Диабетогенные маркеры HLA класса II в удмуртской популяции: генотип-зависимость, роль DQ трансгетеродимеров

Поиск ассоциаций – один из подходов, позволяющих приблизиться к пониманию патогенеза и оценить риск возникновения мультифакториальных заболеваний. Сегодня прогноз развития сахарного диабета первого типа (СД1) у индивида основан на данных не только семейного анамнеза, наличия аутоантител и результатов метаболических тестов, но и на определении генетических маркеров, ассоциированных с СД1. Давно установлена и общепризнана доминирующая роль генов главного комплекса гистосовместимости (в частности, HLA – human leukocyte antigen – класса II: DRB1, DQA1, DQB1) в генетической предрасположенности к развитию СД1; определены характерные для европеоидов и ориентов наиболее диабетогенные HLA класса II аллели и гаплотипы [1]. При этом наблюдается существенная межэтническая и даже межпопуляционная разница как спектров диабетогенных специфичностей, так и степеней их ассоциации с заболеванием, что отражается на уровне заболеваемости и распространенности СД1 в популяции. В различных странах уровень заболеваемости СД1 колеблется от менее 3 до 20 и более на 100 тысяч населения. В Финляндии (страна с компактным проживанием финно-угоров) зарегистрирован самый высокий уровень заболеваемости детского населения СД1 – 43,9/100 тысяч в год. К финно-угорской группе народов относится и Удмуртская этническая группа, проживающая на территории Российской Федерации. В 2004 г. распространенность СД1 среди детей удмуртской национальности составляла 35,51 на 100 тысяч детского населения, заболеваемость – 8,45 на 100 тысяч детского населения в год [2].

В этой популяции была показана [3] (табл. 1) статистически достоверная ассоциация СД1 с единственным гаплотипом HLA класса II – DRB1*04-DQA*0301-DQB1*0302 (т.н. «классический» предрасполагающий гаплотип). Этот гаплотип сообщает наибольший риск развития СД1 не только на индивидуальном уровне (OR=12; рс=3×10-5), но и на популяционном (EF=0,22), т.е. является наиболее предрасполагающим, как и в других европеоидных популяциях. Разница частот второго «классического» предрасполагающего гаплотипа (DRB1*17(03)-DQA*0501-DQB1*0201) достигает 12%, но не достоверна (OR=4,9, р=0,003, но рс=0,075, EF=0,12), что может быть связано, во-первых, с величиной выборки, во-вторых, с генетическими особенностями удмуртской популяции. Возможно, что в удмуртской популяции (1) локусы вне HLA оказывают бо`льшее влияние на чувствительность к СД1 или/и (2) внутри локуса HLA бо`льшее значение имеет генотип-опосредованная модуляция чувствительности к СД1.

Цель данной работы – выявление генотип-зависимости ассоциации гаплотипов HLA класса II (DRB1*-DQA1*-DQB1*) с СД1 в популяции удмуртов, проживающих в Удмуртской Республике, а также поиск наиболее выраженных HLA класса II маркеров заболевания.

Материалы и методы

Методом случай-контроль исследовано 126 детей удмуртской национальности (удмурты в третьем поколении), 29 из которых имели СД1 (средний возраст манифестации 8,5 лет) и 97 являлись практически здоровыми. Родственники из анализа исключались. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови фенольно-хлороформной экстракцией после обработки протеиназой К. Образцы крови предоставлены эндокринологами ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия. Идентификацию аллелей генов HLA проводили методом мультипраймерной аллель-специфической полимеразной цепной реакции, используя наборы ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Россия). Обозначение специфичностей генов HLA соответствует общепринятой номенклатуре.

Частоты трехлокусных гаплотипов HLA класса II определяли, используя EM (Exdivectation – Maximization) алгоритм. Вне семейного анализа этот метод высокоэффективен для определения частот гаплотипов генов, находящихся в тесном сцеплении [4], в частности DRB1*, DQA1* и DQB1*[5]. Полученные данные подтверждались сравнением с известными группами сцепления HLA класса II в европеоидных популяциях. Частоты гаплотипов, соответствие распределения равновесию Харди-Вайнберга, достоверность неравновесного сцепления между мультиаллельными локусами вычисляли с помощью программы Arlequin ver 3.01 [6].

Степень ассоциации признака с заболеванием определялась величиной показателя отношения шансов (OR-odd`s ratio) [7]. Приведены 95% доверительные интервалы для OR (95% CI-confidence intervals). Точный двусторонний критерий Фишера или χ2-тест с поправкой Йетса на непрерывность использовали для оценки достоверности различий (р) в распределении частот гаплотипов/генотипов. Для множественных сравнений вводилась поправка Бонферрони (рс). Значимыми считались отличия, для которых рс<0,05. Степень ассоциации признака с заболеванием на популяционном уровне EF (etiologic fraction) и PF (divreventive fraction) определялась по формулам [8]. Расчеты выполняли при помощи компьютерных программ StatSoft, Inc. (2001). STATISTICA (data analysis software system), version 6.www.statsoft.com; Microsoft Office Excel-2003.

Результаты и обсуждение

Надо отметить, что в большинстве европеоидных популяций частоты «классических» предрасполагающих гаплотипов заметно выше, чем в удмуртской популяции (табл. 2): частота DRB1*04-DQA*0301-DQB1*0302 варьирует от 8 до15% против 2,6%, частота DRB1*17(03)-DQA*0501-DQB1*0201 находится в пределах 9±3%, достигая 22% в Словении [9 – 14] против 3,6%. В финской популяции частоты этих гаплотипов составляют 16% и 12,9% соответственно (NCBI`s db MHC).

В то же время в удмуртской популяции обнаружилась чрезвычайно высокая частота протективных гаплотипов DRB1*07-DQA*0201-DQB1*0201 (24,23%) и DRB1*07-DQA*0201-DQB1*0303 (8,76%) по сравнению с другими популяциями (табл. 2). Например, в финской популяции частота первого гаплотипа по разным источникам составляет 1,4–4,1%, у русских из семи разных регионов европейской части России – 7,4% – 14% [14], у американцев европейского происхождения – 11,08% [10], у бурят – 7,4% [15], у якутов – 7,8% и лишь в популяциях башкир и татар достигает 19,3% (наши данные неопубл.) и 20% [9] соответственно. Гаплотип DRB1*07-DQA*0201-DQB1*0303 не встречается в группе больных удмуртов, тогда как в контрольной группе частота его достигает 8,76% против 0,7–5,4% в десяти разных популяциях европейской части России [9]. В финской популяции частота этого гаплотипа составляет 1,4–2,5%. Этот гаплотип в работе [16] описан как высокопротективный.

Учитывая, что локус HLA класса II является основным в наследовании чувствительности к развитию СД1 и приняв во внимание работы свидетельствующие о том, что существенная часть межэтнических различий в заболеваемости СД1 связана с различной популяционной частотой протективных и предрасполагающих гаплотипов [11, 12, 17], можно предположить, что дети-удмурты подвержены заболеванию меньше, чем европеоиды, так как мы отмечаем существенно более высокую частоту двух протективных гаплотипов (DRB1*07-DQA*0201-DQB1*0201 и DRB1*07-DQA*0201-DQB1*0303) и более низкую частоту предрасполагающих гаплотипов (DRB1*04-DQA*0301-DQB1*0302 и DRB1*17(03)-DQA*0501-DQB1*0201) в удмуртской популяции по сравнению с другими европеоидами.

Однако распространенность СД1 у детей удмуртской и русской национальностей в Удмуртской Республике отличается незначительно (35,51 против 37,66 на 100 тыс. детского населения), а заболеваемость у русских даже ниже (5,47 против 8,45 на 100 тысяч детского населения в год) [2]. Вновь возникает предположение о генетических особенностях удмуртской популяции: (1) локусы вне HLA оказывают большее влияние на чувствительность к СД1 или/и (2) внутри локуса HLA большее значение имеет генотип-опосредованная модуляция чувствительности к СД1.

Известно, что во многих европеоидных популяциях индивидумы, имеющие генотип DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302 / DRB1*17(03)-DQA1*0501-DQB1*0201, подвержены значительно более высокому риску заболеть СД1. Самый высокий из известных HLA-DQ – опосредованных рисков сообщает гетерозиготная комбинация DQA*03-DQB1*0302 и DQA1*05- DQB1*0201, что говорит о возможной роли транскомплементации в чувствительности к СД1 [18]. При транскомплементации DQα цепь, кодируемая DQA1 одной хромосомы, и DQβ цепь, кодируемая DQB1 другой хромосомы, формируют гибридные молекулы, экспрессируемые на поверхности клеток. Было продемонстрировано, что транс-кодируемые гетеродимеры HLA экспрессируются и узнаются Т-клетками [19–21].

Ряд работ предоставляют прямые доказательства [22] и косвенные свидетельства [18, 23] ассоциации гетеродимеров DQA1*03 DQB1*02 с СД1 в различных популяциях. В цис-положении аллели DQA*03 и DQB1*02 встречаются крайне редко (0,3–1%), но на выборке из 4461 человек методом случай-контроль было показано, что этот гаплотип ассоциирован с СД1 (OR=12,2; рс=0,005) [22]. В этой же работе была продемонстрирована роль транскодируемых гетеродимеров DQA*03 и DQB1*02 в чувствительности к СД1 среди белых европеоидов и северных африканцев (бельгийский регистр). Результаты, полученные на различных популяциях Европы и США (1421 ядерная семья), показали, что формирование DQA*0301-DQB1*0201 трансгетеродимеров является важным фактором в ассоциации HLA с СД1 [18]. Было также замечено, что генотип DRB1*17-DQA1*0501-DQB1*0201 / DRB1*09-DQA1*0301-DQB1*0303 является высокопредрасполагающим к СД1 в азиатских популяциях (RR=10, div<0,01) [23] , что тоже может быть связано с образованием DQA*0301-DQB1*0201 трансгетеродимеров.

В европеоидных популяциях фенотип DQA1*0301+ DQB1*0201+ чаще всего является результатом гетерозиготной комбинации гаплотипов DRB1*04-DQA1*0301- DQB1*0302 и DRB1*17(03)-DQA1*0501-DQB1*0201. Примерно 35% больных СД1 в США являются такими гетерозиготами (против 2,4% в популяции в целом) [16], а в финской популяции 23% больных СД1 являются такими гетерозиготами [24]. В удмуртской популяции лишь 7% (2 из 29) больных СД1 имеют генотип DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302/DRB1*17(03)-DQA1*0501- DQB1*0201. В контрольной группе таких генотипов не выявлено. В 126 генотипах цис-кодируемых DQA1*0301-DQB1*0201 выявлено 1,2% (0,5% в группе контроля и 3,5% в группе пациентов). В 69% случаев (9 из 13) фенотип DQA1*0301+DQB1*0201+ представлен генотипами DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302/DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201 и DRB1*09-DQA1*0301-DQB1*0303/DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201. Частота фенотипа DQA1*0301+ DQB1*0201+ (включая как цис-, так и транскодируемые DQ гетеродимеры; табл. 3) вгруппе больных удмуртов достигает 27,6%, а в группе здоровых – 5,2% (OR=7,0; р=0,0017; EF=0,24).

Поскольку в европеоидных популяциях гаплотип DRB1*04-DQA*0301-DQB1*0302 является наиболее предрасполагающим к возникновению СД1, мы попытались оценить ассоциацию фенотипа DQA1*0301+DQB1*0302+ (аллели DQA1*0301 и DQB1*0302 как цис-, так и транскодируемые) с СД1. Оказалось, что этот фенотип ассоциирован с СД1 заметно больше (табл. 3: OR=18,2; рс=2×10-5; EF=0,55), чем гаплотип DRB1*04-DQA*0301-DQB1*0302 (табл. 1: OR=12; рс=3×10-5; EF=0,22).

Интересно отметить, что наличие в генотипе протективного гаплотипа DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201 (табл. 1: OR=0,36; р=0,036; PF=0,16) обеспечивает протекцию лишь в случае отсутствия в генотипе аллеля DQA1*0301 (табл. 4: генотип DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201/DQA1*0301-; OR=0,2; р=0,012; PF=0,29). Разница частот генотипа DRB1*07- DQA1*0201-DQB1*0201 / DQA1*0301+ (10,3% в группе СД1 против 4,1% в группе контроля) недостоверна, но обращает на себя внимание инверсия ассоциации (OR= 2,68), что косвенно тоже подтверждает существенную роль DQA1*0301 DQB1*0201 трансгетеродимеров в чувствительности к СД1. Увеличение выборки, конечно, позволит более категорично судить об этом явлении.

Однако данные представленного пилотного исследования удмуртской популяции позволяют говорить о заметной роли как DQA*0301-DQB1*0302, так и DQA1*0301-DQB1*0201 трансгетеродимеров в чувствительности к СД1. И можно предположить, что при низкой частоте «классических» высокопредрасполагающих гаплотипов относительно высокая заболеваемость и распространенность СД1 в удмуртской популяции обеспечивается модулирующим действием DQ трансгетеродимеров. Имея в виду возможность практического применения результатов, надо сказать, что в удмуртской популяции первичный скрининг групп риска на генетическую предрасположенность к СД1 рационально начинать с определения фенотипа HLA класса II DQ локуса. Фенотип DQA1*0301-DQB1*0302 или/и *0201 обнаружен у 62% больных против 10% в контрольной группе (табл. 3: OR=14,2; EF=0,58; рс=6×10-5).

Представленный материал подтверждает наблюдения о том, что DQ локус (и/или гены, находящиеся в тесном сцеплении с ним) оказывает наиболее существенный эффект на риск возникновения СД1 [25].