Молекулярно-генетические и клинико-лабораторные характеристики моногенного сахарного диабета, обусловленного мутациями гена INS

ОБОСНОВАНИЕ

В последние годы все большее внимание уделяется моногенному сахарному диабету (МГСД), обусловленному дефектами гена INS.

В 1976 г. К. Gabbay и соавт. описали большую семью, у многих членов которой наблюдались гиперпроинсулинемия в сочетании с эпизодической гипогликемией либо нарушение толерантности к глюкозе или сахарный диабет (СД) легкого течения [1]. Исследователи предположили, что все эти нарушения обусловлены каким-то генетическим дефектом синтеза инсулина. Эта гипотеза подтвердилась в 1990 г., когда F. Barbetti и соавт. обнаружили у двух неродственных пациентов с семейной гиперпроинсулинемией одну и ту же мутацию гена INS, приводящую к замене аргинина на гистидин в положении 65 молекулы проинсулина [2].

В 2007 г. J. Stoy и соавт. [3] и в 2008 г. C. Сolombo и соавт. [4] независимо друг от друга идентифицировали гетерозиготные мутации в кодирующем регионе INS у пациентов с перманентным неонатальным СД (ПНСД).

В 2008 г. Е. Edghill и соавт. [5] выявили гетерозиготные мутации в гене INS у 2/86 (2,3%) пациентов с дебютом СД от 6 до 12 мес жизни, у 1/296 (0,3%) с фенотипом МОDY и 1/463 (0,2%) с СД 2 типа. В то же время связь мутаций гена INS c фенотипом МОDY была показана А. Molven и соавт. [6].

В 2010 г. I. Garin и соавт. [7] описали принципиально новый механизм развития неонатального СД (НСД) — нарушение биосинтеза инсулина у пациентов с гомозиготными мутациями INS. А М. Liu и соавт. [8] для обозначения случаев неиммунного инсулинзависимого СД у молодых лиц, связанного с гетерозиготными мутациями в гене INS, предложили термин — MIDY (Mutant INS-gene-induced Diabetes of  Youth).

В 2012 г. впервые была описана сплайсинг-мутация в терминальном интроне гена INS, ассоциированная с ПНСД у пробанда и его отца [9].

Таким образом, в мировой литературе на сегодняшний день описано более 50 мутаций гена INS у пациентов с гиперпроинсулинемией, транзиторным неонанатальным СД (ТНСД), ПНСД, инсулинзависимым СД без признаков аутоиммунного процесса (СД тип 1В), МОDY10 и СД 2 типа [10]. Понимание молекулярно-генетических основ возникновения СД на современном этапе является необходимым компонентом для разработки новых терапевтических подходов для успешной терапии заболевания [11].

Между тем в нашей стране имеются лишь единичные описания пациентов раннего возраста с СД, ассоциированным с гетерозиготными мутациями в кодирующем регионе гена INS [12–14].

Впервые в отечественной литературе мы представляем описание большой группы пациентов с различными клиническими формами СД, обусловленного мутациями как в кодирующем, так и в некодирующем регионах гена INS. Пациенты с мутацией в интроне гена INS описаны впервые.

ЦЕЛЬ

1. Оценить распространенность мутаций гена INS у пациентов с НСД, дебютом СД от 7 до 12 мес жизни включительно, а также среди пациентов детского возраста с фенотипом МОDY.

2. Проанализировать особенности течения СД в данных клинических группах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Клиническое и лабораторное обследование пациентов и их отбор для включения в исследование проводили во всех учреждениях — участниках работы. Поиск мутаций INS проводили в ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ (Москва).

Исследование продолжалось с 12.2009 по 12.2019 г.

Изучаемые популяции

В исследование были включены 3 группы пациентов:

1-я группа — 60 пациентов с изолированным течением НСД (1а — 12 пациентов с ТНСД, 1б — 48 с ПНСД);

2-я группа — 52 пациента с манифестацией СД от 7 до 12 мес жизни включительно и отсутствием основных аутоиммунных маркеров СД 1 типа (отрицательные антитела к глутаматдекарбоксилазе (GAD), островковым клеткам (ICA), фосфотирозинфосфатазе (IA-2));

3-я группа — 650 пациентов с фенотипом МОDY.

Возраст пациентов на момент проведения исследования варьировал от 1 мес до 18 лет. Медиана возраста пациентов на момент проведения исследования составила 9,8 года [11 мес; 12,3 года].

Критерии постановки диагноза MODY соответствовали рекомендациям ISPAD 2018 г.

1. Наличие СД или гипергликемии натощак у родственников 1-й линии в 2–3 поколениях.

2. Отсутствие признаков аутоиммунного процесса (отрицательный титр антител IAA, ICA, GADA, Zn8) в дебюте заболевания.

3. Сохранная секреция С-пептида и низкая потребность в экзогенном инсулине в течение 5 лет от начала заболевания.

4. Отсутствие выраженного ожирения и/или признаков инсулинорезистентности.

Критерии исключения

1. Наличие аутоиммунных маркеров СД 1 типа.

2. Синдромальные формы СД.

Дизайн исследования

Схема исследования: однократное молекулярно-генетическое обследование пациентов с ПНСД и ТНСД, пациентов с манифестацией СД в возрасте от 7 до 12 мес и пациентов с фенотипом МОDY на предмет выявления мутаций INS. Вид исследования: обсервационное поперечное.

Описание медицинского вмешательства

Взятие крови из периферической вены для молекулярно-генетического исследования.

Основной исход исследования

Обнаружение и молекулярно-генетическая характеристика мутации INS у пациента.

Дополнительные исходы исследования

Особенности клинической картины СД и лабораторных показателей у пациента с мутацией INS. Обнаружение и молекулярно-генетическая характеристика мутаций INS у родственников пациента.

Методы

Молекулярно-генетический анализ проводился в лаборатории отделения наследственных эндокринопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови стандартным методом (набор PureLink, Genomic DNA MiniKit, LifeTechnologies, США). Для молекулярно-генетического анализа применялся метод NGS.

Использовалась разработанная в отделении наследственных эндокринопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» панель праймеров для мультиплексной ПЦР и секвенирования с применением технологии IonAmpliseq™ Custom DNA Panel (LifeTechnologies, США). Секвенирование осуществлялось на полупроводниковом секвенаторе PGM (IonTorrent, LifeTechnologies, США).

Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась с помощью программного модуля TorrentSuite 4.2.1 (IonTorrent, LifeTechnologies, США) и пакета программ Annovar (версия 2014Nov12). В качестве референсных последовательностей кДНК генов-кандидатов использовались ссылки Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Интерпретация результатов исследований и оценка патогенности нуклеотидных изменений проводились согласно международным рекомендациям [15]. Все единичные нуклеотидные варианты с частотой минорного аллеля более чем 0,001 были исключены из последующего анализа [16]. Обозначение мутаций проводилось в соответствии с рекомендациями J. den Dunnen и S. Antonarakis [17].

Все выявленные мутации и полиморфизмы были подтверждены методом Сэнгера. Секвенирование по Сэнгеру проводилось на автоматическом секвенаторе ABI GeneticAnalyzer 3130 (Applied Biosystems, США).

Статистический анализ

Статистический анализ проводился в программе RStudio (Version 1.1.463-2009-2018 RStudio, Inc) с использованием пакета R версии 3.4.4). Нормальность распределения количественных признаков оценивалась по тесту Шапиро–Уилка. Описательная статистика представлена медианами c границами межквартильного интервала. Номинальные данные описывались с указанием абсолютных значений и процентных долей.

Этическая экспертиза

Информированное согласие об участии в исследовании и согласие на молекулярно-генетическое исследование было подписано родителями всех пациентов. Протокол исследования был одобрен в локальном этическом комитете (протокол № 22 от 29.10.2009 года; ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В гене INS мы идентифицировали 13 гетерозиготных мутаций (12 миссенс-мутаций, 1 сплайсинг-мутация) у 16 пробандов и 9 родственников. В 10 случаях мутации возникли de novo, в 6 — были унаследованы от одного из родителей с СД.

Все миссенс-мутации (A22P, L30R, L30P, C31W, G32S, E37K, L41P, V42G, R46P, F48C, R89C, С96Y) были расположены в кодирующей части гена INS, сплайсинг-мутация (с.188–31G>A) — в интроне.

Наиболее часто встречалась мутация G32S: выявлена у 3 пробандов и 2 родственников.

Мутации A22P, L30R, C31W, E37K, L41P, V42G ранее не были описаны.

Спектр нуклеотидных изменений, выявленных в гене INS, представлен в табл. 1.

Подавляющее большинство мутаций было выявлено среди пациентов с ПНСД (9/48, 18,75%) и с дебютом СД от 7 до 12 мес жизни (5/52; 9,6%). В группе с фенотипом МОDY мутации в гене INS были выявлены у 2 пациентов (2/650, 0,3%). У пациентов с ТНСД мутации в гене INS выявлены не были.

Анализ клинических данных у пациентов 1б и 2 групп не показал существенных различий в течении заболевания. В подавляющем большинстве случаев отмечались нормальные весовые показатели при рождении, отражающие достаточную внутриутробную секрецию инсулина; высокий уровень гликемии наряду с неопределяемым уровнем С-пептида при манифестации СД; значительная потребность в инсулинотерапии (табл. 1).

Диабетический кетоацидоз (ДКА) в дебюте заболевания был зарегистрирован у одного пациента с ПНСД и у 2/5 пациентов с манифестацией заболевания от 7 до 12 мес жизни.

Описание клинических случаев

Мутация с.188–31G>A в интроне гена INS была найдена у 2 пациентов с манифестацией СД в 2 и 7 мес жизни.

В первом случае (пациент №15, табл. 1) отмечалось типичное течение ПНСД с кетозом, гипергликемией до 18 ммоль/л в дебюте заболевания и высокой потребностью в инсулинотерапии (0,9 Ед/кг/cут).

У второго пробанда (№16) на фоне полного здоровья при плановом обследовании в возрасте 7 мес была выявлена глюкозурия.

При обследовании в условиях эндокринологического отделения уровень гликемии натощак составил 6,8 ммоль/л, средний уровень гликемии в течение дня — 8,0 ммоль/л, отмечались эпизодические подъемы до 12,0–14,5 ммоль/л после еды, HbA_1c — 7,2% (норма до 6%); С-пептид — 566,1 пмоль/л (343–742), инсулин — 12,15 мкМЕ/мл (2,0–25,0); антитела к β-клеткам, GAD, IA-2 — отрицательные.

Учитывая сохранную секрецию инсулина, отказ родителей от инсулинотерапии, была рекомендована диета с ограничением углеводов с высоким гликемическим индексом. На этом фоне через 4 мес: HbA_1c 8,7%, С-пептид 2,2 нг/мл (1,1–4,4), инсулин 8,5 мкМЕ/мл (2,3–26,4). В связи со стойкой декомпенсацией углеводного обмена инициирована инсулинотерапия по базис-болюсной схеме.

В группе с фенотипом МОDY мутации в гене INS были выявлены у 2 пациентов (2/650, 0,3%). В обоих случаях заболевание носило семейный характер. Приводим описание одной семьи.

Мутация E37K выявлена у пробанда (дебют СД в 4 года), матери пробанда (СД с 11 лет), родной тети по линии матери (СД с 12 лет), двоюродной сестры по материнской линии (СД с 8 лет). У дедушки пробанда по линии материи СД был диагностирован в 18 лет, генетическое исследование не проводилось.

У пробанда СД манифестировал в 4 года с классических симптомов (слабость, утомляемость, жажда), выявлено повышение гликемии до 9,3 ммоль/л. По месту жительства установлен диагноз СД 1 типа, назначена инсулинотерапия по базис-болюсной схеме (лизпро, гларгин).

До 9 лет течение заболевания стабильное на фоне инсулинотерапии 0,6 Ед/кг/cут, HbA_1c 7,5–7,8%.

В возрасте 9 лет обследована в связи с жалобами на головные боли, утомляемость, снижение остроты зрения. По данным МРТ головного мозга выявлено объемное образование хиазмально-селлярной области (краниофарингиома), в послеоперационном периоде диагностирован пангипопитуитаризм (СТГ-дефицит, вторичный гипотиреоз, вторичный гипокортицизм, несахарный диабет).

В послеоперационном периоде течение СД лабильное, HbA_1c около 9–10%, достижение компенсации углеводного обмена затруднено в связи с неконтролируемым чувством голода, прогрессирующей прибавкой массы тела, приемом глюкокортикоидов.

В возрасте 13 лет при плановом обследовании в ФБГУ «НМИЦ эндокринологии», учитывая отягощенный семейный анамнез по СД, проведено молекулярно-генетическое обследование. В гене INS выявлена гетерозиготная мутация E37K.

Клинические характеристики пациентов представлены в табл. 1.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нуклеотидная последовательность гена INS впервые была расшифрована G. Bell и соавт. [18] в 1980 г.

Ген INS картирован на коротком плече хромосомы 11p15.5, состоит из 3 экзонов (экзон 1 — некодирующий) и двух интронов. Второй экзон кодирует сигнальный пептид, В-цепь и часть С-пептида; третий экзон кодирует остаток С-пептида и А-цепь.

Все мутации в гене INS можно разделить на две большие группы: наследуемые по аутосомно-доминантному (АД) и аутосомно-рецессивному типам (АР).

АР-мутации локализованы преимущественно в зоне промотора INS.

Данный тип мутаций вызывает нарушение биосинтеза инсулина на уровне как транскрипции, так и трансляции с помощью различных механизмов, включающих делецию гена, потерю инициирующего сигнала трансляции и нарушение стабильности мРНК [7][19].

Часть мутаций приводит к делеции зоны промотора INS, которая регулируется MAFA и NEUROD1, или к разрушению ДНК-связывающих сайтов для других регуляторных белков, обеспечивающих клеточную специфичность и скорость транскрипции инсулина [7][10].

На сегодняшний день гомозиготные мутации в гене INS описаны преимущественно при ТНСД и также являются наиболее частой причиной ПНСД без экстрапанкреатических проявлений у пациентов, рожденных от близкородственных браков, однако редко встречаются у пациентов с НСД из неродственных семей [7][10][14].

Все мутации, выявленные у наших пациентов, относятся к гетерозиготным миссенс- и сплайсинг-мутациям и расположены как в нетранслируемых областях гена INS (сплайсинг-мутация), так и в кодирующей последовательности (12 миссенс-мутаций), включая область сигнального пептида, A- и В-цепи инсулина и сайт протеолитического расщепления между А-цепью и С-пептидом.

Подавляющее большинство найденных мутаций локализовано во 2-м (L30P, L30R, C31W, G32S, E37K, L41P, V42G, R46P, F48C) и 3-м (С96Y, R89C) экзонах INS, кодирующих критические регионы В-цепи в области формирования эволюционно консервативных дисульфидных связей В7–А7 и В19–А20. Известно, что мутации такого типа приводят к некорректному замыканию дисульфидных связей и нарушению фолдинга молекулы проинсулина [3][4]. Избыточная экспрессия мутантного проинсулина провоцирует развитие стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) и преждевременный апоптоз β-клеток [3][20–22].

В настоящее время появляется все больше данных, что в дополнение к цитотоксическому эффекту накопление мутантного проинсулина блокирует выход проинсулина дикого типа из ЭР панкреатических β-клеток, тем самым уменьшая его продукцию с неповрежденной аллели, что также приводит к дефициту инсулина [8].

Мутации L30R, L41P, C31W, E37K, V42G, А22P ранее не были описаны. В пользу патогенности мутаций L30R, L41P, C31W, E37K, V42G свидетельствует локализация мутаций в критических регионах В-цепи (в частности, описаны миссенс-мутации L30P/V/M/Q, затрагивающие тот же кодон, что и мутация L30R, и мутация C31Y в том же кодоне, что и C31W, ассоциированные с СД) [23], а также (для мутаций С31W и E37K) выявление идентичных мутаций в нескольких поколениях родственников, страдающих СД.

Мутация А22P локализована в сигнальном пептиде и, вероятнее всего, приводит к нарушению отщепления сигнального пептида от препроинсулина с последующим нарушением фолдинга проинсулина и развитием стресса ЭР [24][25].

Клинически для пациентов с гетерозиготными мутациями в кодирующем регионе гена INS было характерно изолированное нарушение углеводного обмена (в подавляющем большинстве случаев — инсулинзависимый СД) с дебютом заболевания как в течение первого полугодия жизни, так и в более старшем возрасте.

Подавляющее большинство мутаций было выявлено у пациентов с ПНСД, что согласуется с данными литературы. Наименьшее количество случаев — в группе пациентов с фенотипом MODY, что еще раз подчеркивает, что MODY10 является редкой формой моногенного СД.

Интересно, что идентичные мутации были найдены среди пациентов из разных возрастных групп.

Существует мнение, что разный возраст начала СД у пациентов с идентичной мутацией может быть связан с индивидуальной скоростью β-клеточного апоптоза, способностью клеток к регенерации и влиянием факторов окружающей среды [26].

Наибольший интерес, на наш взгляд, представляет группа пациентов с манифестацией СД от 7 до 12 мес жизни. Процент выявленных мутаций в гене INS в данной группе достаточно высокий (9,6%), при этом пациенты не подходят ни под возрастные критерии НСД, ни под клинические критерии MODY: в 4 из 5 случаев картина заболевания соответствовала СД 1 типа: острое начало (в 2 случаях — тяжелый диабетический кетоацидоз), выраженное снижение С-пептида, значительная потребность в заместительной инсулинотерапии (0,8–1,0 Ед/кг). Причинами для проведения генетического исследования у этих пациентов послужили относительно ранее начало СД (до 12 мес жизни), наличие СД у одного из родителей (в 2 случаях) и отсутствие основных аутоиммунных маркеров СД 1 типа.

Патогенные мутации в некодирующем регионе гена INS впервые были описаны в зарубежной литературе в 2012 г. [8]. В нашей стране нами впервые была идентифицирована гетерозиготная сплайсинг-мутация: с.188–31G>A (n=2) в интроне гена INS.

Мутация с.188–31G>A была впервые описана I. Garin и соавт. [9] в 2012 г. у двух пациентов с НСД (пробанд и его отец). Данная мутация локализована в терминальном интроне гена и вызывает нарушение сплайсинга путем инсерции 29 нуклеотидов из интронной последовательности в мРНК. Среди наших пациентов мутация с.188–31G>A была найдена у 2 пациентов с манифестацией СД в 2 и 7 мес жизни. Интересно, что в первом случае отмечалось типичное течение ПНСД с кетозом, гипергликемией до 18 ммоль/л в дебюте заболевания и высокой потребностью в заместительной инсулинотерапии (0,9 Ед/кг/сут) с момента манифестации заболевания. Во втором случае заболевание было выявлено в возрасте 7 мес в доклинической стадии при плановом обследовании ребенка (глюкозурия). Инсулинотерапия была назначена только спустя 4 мес от момента установки диагноза и составила 0,3 Ед/кг/cут.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В статье проанализирован вклад мутаций гена INS в структуру НСД, MODY и СД с дебютом от 7 до 12 мес жизни на большой группе пациентов. Проведен анализ клинической картины заболевания. Впервые в России представлена клиническая характеристика случаев СД, обусловленного мутацией в интроне гена INS.

Полученные данные еще раз подчеркивают необходимость анализа гена INS не только у пациентов с ПНСД и фенотипом MODY, но и среди пациентов с манифестацией СД от 7 до 12 мес жизни и отсутствием аутоиммунных маркеров СД 1 типа. Причем отсутствие изменений в кодирующем регионе гена INS является поводом для активного поиска мутаций в интроне.

Еще несколько лет назад результаты генетического исследования у пациентов с мутациями в гене INS могли быть использованы преимущественно для прогнозирования дальнейшего течения заболевания и проведения медико-генетического консультирования в вопросах планирования семьи. Понимание молекулярно-генетических основ возникновения СД на современном этапе является необходимым компонентом для разработки новых терапевтических подходов для успешной терапии заболевания.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование было проведено при содействии Фонда поддержки и развития филантропии «КАФ», гранта РНФ №17-75-30035, бюджетных средств лечебно-профилактических учреждений — участников исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с настоящей публикацией.

Благодарность. Авторы выражают благодарность Фонду поддержки и развития филантропии «КАФ» за помощь в проведении генетического исследования. Выражаем благодарность пациентам и их семьям за участие в исследовании, а также всем региональным эндокринологам России за помощь в проведении обследования пациентов.

Участие авторов: Тихонович Ю.В., Тюльпаков А.Н. — концепция и дизайн исследования; Тихонович Ю.В., Тюльпаков А.Н., Соркина Е.Л., Тимофеев А.В. — написание текста; Тихонович Ю.В., Зубкова Н.А., Гаряева И.В., Рыбкина И.Г., Петряйкина Е.Е., Соркина Е.Л., Тимофеев А.В., Киселев С.Л., Панова А.В., Андрианова Е.А., Светлова Г.Н., Зильберман Л.И., Калинин А.Л., Кулиева Б.П., Малиевский О.А., Колодкина А.А., Шрёдер Е.В. — сбор материала, анализ полученных данных; Тюльпаков А.Н., Васильев Е.В., Петров В.М., Краснова Т.С. — проведение молекулярно-генетического исследования. Рецензия и одобрение рукописи к печати: А.Н. Тюльпаков, А.В. Тимофеев, Е.Е. Петряйкина, С.Л. Киселев, П.М. Рубцов. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.