Маркеры апоптоза у больных сахарным диабетом 1 типа в дебюте заболевания

Одной из актуальных проблем эндокринологии является изучение аутоиммунного процесса при сахарном диабете (СД). Важную роль в развитии патологических процессов, в том числе аутоиммунных, играет апоптоз (программированная гибель клеток). В иммунной системе он является одним из основных регуляторов численности популяций клеток. Именно этот процесс ограничивает экспансию активированных клонов, препятствуя развитию воспаления и аутоиммунных реакций.

Апоптоз может быть вызван различными индукторными факторами. «Активационный» апоптоз развивается в результате дисбаланса активационных сигналов и / или вследствие экспрессии и последующего связывания специализированных рецепторов индукции апоптоза. Хорошо изучена последовательность событий взаимодействия белка семейства TNF (tumor necrosis factor) со специфическими рецепторами, которая приводит к апоптозу клетки. Представителем этой группы является система Fas/Fas L. Для этой системы не известны другие функции, кроме как индукция апоптоза клетки. Fas/APO-1/CD95 – рецептор, по структуре относящийся к семейству TNF. Fas конститутивно экспрессируется на поверхности клеток многих типов: тимоцитах, лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В-лимфоцитах, фибробластах, гепатоцитах, миелоидных клетках и ряде других. В цитоплазматической части этого рецептора имеется «домен гибели» (DD – dearth domen), который вовлекается в белок-белковое взаимодействие с цитоплазматическими белками, генерируя «сигнал смерти».

Fas-L/CD95L относится к трансмембранным протеинам II типа. Fas-L экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах, натуральных киллерах, а также на β-клетках. Fas-L существует в двух формах – нерастворимой, или мембраносвязанной, и растворимой, отщепляемой от клетки с помощью металлопротеаз. Растворимая форма, попадая в циркуляцию, провоцирует клетки, имеющие на своей поверхности Fas-рецептор, к апоптозу.

Программированная гибель клеток играет особую роль в функционировании иммунной системы. Таким путем регулируется ответ иммунокомпетентных клеток на антигенные стимулы, определяется характер, динамика и длительность иммунного ответа, формирование иммунологической толерантности.

В иммунной системе CD95 и CD95L вовлечены в опосредованную T-лимфоцитами цитотоксичность. Под влиянием антигенной стимуляции происходит индукция CD95L на поверхности клеток [1]. В основном CD95L экспрессируется активированными CD4+ и CD8+ Т-клетками. На периферии зрелые Т-клетки, распознавая аутоантигены, элиминируются с участием Fas-рецепторов. Для обеспечения удаления активированных лимфоцитов в завершающей фазе иммунного ответа должен быть запущен процесс устранения лимфоцитов [2, 3]. Таким образом, система Fas/Fas-L занимает центральное место в регуляции периферического иммунного ответа.

Процессу апоптоза отводится ведущая роль как основному механизму деструкции β-клеток, возникающей при СД1 [1, 2, 4]. Между тем маркеры запрограммированной гибели клеток при аутоиммунном СД, в частности при медленно прогрессирующем аутоиммунном диабете взрослых – LADA, еще недостаточно исследованы.

При СД1 выявляется резистентность лимфоцитов к апоптозу, чем, возможно, объясняется характер и продолжительность аутоиммунного ответа при данном заболевании. Также наблюдается снижение экспрессии проапоптозного рецептора CD95 на поверхности Т-лимфоцитов [5, 6].

Целью данного исследования явилось изучение активационных маркеров программируемой клеточной гибели – CD95 и CD95L на лимфоцитах периферической крови у больных СД1 и LADA в дебюте заболевания.

Материалы и методы исследования

На базе ФГУ ЭНЦ было обследовано 33 пациента с СД1 в дебюте заболевания, которые были разделены на две группы. Первую группу составили 19 человек (11 мужчин, 8 женщин) с «классическим» СД1; вторую – 14 человек (все мужчины) – с LADA. Критериями исключения из исследования была вакцинация в течение предшествующего года, прием иммуномодулирующих препаратов. Контрольную группу составили восемь практически здоровых лиц (3 мужчин и 5 женщин), сопоставимых по возрасту с исследуемыми группами. Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие нарушений углеводного обмена и отрицательные аутоантитела к антигенам β-клетки (GADA, IA-2, ICA, IAA).

Диагноз СД ставился на основании клинической картины и данных лабораторного обследования в соответствии с критериями ВОЗ [7]. «Классический» вариант дебюта СД1 ставился при наличии яркой клинической картины (полидипсия, полиурия, значительная потеря массы тела), кетонурии, значений С-пептида ниже порогового уровня. Пациентам с дебютом заболевания в возрасте старше 30 лет, более мягким началом, положительными аутоантителами к антигенам β-клетки, отсутствием кетонурии, нормальными значениями уровня С-пептида ставился диагноз медленно прогрессирующего аутоиммунного СД взрослых.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили с помощью наборов пробоподготовки DNA prep. В настоящей работе ДНК-типирование выполнялось по аллельным вариантам трех генов HLA класса II: DRB1 (14 специфичностей), DQA1 (восемь аллелей) и DQB1 (13 аллелей) методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции. Для определения полиморфных аллелей данных генов применялись коммерческие наборы производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология». Полимеразная цепная реакция проводилась согласно регламенту, указанному производителем. Амплификацию проводили на амплификаторе «Терцик». Идентификацию продуктов амплификации проводили после электрофореза в трехпроцентном агарозном геле и окрашивания продуктов амплификации бромистым этидием. Гаплотипы составлялись на основе известных таблиц сцепления.

Иммунологическое исследование включало определение аутоантител к цитоплазматическим структурам β-клеток (ICA), к глутаматдекарбоксилазе (GADA), к тирозинфосфатазе (IA-2) и антиинсулиновых аутоантител (IAA). Количественное определение ICA, GADA и IAA в сыворотке крови обследованных определяли с помощью иммуноферментных наборов Isletest-ICA, GADA, IAA фирмы Biomerica согласно методике производителя. Количественное определение IA-2 в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Medizym фирмы Medipan MGBH.

Содержание уровня гликированного гемоглобина (HbA1c) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) на аппарате D-20 (Bio-Rad) по стандартной методике производителя.

Определение базального уровня С-пептида и инсулина для оценки функционального состояния β-клеток проводили иммунохемолюминисцентным методом на аппарате Elecsys 2010 (Roche).

Определение субпопуляционного состава лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD38+, CD95+, CD95L+, HLA-DR+) периферической крови проводили на проточном цитометре FACSCalibur с использованием моноклональных антител (Becton Dickinson) к дифференцировочным антигенам лимфоцитов по стандартной методике. При этом оценивали процентное содержание субпопуляций лимфоидных клеток.

Статистическая обработка результатов исследования выполнена с помощью пакета прикладных программ Statistica v 6.0 for Windows. Сравнение показателей выделенных групп пациентов проводилось по U-критерию Манна-Уитни. Количественные показатели представлены в виде медианы и доверительного интервала (ДИ). Критический уровень значимости принимался равным 5%.

Результаты и их обсуждение

Средний возраст пациентов при постановке диагноза в первой группе (n=19) составил 27,8 лет (от 18 до 41), во второй (n=14) – 36,1 лет (от 25 до 46). Во второй группе индекс массы тела (ИМТ) на момент выявления заболевания был достоверно выше (р<0,01), чем в первой и контрольной группах, медиана и ДИ ИМТ составили 29,5 кг/м2, ДИ [95%, 25,9; 34,1], 20,5 кг/м2, ДИ [95%, 19,3; 22,0] и 21,7 кг/м2, ДИ [95%, 19,0; 24,0] соответственно (рис. 1).

Уровень HbA1c на момент выявления заболевания в обеих группах был сопоставим: 12,4%, ДИ [95%, 11,7; 13,8] в первой и 11,3%, ДИ [95%, 10,8; 13,1] во второй. Базальный уровень С-пептида был достоверно выше в группе больных с поздним аутоиммунным началом СД – 1,9 нг/мл, ДИ [95%, 1,3; 2,6] по сравнению с первой группой – 0,6 нг/мл, ДИ [95%, 0,4; 0,7] (р<0,01).

Аутоантитела к антигенам β-клеток были выявлены у 14 пациентов (73,7%) первой группы и 14 человек (100%) второй группы. Наиболее часто определялись GADA, реже IA-2 и ICA. Комбинации антител обнаружены у семи (23,3%) обследованных больных (четверо из первой и трое из второй). Результаты представлены в таблице 1.

При анализе распределения аллелей генов DRB1-DQА1-DQВ1 локуса HLA II класса отмечено преобладание гаплотипов сильной предрасположенности к развитию СД1 в исследуемых группах. Протективные аллели генов DQ чаще встречались во втрой группе, однако ввиду небольшого объема выборки различия были статистически не достоверны. Данные представлены в таблице 2.

Основные субпопуляции лимфоидных клеток в исследуемых группах находились в пределах показателей контрольной группы. Наиболее выраженные изменения в исследуемых группах наблюдались в экспрессии маркерных молекул апоптоза по сравнению с контролем.

Экспрессия молекулы CD95 на мембране клетки характеризует ее возможность вступать в апоптоз. Индукторами этого процесса могут являться активированные лимфоциты, осуществляющие функцию иммунного надзора, и клетки с рецепторной молекулой CD95L.

При обследовании пациентов отмечено достоверное снижение процентного содержания лимфоидных клеток крови с маркерной молекулой CD95 в группе с «классическим» вариантом дебюта СД1 по сравнению со второй (р=0,02) и контрольной группами (p=0,04). Во второй исследуемой группе содержание лимфоцитов с CD95 не отличалось от контроля (p=0,55). Медиана и ДИ уровня лимфоцитов с рецептором CD95 составили в первой группе 28%, ДИ [95%, 24; 35], во второй – 34%, ДИ [95%, 32; 41], в контрольной – 33%, ДИ [95%, 32; 38]. Результаты представлены на рисунке 2.

Можно предположить, что наблюдаемое снижение количества лимфоидных клеток, экспрессирующих CD95, у пациентов с СД1 обусловливает относительную резистентность лимфоцитов к апоптозу, чем, возможно, объясняется особенность аутоиммунного ответа при данном заболевании. Устойчивость активированных лимфоцитов к апоптозу может приводить к пролонгации иммунного ответа.

Определение содержания лимфоцитов в периферической крови, экспрессирующих CD95L, выявило, что у больных СД количество клеток с CD95L на поверхности было достоверно выше, чем у практически здоровых лиц (р<0,01). Показатели CD95L+-лимфоцитов в первой группе были выше, чем во второй, и составили 3,8%, ДИ [95%, 3,1; 5,6] и 2,7%, ДИ [95%, 1,2; 4,3] соответственно, однако различия между основными группами оказались статистически недостоверны (р=0,21), что может быть связано с недостаточным объемом выборки. При сравнении каждой исследуемой группы с контрольной были получены достоверные различия (рис. 3). В контрольной группе медиана составила 1,6%, ДИ [95%, 0,7; 1,9].

При сопоставлении исследуемых групп несколько более высокое содержание лимфоцитов, имеющих CD95L на поверхности клетки, определялось у больных с гаплотипами HLA класса II высокой степени предрасположенности к развитию СД1 – 4,35%, ДИ [95%, 3,75; 6,7] по сравнению с пациентами, несущими протективные гаплотипы риска заболевания – 1,6%, ДИ [95%, 1,4; 3,5]. Однако различия оказались статистически недостоверны (р=0,06), вероятно, в связи с небольшим объемом выборки (рис. 4).

Покоящиеся Т-лимфоциты не экспрессируют Fas-лиганд. В основном CD95L экспрессируется активированными CD4+ и CD8+ Т-клетками [8]. Th1-лимфоциты способны лизировать клетки-мишени более активно, чем Th2-лимфоциты путем Fas-опосредованного механизма [9]. При СД1 островки поджелудочной железы инфильтрированы в основном Т-лимфоцитами, продуцирующими широкий спектр цитокинов, что в свою очередь сопровождается аберрантной экспрессией мембранных рецепторов. По данным литературы, под влиянием высокой концентрации глюкозы, цитокинов β-клетки начинают экспрессировать CD95 на поверхности, отсутствующий в норме на этих клетках [10, 11]. Таким образом, выявленная повышенная экспрессия CD95L на лимфоидных клетках при СД1, возможно, обусловливает более выраженный апоптотический процесс в β-клетках поджелудочной железы.

Апоптоз играет важную роль в элиминации аутореактивных клеток, контролирует длительность, интенсивность иммунного ответа, степень повреждения тканей и является механизмом, поддерживающим баланс лимфоидных клеток в организме [8, 12]. При взаимодействии CD95+-лимфоцитов с лигандом (мембранным или растворимым) инициируется возможность запуска процесса апоптоза, который может быть подавлен антиапоптотическим действием продуктов генов, блокирующих апоптоз. Поэтому снижение процентного содержания лимфоцитов, чувствительных к индукции апоптоза, может обусловливать нарушение процесса элиминации активированных форм лимфоцитов.

Заключение

Таким образом, можно сделать выводы, что при СД1:

1) снижение количества клеток, экспрессирующих CD95, может быть косвенным признаком подавления программированной гибели аутореактивных клеток, что способствует пролонгации иммунного ответа;

2) увеличение содержания CD95L+-лимфоцитов может способствовать усилению апоптотического процесса в островковых β-клетках, инфильтрированных лимфоцитами, макрофагами и натуральными киллерами.