают, что гуанин в 49-й позиции нуклеотидной последовательности первого экзона гена CTLA4 ассоциирован с СД 1.