Оксидативный стресс и изменения показателей обмена сиалогликоконъюгатов печени крыс с аллоксановым сахарным диабетом

ОБОСНОВАНИЕ

К социально значимым заболеваниям относится сахарный диабет (СД), терапия и профилактика которого остаются все еще недостаточно эффективными [1]. Сложностями изучения механизмов патогенеза СД являются, с одной стороны, нарушения всех видов обменов, а с другой — вовлеченность в развитие патологических изменений практически всех органов и тканей.

Печень интегрирует все виды обмена веществ. К основной функции печени в углеводном обмене относится поддержание гомеостаза глюкозы в крови, в регуляции которого важную роль играет инсулин. На внешней мембране гепатоцитов находится большое количество инсулиновых рецепторов.

В настоящее время неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) рассматривается в качестве печеночного компонента метаболического синдрома [2]. Частота НАЖБП среди пациентов с СД 2 типа, по данным разных исследований, составляет до 80%, при СД 1 типа — около 50% [3]. Декомпенсация углеводного обмена при СД вызывает значительные изменения метаболизма гепатоцитов, приводящих к снижению запасов в них гликогена, накоплению липидов, что ведет к жировому гепатозу и стеатогепатиту [3].

Сиаловые кислоты (СК) являются терминальными моносахаридными остатками в составе сиалогликоконъюгатов (гликопротеинов, ганглиозидов), которые в мембранах клеток образуют плотный массив сложно организованных сиалированных гликанов [4] и участвуют в процессах распознавания маркеров молекулярных и клеточных взаимодействий во время передачи сигналов, пролиферации, дифференциации, миграции и адгезии клеток [5].

Более 50% общих СК в сыворотке крови приходится на белки острой фазы [6], которые в основном синтезируются в печени и стимулируются противовоспалительными цитокинами.

Сиалидаза (ЕС 3.2.1.18) катализирует удаление концевых остатков СК из углеводсодержащих соединений. Данный фермент, локализованный на поверхности клеток и во внутриклеточном пространстве, может, с одной стороны, инициировать катаболизм сиалогликоконъюгатов, а с другой — отщеплять от них остатки СК, регулируя, таким образом, их структуру, свойства и функции [7][8].

Десиалирование инсулинового рецептора в результате взаимодействия с инсулином приводит к его активации [7][9]. Некоторые ингибиторы сиалидазы могут являться глюкозозависимым усилителем секреции инсулина [10]. При алиментарной гипергликемии у крыс наблюдалось повышение содержания СК в сыворотке крови [11].

В патогенезе СД важная роль принадлежит развитию окислительного стресса. Фармакотерапия НАЖБП направлена в первую очередь на факторы, способствующие ее развитию и прогрессированию, а также коррекцию ассоциированных метаболических нарушений, в том числе уменьшению оксидативного стресса [2].

Важным проявлением оксидативного стресса в условиях длительной гипергликемии является процесс гликирования белков, в том числе ферментов и рецепторных структур на поверхности мембран клеток, к которым относятся и сиалогликопротеины. Также активируется липидная пероксидация, что может оказывать влияние как на строение липидов, так и на работу различных белков (переносчиков, ферментов, рецепторных структур) в составе мембран, многие из которых в той или иной степени относятся к сиалогликоконъюгатам. Исследования показали, что гликолипиды могут изменять сигнальные свойства белковых рецепторов, присутствующих в одной и той же клеточной мембране. Например, сиалилированный ганглиозид GM3 может оказывать различное влияние на тирозинкиназную сигнализацию рецептора эпидермального фактора роста (Epidermal Growth Factor, EGF), а удаление GM3 влияет на действие рецептора инсулина [12]. Показано, что повышение уровня СК в сыворотке крови и снижение концентрации менее сиалилированных изоформ трансферрина, называемых углевод-дефицитным трансферрином, при СД 2 типа имеют статистически значимую корреляцию при наличии микроангиопатии [13].

К неферментным антиоксидантам относится α-липоевая кислота (ЛК), которая способствует превращению углеводов, участвуя в процессах окислительного декарбоксилирования пирувата, α-кетоглутарата и других α-кетокислот. Высокая эффективность α-липоевой кислоты при СД показана в ходе многочисленных экспериментальных и клинических наблюдений [14]. Применение данного антиоксиданта улучшало показатели гликемии, увеличивало чувствительность к инсулину [15].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение влияния оксидативного стресса на показатели обмена сиалогликоконъюгатов печени крыс с аллоксановым СД на фоне коррекции ЛК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Исследование проводилось на научно-технической базе ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Время исследования. 40 сут с момента введения аллоксана тетрагидрата (АТ) животным в осенне-зимний период.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Беспородные белые крысы-самцы были разделены на три группы: у животных 1-й и 2-й групп вызывали аллоксановый СД однократным подкожным введением АТ. Грызуны 2-й группы получали ЛК внутримышечно. Третью группу составили интактные животные. Содержание и обращение с животными соответствовали требованиям ГОСТ 33216–2014 от 01.07.2016. Крыс содержали в условиях конвенционального вивария со свободным доступом к воде и пище (стандартный корм для лабораторных животных). Всех животных в течение 1 мес до начала эксперимента адаптировали к условиям эксперимента и диагностическим манипуляциям.

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное одноцентровое динамическое рандомизированное открытое доклиническое исследование с использованием модели аллоксан-индуцированного СД.

Методы

Исследования проводили на 106 самцах беспородных белых крыс массой 180–220 г. Животных разделили на три группы: у грызунов 1-й и 2-й групп вызывали аллоксановый СД однократным подкожным введением АТ (Fluka Chemica, Швеция) в дозе 170 мг/кг массы тела животного [16]. После индукции диабета, с 4 по 40-й дни эксперимента, крысы 2-й группы (СД+ЛК) ежедневно получали ЛК в дозе 5 мг/100 г массы внутримышечно [15]. Третью группу составляли интактные крысы. В каждой из опытных групп было по 48 животных, контрольная группа включала 10 крыс. В плазме крови определяли концентрацию глюкозы глюкозооксидазным методом (Human, Германия). Степень развития окислительного стресса оценивали по уровню тиобарбитуровой кислоты (ТБК) -активных продуктов (ТБКАП) в печени (набор реактивов «ТБК-Агат», Россия). Содержание свободных, олиго- и белоксвязанных СК (ССК, ОСК и БСК соответственно), сиалидазную активность (СА) в печени определяли с помощью набора реактивов «СиалоТест» (НПЦ «Эко-Сервис», Россия). Все изучаемые показатели исследовали на 5, 10, 20, 30 и 40-й дни экспериментов. Крысы подвергались эвтаназии для взятия биологического материала.

Статистический анализ

Статистическую обработку проводили с помощью программного пакета Statistiсa 6.0 фирмы StatSoft. В сравниваемых выборках оценку значимости полученных данных (р) осуществляли с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Данные представлены в виде медиан, а также минимальных и максимальных значений. Различия признавались значимыми при p<0,05.

Этическая экспертиза

На проведение опытов получено разрешение комиссии по биоэтике ЛЭК ФГБОУ ВО ИГМА Минздрава России 703/1 от 26.01.2021.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Концентрация глюкозы в плазме крови интактных животных составила 6,06 [ 5,21; 6,7] ммоль/л.

Введение аллоксана экспериментальным крысам приводило к развитию гипергликемии. Содержание глюкозы в плазме крови животных 1-й и 2-й групп, согласно полученным данным (табл. 1), статистически значимо превышало контрольные значения на протяжении всего периода наблюдения. Максимальное значение данного показателя было отмечено на 30-й день у грызунов с аллоксановым СД и составляло 15,8 [ 10,97; 38,08] ммоль/л (р<0,05) [17]. Значимое уменьшение массы тела животных с аллоксановым СД наблюдалось только на 5-й и 40-й дни наблюдений.

Количество ТБКАП в печени контрольных животных равнялось 11,18 [ 8,51; 13,13] мкмоль/кг сухой ткани. В 1-й группе серии СД уровень ТБКАП в печени животных превышал контрольные значения на протяжении всего опыта, за исключением 30-го дня исследований. Увеличение концентрации ТБКАП в печени в течение длительного времени свидетельствует о развитии оксидативного стресса.

Уровень гипергликемии у животных, получавших ЛК, был ниже, чем у крыс 1-й группы, на 5, 30 и 40-й дни наблюдений. Содержание ТБКАП в печени крыс с СД достоверно уменьшалось после введения ЛК в почти все дни эксперимента по сравнению с грызунами 1-й группы (p<0,001), кроме 30-го дня. На 30-й день опытов концентрация ТБКАП в печени животных 1-й и 2-й групп статистически значимо не отличалась от контрольных показателей. Достоверно значимое уменьшение массы тела животных с аллоксановым СД на фоне введения ЛК по сравнению с данными интактных крыс наблюдалось только на 20-й день наблюдений (p<0,01).

Содержание ССК в печени крыс с аллоксановым СД, согласно полученным данным (табл. 2), было выше контрольных значений во все сроки эксперимента. Наиболее значительное повышение содержания ССК наблюдалось на 40-й день и составляло 2,95 [ 2,22; 4,68] ммоль/кг (р<0,05). Концентрация ОСК также была выше уровня контрольных грызунов на 5, 20 и 40-й дни опытов, а уровень БСК в печени — на 5, 10, 20 и 40-й дни наблюдений с максимальным повышением на 10 и 20-й дни эксперимента.

Концентрации ССК и ОСК в печени грызунов 2-й группы были выше контрольных значений на протяжении всех дней опытов. Увеличение содержания БСК в печени отмечалось на 5, 10 и 20-й дни, а к концу наблюдений концентрации значимо не отличались от контрольных значений. Содержание БСК в печени крыс с СД после введения ЛК достоверно уменьшалось по сравнению с показателями 1-й группы животных на 20 и 40-й дни эксперимента (p<0,01).

СА в печени крыс 1-й и 2-й групп статистически значимо превышала контрольные значения на протяжении всего эксперимента.

Между изменениями уровня ТБКАП в печени и концентрацией глюкозы в крови крыс 1-й и 2-й групп корреляционных зависимостей не наблюдалось. Отмечалась положительная корреляционная связь между содержанием ТБКАП и СА (r=0,92), а также уровнями ССК и СА (r=0,77) в печени крыс с аллоксановым СД.

У животных с СД на фоне введения ЛК наблюдалась положительная корреляционная связь между концентрацией глюкозы в крови и исследуемыми показателями печени: содержаниями глюкозы и ОСК (r=0,91), а также уровнями глюкозы и БСК (r=0,78).

ОБСУЖДЕНИЕ

Повышение содержания ТБКАП в печени на протяжении всего периода наблюдений подтверждает развитие окислительного стресса у животных. Параллельно происходит увеличение скорости обмена сиалогликоконъюгатов в клетках печени крыс при аллоксановом СД на фоне развития оксидативного стресса.

С одной стороны, отмечается повышение СА гепатоцитов, которое положительно коррелирует с показателями ТБКАП в печени крыс. Закономерным итогом в качестве продукта действия сиалидаз на различные сиалогликоконъюгаты клетки следует увеличение содержания ССК в печени. Между данными показателями (уровнями СА и ССК) также наблюдалась положительная корреляционная связь. Возможны различные причины увеличения СА. Например, данный рост активности может быть связан с лизосомальными сиалидазами и разрушением внутриклеточных сиалогликоконъюгатов. Также возможен вариант активации сиалидаз мембран, которые необходимы для изменения работы рецепторных структур в процессе адаптации гепатоцитов к условиям длительной гипергликемии и оксидативному стрессу.

С другой стороны, у животных 1-й группы наблюдалось стойкое (кроме 30-го дня опытов) увеличение концентрации БСК в печени. К возможным причинам данного явления относится активация в гепатоцитах синтеза и секреции различных сиалогликопротеинов (α1-антитрипсина, α1-кислого гликопротеина, церулоплазмина, α2-макроглобулина и т.д.) в качестве ответа острой фазы. По данным литературы известно, что у больных СД отмечались повышения содержания белков острой фазы [18][19], уровня СК и активности сиалидазы в плазме крови, которые коррелируют со степенью развития таких осложнений СД, как диабетическая нефропатия [20].

При введении ЛК животным с аллоксановым СД уровень оксидативного стресса снижается, о чем свидетельствует значимое уменьшение содержания ТБКАП в печени по сравнению с данными показателями у крыс 1-й группы. Но при этом не происходило значительного изменения скорости обмена исследуемых показателей обмена сиалосодержащих соединений. На фоне введения ЛК грызунам с СД проявляется положительная корреляционная связь между концентрациями глюкозы в плазме крови и содержанием ОСК в печени, а также уровнями глюкозы в плазме крови и концентрацией БСК в печени. Можно высказать предположение, требующее дальнейшей проверки, что уменьшение действия одного повреждающего фактора (оксидативного стресса) на клетки печени вызвало увеличение зависимости обмена сиалосодержащих соединений от другого повреждающего фактора (гипергликемии).

Печеночные клетки координируют различные потоки веществ, адаптируя метаболизм к потребностям организма. В гепатоцитах происходит синтез различных веществ на «экспорт», то есть для обеспечения выполнения функций других органов и систем, осуществляется синтез плазменных белков крови, имеющих самые разнообразные значения, биосинтез и распад гликогена. Печень выполняет роль модификации и детоксикации различных соединений, а также экскреторную функцию, участвуя в выведении билирубина, желчных кислот и холестерина через желчные протоки.

Одной из основных функций печени является поддержание концентрации глюкозы в крови на постоянном уровне, которое осуществляется путем поглощения или высвобождения глюкозы в ответ на изменения, в частности, содержания инсулина, глюкагона и адреналина в организме, а также в результате изменения концентрации самой глюкозы в кровотоке.

Поступление данного моносахарида в гепатоциты происходит независимо от действия инсулина путем пассивной диффузии с помощью белкового глюкозного транспортера GLUT2. Инсулин связан с изменением активности ферментов важных метаболических процессов в печени, но не с регуляцией скорости транспорта глюкозы в ее клетки [21].

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что гепатоциты обладают интенсивным и высокоспециализированным клеточным метаболизмом, содержат много специфических ферментов и активно влияют на обменные процессы в клетках других органов и тканей. В условиях длительной гипергликемии, способствующей развитию оксидативного стресса, в результате дефицита инсулина происходит активная перестройка обмена веществ в печени, сопровождающаяся различными взаимодействиями на всех уровнях организма.

Биологическое значение СК следует рассматривать с точки зрения их двойной функции, то есть они либо маскируют сайты распознавания, либо, напротив, представляют собой биологическую мишень, позволяя определять их рецепторным белком и выступая в роли лиганда. Противоположные реакции сиалилирования и десиалилирования необходимо изучать как динамическую модификацию углеводсодержащих соединений в ответ на внешние или внутренние стимулы наподобие процессов фосфорилирования и дефосфорилирования. Повышение интенсивности обмена сиалогликоконъюгатов у крыс с аллоксан-индуцированным СД и на фоне его коррекции ЛК может свидетельствовать об их вовлеченности в сложные регуляторные процессы, происходящие в гепатоцитах.

Ограничения исследования

При изучении влияния коррекции оксидативного стресса ЛК у экспериментальных животных с аллоксановым СД отсутствовала группа плацебо. При этом нельзя исключить возможное системное действие в результате внутримышечного введения антиоксиданта опытным крысам.

Сопоставление с другими публикациями

Данные по вариабельности показателей обмена сиалогликоконъюгатов в печени крыс с аллоксановым СД, их сравнение с динамикой изменений одного из показателей оксидативного стресса на фоне введения ЛК получены впервые. Подобная динамика изменения показателей обмена сиалогликоконъюгатов наблюдалась в стенке тонкой кишки крыс с аллоксановым СД на фоне введения ЛК [22]. Транспорт глюкозы через базальную мембрану энтероцитов, как и в клетках печени, происходит с помощью GLUT2 путем пассивной диффузии независимо от действия инсулина. По мощности отдельных ферментных систем метаболизма и биотрансформации веществ эпителий тонкой кишки может превосходить печень.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о снижении уровня гликемии и показателей окислительного стресса в печени крыс с аллоксановым диабетом на фоне введения ЛК.

Поступление ЛК в организм экспериментальных животных существенно не снижало СА и содержание исследуемых фракций СК в печени, хотя и уменьшало степень развития оксидативного стресса в организме. Повышение скорости обмена сиалосодержащих соединений в печени крыс с аллоксановым СД может свидетельствовать о перестройке метаболизма гепатоцитов для адаптации всего организма к длительной гипергликемии в условиях недостатка инсулина.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование проводилось на научно-технической базе ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академии» Минздрава России. Расходные материалы закупались за счет средств ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академии» Минздрава России.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов.

Участие авторов. Вольхина И.В. — экспериментальная работа по моделированию аллоксан-индуцированного сахарного диабета, проведение комплексного обследования животных, концепция и дизайн статьи, анализ литературы, статистическая обработка результатов исследования, интерпретация результатов, написание статьи; Бутолин Е.Г. — концепция и дизайн статьи, анализ данных, редактирование текста, утверждение финальной версии текста рукописи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.