Т-лимфоциты FoxP3+ и их взаимосвязь с выраженностью коронарного атеросклероза у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа: пилотное исследование

ОБОСНОВАНИЕ

Атеросклероз представляет собой хроническое заболевание, сопровождающееся накоплением липидов и воспалением в стенке сосуда. Развитие атеросклероза и сахарного диабета (СД) взаимосвязано на клеточном, молекулярном и эпигенетическом уровнях. При этом для пациентов с СД характерно осложненное и быстропрогрессирующее течение атеросклероза [1]. Пациентам с недостаточным контролем гликемии свойственен более высокий риск развития сосудистых событий, чем для тех, у которых целевой уровень гликемии был достигнут [2].

Как известно, хроническое низкоинтенсивное воспаление является общей патофизиологической особенностью и атеросклероза, и СД 2 типа (СД2) [1]. Учитывая, что ряд терапевтических подходов, направленных на подавление воспаления, показал свою эффективность в снижении кардиоваскулярного риска у пациентов с СД и без него [3], важным является понимание закономерностей развития воспаления при атеросклерозе и их взаимосвязи с метаболическим статусом больных.

Интерес представляют Т-регуляторные (Treg) лимфоциты, которые за счет различных межклеточных взаимодействий, секреторной активности и метаболического репрограммирования способны ограничивать воспаление и развитие атеросклероза [4]. По мере прогрессирования атеросклероза происходит накопление Treg-лимфоцитов в бляшке, где они регулируют сложные межклеточные взаимоотношения, включая подавление активности провоспалительных Т-клеточных субпопуляций, переключение фенотипа макрофагов, снижение эффективности презентации антигена, стимуляцию пролиферации гладкомышечных клеток и увеличение продукции коллагена [5].

В соответствии с данными проведенного метаанализа пациенты с СД2 характеризовались снижением содержания CD4+CD25+Foxp3+Treg-лимфоцитов, что еще более усугублялось при наличии макро- и микрососудистых осложнений [6]. Однако в проанализированных работах изучалось только относительное содержание Treg-лимфоцитов, без подсчета их абсолютного количества.

FoxP3 является основным транскрипционным фактором Treg-лимфоцитов и необходим для их созревания и проявления иммуносупрессорной функции. Было показано, что его локализация внутри клетки может различаться, а перенос в ядро является неотъемлемым атрибутом нормальной активности Treg [7]. В настоящее время сведения о влиянии нарушений метаболизма на уровень переноса FoxP3 в ядро клеток у пациентов с сочетанием атеросклероза и СД2 отсутствуют.

В последнее время появляется все больше сведений о популяции FoxP3+ Т-лимфоцитов, которые практически не несут на своей мембране молекулы CD25, или они присутствуют лишь в малом количестве (FoxP3+СD25^loCD4+ Т-лимфоциты) [7][8]. Число данных клеток было повышено у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, такими как СД 1 типа (СД1) и системная красная волчанка [8]. Выдвигается предположение, что FoxP3+CD25^lo Т-клетки могут представлять собой новый клеточный маркер недавнего аутоиммунного или цитокин-опосредованного воспалительного ответа в тканях.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования стало изучение содержания FoxP3+CD25^hi и FoxP3+CD25^lo T-лимфоцитов, доли клеток с внутриядерной локализацией FoxP3 и продукции основных регуляторных цитокинов во взаимосвязи с клинико-метаболическими параметрами у пациентов с сочетанием ишемической болезни сердца (ИБС) и СД2 в сравнении с пациентами с ИБС без СД.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Исследование выполнено в НИИ кардиологии Томского НИМЦ, Томск.

Время исследования. В исследование вошли пациенты, обследованные с 03.2021 по 05.2022.

Изучаемые популяции

Для оценки свойств FoxP3+ T-лимфоцитов были сформированы две выборки пациентов: основная группа и группа сравнения.

Основная группа формировалась с учетом следующих критериев.

Критерии включения:

-мужчины и женщины в возрасте 40–70 лет;

-хроническая ИБС со стабильной стенокардией II–III ФК;

-показания для проведения селективной коронароангиографии;

-СД2.

Критерии исключения:

-любое острое сердечно-сосудистое осложнение или аортокоронарное шунтирование, перенесенные менее 6 мес назад;

-любое острое воспалительное заболевание, перенесенное менее 1 мес назад;

-тяжелая сопутствующая патология или онкологическое заболевание;

-инсулинотерапия;

-СД1;

-отказ от участия в исследовании.

Группа сравнения формировалась с учетом следующих критериев:

-мужчины и женщины в возрасте 40–70 лет;

-хроническая ИБС со стабильной стенокардией II–III ФК;

-показания для проведения селективной коронароангиографии.

Критерии исключения:

-СД1 и СД2;

-любое острое сердечно-сосудистое осложнение или аортокоронарное шунтирование, перенесенные менее 6 мес назад;

-любое острое воспалительное заболевание, перенесенное менее 1 мес назад;

-тяжелая сопутствующая патология или онкологическое заболевание;

-отказ от участия в исследовании.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции

Выборки формировалась путем сплошного включения наблюдений.

Дизайн исследования

Исследование являлось наблюдательным одноцентровым одномоментным сравнительным.

Методы

Диагноз СД2 устанавливался в соответствии с критериями современной классификации СД [9]. Всем пациентам проводилась ангиография на ангиографическом комплексе Artis one и Digitron-3NAC компьютерной системе (Siemens Shenzhen Magnetic Resonance Ltd., Shenzhen, China). Тяжесть коронарного атеросклероза оценивали путем расчета индекса Gensini Score.

Взятие венозной крови проводили утром натощак и через 2 ч после стандартной пищевой нагрузки. Мононуклеарные лейкоциты получали из крови с гепарином методом центрифугирования на градиенте плотности (Histopaque 1077, Sigma Aldrich, США). Для оценки содержания FoxP3+ Т-лимфоцитов клетки окрашивали моноклональными антителами, меченными флуорохромами: анти-CD4-FITC, анти-CD25-APC, анти-FoxP3-PE (Becton Dickinson, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Пробы анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения CellQuestPro (BD Biosciences, США). Оценку количества клеток с переносом FoxP3 в ядро проводили методом проточной цитометрии с визуализацией (прибор Amnis FlowSight (Luminex, США)) с добавлением в панель моноклональных антител, связанных с красителями, 7-аминоактиномицина D (7-AAD) для окрашивания ядра. Результаты выражали в виде доли положительно окрашенных клеток от искомой популяции клеток в процентах. Рассчитывали абсолютное количество клеток в периферической крови по данным общего анализа крови.

Мононуклеарные лейкоциты периферической крови инкубировали на полной среде RPMI (Sigma, США) в концентрации 10⁶ клеток на 1 мл среды при 37 °С и 5% CO₂. Оценивали спонтанную и стимулированную липополисахаридом (ЛПС) (10 мкг/мл; Sigma, США) секрецию цитокинов. Надосадочную жидкость клеточных культур собирали через 24 ч. Определение содержания цитокинов и хемокинов в сыворотке крови и надосадочной жидкости клеточных культур проведено с использованием оборудования Центра коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского НИМЦ. Мультиплексный анализ проводился на приборе FLEXMAP 3D (Luminex Corporation, США) с использованием набора MILLIPLEX map Human Cytokine/Chemokine Panel I для определения 38 аналитов в соответствии с рекомендациями производителя и программного обеспечения MILLIPLEX Analyst 5.1 (MERCK, Millipore, Milliplex; США).

Концентрацию глюкозы определяли гексокиназным методом. Иммунотурбидиметрическим методом определяли процентное содержание гликированного гемоглобина (HbA_1c) в крови (DiaSys, Германия). В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяли содержание инсулина (AccuBind, США). Исследовали липидный спектр крови (содержание общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛВП), холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛНП), соотношение ХС-ЛНП/ХС-ЛВП) (наборы ЗАО «Диакон-ДС», Россия). Определяли степень инсулинорезистентности путем расчета индекса HOMA (Homeostasis model assessment; глюкоза натощак × инсулин натощак /22,5) и расчета соотношения ТГ/глюкоза (Ln (ТГ (мг/дл) × глюкоза натощак (мг/дл)/2) [10].

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ STATISTICA 10.0 (StatSoft, США). Для проверки нормальности распределения количественных показателей использовали критерий Шапиро–Уилка. Результаты представляли в виде медианы и межквартильного интервала (Me [Q1; Q3]). Оценку статистической значимости различий количественных показателей в независимых группах пациентов проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни. Частоты встречаемости в независимых группах пациентов сравнивали по χ²-критерию Пирсона или по точному критерию Фишера. Для оценки взаимосвязи признаков использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена (Rs). Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р<0,05.

Этическая экспертиза

Протокол исследования был одобрен на заседании комитета по биомедицинской этике НИИ кардиологии Томского НИМЦ (протокол № 210 от 18.02.2021) и составлен в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование включены 57 пациентов с документированной хронической ИБС, в том числе 22 пациента с СД2, и 35 пациентов без СД, которые составили группу сравнения. На первом этапе у 37 пациентов мы проводили исследование содержание FoxP3+-клеток и продукции цитокинов. На втором этапе исследования у 34 пациентов был проведен анализ транслокации фактора транскрипции FoxP3 в ядро. Характеристика пациентов представлена в табл. 1 и 2.

Все пациенты находились на регулярной кардиоактивной терапии, приближающейся к оптимальной. Уровень артериального давления (АД) на фоне проводимого лечения не превышал 140/90 мм рт.ст. Существенных межгрупповых различий в использовании основных групп кардиоактивных препаратов не обнаружено. Сахароснижающая терапия у пациентов с СД2 включала бигуаниды (86,4%), препараты сульфонилмочевины (63,6%) и глиптины (13,6%).

В исследуемых на содержание в крови FoxP3+-клеток независимых группах пациентов количественные соотношения мужчин и женщин были несопоставимы: среди пациентов с СД2 было 3 мужчин и 14 женщин, а среди пациентов с ИБС без СД2 — 12 мужчин и 8 женщин (табл. 1), причем женщины характеризовались большим индексом массы тела (ИМТ). В группах пациентов, у которых мы исследовали перенос фактора FoxP3 в ядро, пациенты с СД2 были несколько старше, чем пациенты без диабета (табл. 2). Наблюдаемые различия соответствуют закономерностям, наблюдаемым в популяции в целом [10], поэтому при дальнейшем анализе мы провели коррекцию показателя FoxP3+-лимфоциты на имеющиеся межгрупповые различия по полу, возрасту и ИМТ.

Группа пациентов с СД2 характеризовалась более высокими значениями индекса ТГ/глюкоза, косвенно отражающего уровень инсулинорезистентности, по сравнению с группой пациентов с ИБС без СД (табл. 3).

Мы выявили повышение абсолютного содержания лимфоцитов в группе с сочетанием ИБС и СД2 (табл. 4). Группа пациентов с ИБС и СД2 характеризовалась более высоким абсолютным содержанием общей субпопуляции FoxP3+CD4+-лимфоцитов и FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов (табл. 4). После коррекции показателей по полу и ИМТ содержание лимфоцитов оказалось сопоставимым, в то время как абсолютное содержание FoxP3+CD4+-лимфоцитов и FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов и доля FoxP3+CD25^lo-клеток у пациентов с СД2 были выше, чем у пациентов без СД (табл. 4). Увеличение содержания субпопуляции FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов, но не классических FoxP3+CD25^lo Тreg-лимфоцитов у пациентов с ИБС при наличии СД2 соответствует изменениям при воспалительных аутоиммунных патологиях [8].

При изучении внутриядерной транслокации FoxP3 в группе пациентов с сочетанием ИБС и СД2 наблюдалось увеличение относительного количества FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов и абсолютного количества как FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов, так и FoxP3+CD25^hi-лимфоцитов с внутриядерным расположением FoxP3 по сравнению с пациентами без СД (табл. 5). После коррекции показателей по возрасту единственным параметром, по которому различались пациенты с наличием и отсутствием СД2, оказалась доля FoxP3+CD25^lo-клеток с FoxP3, расположенным в ядре (табл. 5). Таким образом, мы впервые показали не только увеличение содержания данных клеток, но и изменение их функционального потенциала по сравнению с пациентами без СД.

Пациенты с сочетанием ИБС и СД2 характеризовались увеличением сывороточного содержания хемокина CCL22 (C-C Motif Chemokine Ligand 22) и TNF-α, а также увеличением содержания CCL22 в надосадочной жидкости суточных культур мононуклеарных лейкоцитов, стимулированных ЛПС (рис. 1), что свидетельствует о вкладе клеток периферической крови в изменение системной концентрации данного хемокина.

В общей группе пациентов с ИБС мы выявили взаимосвязь средней силы между концентрацией CCL22 в надосадочной жидкости суточных культур мононуклеарных лейкоцитов, стимулированных ЛПС, и значениями индекса ТГ/глюкоза (Rs=0,620; p=0,024), а также между относительным количеством FoxP3+CD25^hi-лимфоцитов в периферической крови и сывороточной концентрацией CCL22 (Rs=0,587; p=0,044).

Только у пациентов без СД имелась тенденция к взаимосвязи Gensini Score с относительным количеством FoxP3+CD25^hi Treg-клеток с внутриядерным расположением FoxP3 (Rs=-0,471; p=0,076). При сочетании ИБС с СД2 наиболее сильная взаимосвязь была выявлена между Gensini Score и абсолютным количеством лимфоцитов (Rs=0,564; p=0,015), а также содержанием ХС-ЛВП (Rs=-0,515; p=0,029).

Мы разделили всю группу пациентов с ИБС на подгруппы в зависимости от величины тертилей Gensini Score: первый тертиль (Gensini Score<17 баллов; низкие значения Gensini Score); второй тертиль (Gensini Score 17–45 баллов; средние значения Gensini Score); третий тертиль (Gensini Score>45 баллов; высокие значения Gensini Score). Следует отметить, что тертили в нашей выборке оказались близкими к таковым в крупномасштабных исследованиях [11].

У пациентов с СД2 и без СД различались значения индекса ТГ/глюкоза (у пациентов первого тертиля) (табл. 6), тогда как межгрупповых различий метаболических показателей в зависимости от величины Gensini Score у пациентов с СД выявлено не было (табл. 6).

При анализе данных проточной цитометрии и проточной цитометрии с визуализацией оказалось, что для пациентов с ИБС и СД2 со средними значениями Gensini Sсore (2-й тертиль Gensini Score) была характерна тенденция к увеличению абсолютного содержания FoxP3+CD25^hi и FoxP3+CD25^lo T-клеток с FoxP3, расположенных в ядре, по сравнению с пациентами с низкими значениями Gensini Score, а также увеличению абсолютного содержания FoxP3+CD25^lo T-лимфоцитов, содержания FoxP3+CD25^hi и FoxP3+CD25^lo T-клеток с переносом FoxP3 в ядро и относительного содержания FoxP3+CD25^lo T-клеток с переносом FoxP3 в ядро по сравнению с пациентами без СД (табл. 7). У пациентов со средними значениями Gensini Score без диабета мы выявили тенденцию к снижению относительного содержания FoxP3+CD25^lo T-лимфоцитов по сравнению с пациентами с низкими значениями Gensini Score (табл. 7).

ОБСУЖДЕНИЕ

Большинство сведений о функционировании FoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов опирается на оценку их процентного содержания и не учитывает субпопуляцию FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов [5]. В нашем пилотном исследовании мы впервые выявили увеличение абсолютного содержания FoxP3+ T-лимфоцитов у пациентов с сочетанием ИБС и СД2 по сравнению с пациентами с ИБС без нарушений углеводного обмена. Это было обусловлено в первую очередь увеличением содержания субпопуляции FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов, которой до настоящего времени уделялось мало внимания.

Ferreira R.C. и соавт. (2017) показали, что эти клетки обладают схожими чертами с Treg-лимфоцитами, такими как деметилирование FoxP3, конститутивная экспрессия транскрипционного фактора Helios (маркер Treg тимического происхождения) в большинстве клеток и неспособность к продукции цитокина IL-2 [8]. Отличием от конвенционных CD127^loCD25^hiFoxP3+ Treg-лимфоцитов являлась сниженная экспрессия Treg-ассоциированных молекул (FoxP3 и CTLA-4). Из чего авторы сделали вывод о том, что эти клетки являются заключительной стадией жизненного цикла Treg-лимфоцитов. Причем хроническая стимуляция в ходе активного аутоиммунного воспаления приводит к увеличению их количества [8].

В соответствии с полученными нами данными более выраженное хроническое низкоинтенсивное воспаление при СД2, проявляющееся у обследованных пациентов с ИБС увеличением сывороточной концентрации TNF-α, ассоциируется также с увеличением абсолютного количества FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов в периферической крови и сопровождается увеличением переноса FoxP3 в их ядро. Ранее сведений об увеличении содержания данной клеточной субпопуляции у пациентов с СД2 получено не было. В то же время показано, что для пациентов с СД2 характерно снижение относительного содержания CD4+CD25+FOXP3+ Treg-лимфоцитов [12]. Другой группой исследователей было обнаружено, что содержание Treg-лимфоцитов снижается при продолжительности СД2 более 10 лет [13]. Медиана длительности СД у пациентов, вошедших в наше исследование, была менее 10 лет, но превышала 5 лет. Можно предположить, что выявленное нами увеличение количества FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов является промежуточным этапом и свидетельствует об истощении регуляторного потенциала иммунной системы. Мы полагаем, что увеличение содержания FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов можно рассматривать в качестве перспективного клеточного маркера хронического низкоинтенсивного воспаления у пациентов с сочетанием ИБС и СД2.

Мы впервые показали, что выявленные изменения характерны в большей степени для пациентов именно с умеренно выраженным атеросклерозом. На начальных этапах развития атеросклероза, при низких значениях Gensini Score, содержание FoxP3+-лимфоцитов и уровень внутриядерного содержания FoxP3 в них были сопоставимыми с таковыми у пациентов без диабета. Вероятно, на данном этапе развития заболевания мобилизация и активация Т-лимфоцитов еще не проявляются в достаточной мере. Мы не выявили значимых различий и при высоких значениях Gensini Score, вероятно, в связи с тем, что мобилизационный резерв и способность к активации Т-регуляторного звена начинают истощаться. Для подтверждения данной гипотезы необходимо изучение клеточного состава атеросклеротических бляшек, что в данной группе пациентов со стабильной ИБС не представлялось возможным. Примечательно, что у пациентов с ИБС без СД имела место даже тенденция к снижению содержания FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов по мере увеличения выраженности атеросклероза, что говорит о принципиальных отличиях состояния регуляторных механизмов иммунного ответа при наличии нарушений углеводного обмена у пациентов с ИБС.

Одним из вероятных патогенетических звеньев, способствующих мобилизации FoxP3+-лимфоцитов у пациентов с СД2, может являться изменение продукции хемокина CCL22, концентрация которого была увеличена в сыворотке и надосадочной жидкости ЛПС-стимулированных культур лейкоцитов при наличии СД. Известно, что CCL22 является основным хемоаттрактантом FoxP3+ Treg-лимфоцитов [14]. Уровень инсулинорезистентности может оказывать непосредственное влияние на продукцию CCL22, учитывая выявленную нами взаимосвязь между стимулированной ЛПС продукцией CCL22 мононуклеарными лейкоцитами и индексом ТГ/глюкоза у пациентов. Показано, что низкая частота Treg-лимфоцитов ассоциировалась с дестабилизацией атеросклеротических бляшек у экспериментальных животных [15]. Можно предположить, что при СД2 наблюдается CCL22-опосредованное нарушение привлечения Treg-лимфоцитов в атерому, что в конце концов способствует дефициту Treg в стенке сосуда, увеличению воспаления и прогрессированию атеросклероза [6]. Данное предположение также находится на уровне гипотезы и требует подтверждения в будущих исследованиях.

Ограничения исследования

Ограничениями исследования являются небольшой объем выборки пациентов и его наблюдательный одномоментный дизайн. Проведение данного пилотного исследования позволило подтвердить необходимость изучения субпопуляций FoxP3+CD25^hi-лимфоцитов и FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов в большей группе больных. Кроме того, проведение проспективного исследования в дальнейшем позволило бы сделать заключение о возможности определения FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов в качестве биомаркера, ассоциированного с благоприятным или неблагоприятным прогнозом у пациентов.

Направления дальнейших исследований

Полученные результаты о различном содержании FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов у пациентов c СД2 в зависимости от величины Gensini Score не исключают того, что тактика лечения пациентов при наличии СД2 на разных этапах развития атеросклероза может различаться. Известно, что ряд сахароснижающих препаратов могут оказывать влияние на работу иммунной системы. Подавляющее большинство пациентов с СД2 в нашем исследовании получали сахароснижающую терапию, включая метформин (86,4% пациентов). Имеющиеся данные о наличии у метформина иммуномодулирующих эффектов являются противоречивыми. В ряде исследований было обнаружено его стимулирующее влияние на экспрессию FoxP3 [16], в то время как у онкологических пациентов назначение метформина, напротив, приводило к снижению содержания FoxP3+ Т-лимфоцитов в опухоли [17]. Целесообразно проведение дополнительных исследований, направленных на изучение влияния бигуанидов на свойства FoxP3+ Т-лимфоцитов у пациентов с сочетанием ИБС и СД2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пациенты с сочетанием ИБС и СД2 характеризуются увеличением относительного и абсолютного содержания FoxP3+CD25^lo-лимфоцитов в периферической крови и повышением внутриядерного содержания FoxP3 в них, что наиболее выражено у пациентов с умеренным атеросклерозом (Gensini Score 17–45 баллов). Выявленные изменения взаимосвязаны с повышением продукции хемокина CCL22 и степенью инсулинорезистентности и не исключают в дальнейшем возможность разработки различных подходов к терапии пациентов с ИБС и СД2 в зависимости от тяжести коронарного атеросклероза и содержания FoxP3+CD25^lo-клеток.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках фундаментального научного исследования №122020300043-1.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Кологривова И.В. — концепция, получение, анализ данных, интерпретация результатов, написание статьи; Кошельская  О.А. — концепция, анализ данных, редактирование рукописи; Суслова Т.Е. — концепция, дизайн исследования, редактирование рукописи; Харитонова О.А. — получение клинических данных, внесение в рукопись правок; Трубачева О.А. — получение лабораторных данных, внесение в рукопись правок; Кравченко Е.С. — получение лабораторных данных, внесение в рукопись правок; Дмитрюков А.А. — получение лабораторных данных, внесение в рукопись правок; Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы выражают благодарность Марголис Н.Ю., специалисту по биомедицинской статистике, за помощь в обработке данных.