Сравнительная оценка кардиопротективных свойств эмпаглифлозина, канаглифлозина и ситаглиптина у крыс с экспериментальным сахарным диабетом 2 типа

В настоящее время сахарный диабет (СД) является глобальной проблемой, и по данным Атласа IDF 2019 г. установлено, что этим заболеванием страдают 463 млн человек, то есть каждый 11-й в возрасте от 20 до 79 лет [1]. Вместе с тем в структуре смертности больных СД одно из передовых мест занимает инфаркт миокарда (ИМ), который также относят и к одному из наиболее частых осложнений СД 2 типа (СД2). В России на 2019 г. 8,29 млн человек страдают СД, при этом ишемическая болезнь сердца, в частности ИМ, выявляется практически у 40% больных [1]. В этой связи в современных российских [2] и зарубежных [3] алгоритмах в терапии СД лидирующие позиции занимают сахароснижающие препараты, обладающие плейотропным кардиопротективным эффектом, потенциально способные снижать частоту развития фатального и нефатального ИМ.

Особый интерес в последние годы привлекают препараты класса ингибиторов натрий-глюкозного ко-транспортера (иНГЛТ-2). Результаты международного мультицентрового исследования EMPA-REG OUTCOME (Empagliflozin Cardiovascular Outcome Event Trial in Type 2 Diabetes Mellitus Patients) показали, что применение эмпаглифлозина (ЭМПА) у пациентов с СД2 позволяет снизить общую и сердечно-сосудистую смертность, госпитализацию по поводу сердечной недостаточности, в то же время достоверно не влияя на частоту развития нефатальных ИМ [4]. Данные последнего суб-анализа EMPA-REG OUTCOME свидетельствую о том, что ЭМПА предотвращает риск не только первых, но и повторных событий. И если в отношение первых событий – нефатальных инфарктов - достоверного отличия показано не было, то, если говорить об общих (первых и повторных) событиях, у пациентов с СД2 и сердечно-сосудистыми заболеваниями лечение эмпаглифлозином привело к снижению относительного риска развития ИМ на 21% (ОР 0,79 ДИ (0,620, 0,998)) [5]. Аналогично, в исследовании CANVAS (CANagliflozin cardioVascular Assessment Study) канаглифлозин (КАНА) продемонстрировал способность снижать частоту госпитализаций по поводу сердечной недостаточности, однако частота ИМ не отличалась в группе больных СД2, получавших КАНА, по сравнению с плацебо [6].

Особого внимания, на наш взгляд, заслуживает изучение влияния иНГЛТ-2 не только на частоту развития ИМ, но и на тяжесть его течения, обусловленную в первую очередь объемом поражения миокарда, а также на исходы заболевания.

В настоящее время существует ограниченное число экспериментальных работ, освещающих влияние иНГЛТ-2 на объем некроза миокарда и выживаемость после ИМ, а результаты имеющихся — довольно противоречивы [7–10]. В нескольких работах показано, что ЭМПА не обладает инфаркт-лимитирующим потенциалом, несмотря на положительное влияние на суррогатные конечные точки [7, 8]. Так, в исследовании S.R. Yurista и соавт. терапия ЭМПА как до, так и после моделирования ИМ не повлиял на размер некроза. В то же время фракция выброса левого желудочка у животных, получавших ЭМПА, была достоверно выше, чем в контрольной группе. Дополнительно к этому применение ЭМПА уменьшало выраженность гипертрофии кардиомиоцитов, интерстициального фиброза и оксидативного стресса [7]. Hiroto Oshima и соавт. выявили, что применение ЭМПА в течение 14 дней до моделирования ишемии у крыс с экспериментальным СД позволяет улучшить показатели выживаемости на 70%, несмотря на отсутствие достоверных различий в объеме ИМ у крыс, получавших и не получавших ЭМПА [8]. Следует отметить, что моделирование было проведено на крысах без диабета.

Недавно было опубликовано проспективное, многоцентровое, рандомизированное, двойное-слепое, плацебо-контролируемое исследование на 105 пациентах EMBODY, которое демонстрирует влияние эмпаглифлозина на симпатическую активность у пациентов с острым инфарктом миокарда и СД2, в котором было показано, что раннее назначение эмпаглифлозина пациентам с ОИМ с СД2 может быть эффективным для улучшения иннервации сердца без каких-либо побочных эффектов. Авторы обсуждают потенциальные механизмы, которые могут лежать в основе благоприятного эффекта класса ингибиторов SGLT2 в отношение ИМ [9].

КАНА же, напротив, по данным ряда исследователей, продемонстрировал достоверный инфарктлимитирующий эффект. Так, A.A. Sayour и соавт. показали, что болюсное введение КАНА через 5 мин после начала ишемии миокарда крысам без СД приводит к уменьшению размера некроза по сравнению с применением физиологического раствора. Кроме того, авторы наблюдали более низкий уровень тропонина Т в группе животных, получавших КАНА. Препарат также улучшал систолическую и диастолическую функции миокарда левого желудочка, нарушение которых имело место вследствие ишемического и реперфузионного повреждения [10]. Результаты другого исследования, опубликованные в 2019 г., подтвердили, что назначение КАНА в течение 4 нед до моделирования ИМ как у крыс без СД, так и у крыс с СД вызывает уменьшение объема повреждения миокарда [11].

Насколько нам известно, результаты непосредственного сравнения эффектов ЭМПА и КАНА в рамках одного исследования в литературе отсутствуют. В связи с этим представляется актуальным проведение такого исследования для уточнения плейотропных эффектов и выбора наиболее эффективного, в отношении кардиопротективных свойств, сахароснижающего препарата с целью оптимизации схем терапии СД2.

Нами были выбраны эти два представителя класса иНГЛТ-2 в связи с имеющимися между ними различиями в степени селективности действия на натрий-глюкозный ко-транспортер (НГЛТ) 1 и 2 типа. В качестве препарата сравнения был использован ситаглиптин (СИТА) как представитель класса ингибиторов дипептидилпептидазы-4 (иДПП-4). Результаты международных рандомизированных клинических исследований [12] продемонстрировали, что данный препарат не увеличивает кардиоваскулярный риск, однако и не обладает дополнительным кардиопротективным действием, не приводя к уменьшению частоты развития нефатальных ИМ и не снижая сердечно-сосудистую смертность по сравнению с плацебо («non-inferiority»). Аналогично, в большинстве представленных экспериментальных работ [13][14] описано положительное влияние иДПП-4 на суррогатные конечные точки, такие как функциональное состояние миокарда, оцененное при помощи эхокардиографии, или степень выраженности фиброза, и не подтверждена возможность препаратов этого класса уменьшать объем повреждения миокарда. Таким образом, СИТА, как один из наиболее широко использующихся в клинической практике иДПП-4, может рассматриваться в качестве препарата сравнения с нейтральным влиянием на жесткую конечную точку, каковой является объем некроза миокарда.

ЦЕЛЬ

Изучить влияние ЭМПА и КАНА в сравнении с СИТА на параметры гемодинамики и размер некроза миокарда у крыс с СД в условиях экспериментального ИМ.

МЕТОДЫ

Дизайн

Крысы стока Вистар в течение 4 нед и далее в ходе эксперимента находились на диете с высоким содержанием насыщенных жиров (22%). Через 4 нед от начала опыта осуществлялось введение раствора никотинамида (Nicotimamide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США) 230 мг/кг внутрибрюшинно в качестве панкреатопротектора, через 15 мин — раствора стрептозотоцина (Streptozotocin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США) 60 мг/кг внутрибрюшинно в качестве панкреатотоксина для индукции СД2. Подобная методика моделирования СД2 при помощи содержания животных на диете, богатой насыщенными жирами, с последующим применением никотинамида и стрептозотоцина, применяется в экспериментальных исследованиях [15].

На 2-е и 3-и сутки после введения никотинамида и стрептозотоцина производилось определение гликемии в крови из хвостовой вены. Нормальными считались значения гликемии от 3,3 до 7,8 ммоль/л, поскольку измерение производилось не натощак. При выявлении в 2 измерениях, выполненных в разные дни, гликемии больше 11,1 ммоль/л диагностировался СД. При обнаружении меньших значений гликемии хотя бы в одном из измерений выполнялся пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ). Определение гликемии производилось исходно (натощак), а также через 15, 30 и 60 мин после зондового введения 40% раствора глюкозы 3 г/кг массы тела животного. При выявлении во время ПГТТ, после введения глюкозы, в любой из точек гликемии больше 11,1 ммоль/л диагностировался СД. В случае обнаружения меньших значений гликемии такие животные исключались из дальнейшего эксперимента.

Через 4 нед после введения никотинамида и стрептозотоцина производилось повторное определение гликемии. В последующем животные были разделены на группы «СД» (без лечения), «СД+СИТА» (крысы с СД, получающие терапию СИТА), «СД+ЭМПА» (крысы с СД, получающие терапию ЭМПА), «СД+КАНА» (крысы с СД, получающие терапию КАНА).

Наблюдение за крысами и введение исследуемых препаратов продолжалось в течение 8 нед.

Параллельно была создана группа «Контроль» — крысы без СД, содержавшиеся на стандартном корме в течение 16 нед эксперимента.

Через 16 нед от начала опыта во всех группах осуществлялось моделирование транзиторной ишемии миокарда с применением методики перфузии изолированного сердца, с оценкой параметров гемодинамики и площади некроза миокарда при помощи окраски срезов раствором 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида.

Дизайн исследования представлен на рис. 1.

КРИТЕРИИ СООТВЕТСТВИЯ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ

Исследование выполнялось на крысах-самцах стока Вистар массой 150–250 г, полученных из питомника лабораторных животных «Пущино», на базе Центра доклинических и трансляционных исследований Института экспериментальной медицины НМИЦ им. В.А. Алмазова.

Крысы содержались не более чем по 5 голов в одной клетке, на неограниченном потреблении корма и воды, при фиксированном световом режиме 12.00:12.00 ч (свет:темнота). Температура поддерживалась в пределах 22–25° С, относительная влажность — 50–70%.

Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. В течение карантина проводился ежедневный осмотр каждого животного. Оценивались окраска кожи и видимых слизистых, поведение, характер двигательной активности, наличие судорог, изменение характера дыхательных движений, положение хвоста. Взвешивание производилось при поступлении животных и в период карантина — не реже 1 раза в неделю. Животные, имевшие отклонения по весу, общему состоянию или поведению, не были включены в эксперимент.

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все животные были включены в исследование одномоментно.

Первоначально крысы общей экспериментальной группы находились на диете с повышенным содержанием жиров («Про Корм», «БиоПро», г. Новосибирск, Россия: обменная энергия 2690 ккал/кг, сырой протеин 20%, сырой жир 22%) в течение 4 нед. После индукции СД (введения никотинамида и стрептозотоцина) все крысы общей группы оставались без лечения в течение 4 нед. После разделения на исследуемые группы («СД», «СД+СИТА», «СД+ЭМПА», «СД+КАНА») эксперимент продолжался еще 8 нед. Таким образом, суммарная длительность опыта составляла 16 нед, сахароснижающие препараты вводились в течение 8 нед.

Животные контрольной группы находились на стандартном рационе (Koмбикорм JIБK-120_10 6002, ЗАО «Тосненский комбикормовый завод») в течение 16 нед.

Взвешивание животных и определение потребления корма производились 1 раз в 2 дня в ходе всего эксперимента.

В контрольной группе измерение гликемии осуществлялось в конце 4-й недели (28-й день), 8-й недели (56-й день), 10-й недели (70-й день), 12-й недели (84-й день), 14-й недели (98-й день) и 16-й недели (112-й день) эксперимента (постпрандиальные измерения).

В группе «СД» определение гликемии производилось через 4 нед эксперимента (на 2-й и 3-й день после введения стрептозотоцина), в конце 8-й недели (56-й день), 10-й недели (70-й день), 12-й недели (84-й день), 14-й недели (98-й день) и 16-й недели (112-й день) эксперимента (постпрандиальные измерения).

В группах «СД+СИТА», «СД+ЭМПА», «СД+КАНА» оценку гликемии проводили через 4 нед эксперимента (на 2-й и 3-й день после введения стрептозотоцина), в конце 8-й недели (56-й день), затем каждый 3-й день в течение 8 нед лечения в то же время дня (постпрандиальная гликемия), через 5 ч после лечения.

ОПИСАНИЕ МЕДИЦИНСКОГО ВМЕШАТЕЛЬСТВА

Анестезию проводили золетилом (тилетамина гидрохлорид 30 мг/кг и золазепама гидрохлорид 30 мг/кг) внутримышечно и ксилазина гидрохлоридом 6 мг/кг внутримышечно. После достижения хирургической стадии наркоза производилась широкая тораколапаротомия, обнажались органы грудной полости и извлекалось сердце, после чего оно подключалось к модифицированному аппарату Лангендорфа. Перфузия осуществлялась ретроградно через восходящую аорту, при этом венозный отток перфузата происходил из правых камер сердца. В полость левого желудочка вводили полиэтиленовый баллон, соединенный с датчиком давления для регистрации внутрилевожелудочкового давления и создания адекватной преднагрузки. Перфузию осуществляли с использованием модифицированного буферного раствора Кребса–Хенселейта (состоящего из следующих компонентов [в ммоль/л]: NaCl 118,5; KCl 4,7; NaHCO₃ 25; KH₂PO₄ 1,2; MgSO₄ 1,2; глюкоза 11 и CaCl₂ 1,5) при постоянном давлении 80 мм рт. ст. и температуре +37 °С [16]. При этом левый желудочек сокращался в изоволюметрическом режиме за счет того, что объем введенного в его полость баллона был постоянен и оказывал преднагрузку на физиологическом уровне (не более 12 мм рт. ст.).

После окончания стабилизационного периода продолжительностью 5 мин регистрировали функциональные параметры работы сердца: систолическое левожелудочковое давление (СЛЖД), диастолическое левожелудочковое давление (ДЛЖД), пульсовое левожелудочковое давление (ПЛЖД), а также интенсивность коронарной перфузии (скорость коронарного кровотока).

Полная 30-минутная нормотермическая ишемия миокарда и последующая 90-минутная реперфузия были вызваны обратимым выключением перфузии. В течение периода ишемии каждые 5 мин регистрировали значение внутрилевожелудочкового давления (ВЛЖД) с целью оценки тяжести ишемической контрактуры. В период реперфузии функциональные параметры (коронарный кровоток, СЛЖД, ДЛЖД и ПЛЖД) регистрировались каждые 15 мин.

ОСНОВНОЙ ИСХОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным исходом данного исследования является влияние ЭМПА, КАНА и СИТА на гликемию и объем некроза миокарда. Кроме того, к основным исходам исследования следует отнести изменения гемодинамических параметров (ВЛЖД, ДЛЖД, ПЛЖД, коронарный кровоток), позволяющие дополнительно охарактеризовать потенциальное кардиопротективное действие изучаемых препаратов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ИСХОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дополнительные исходы включают динамику массы тела и потребления корма на фоне исследуемой терапии.

АНАЛИЗ В ПОДГРУППАХ

В ходе исследования были сформированы следующие группы животных:

1.«СД» (n=4) — крысы с экспериментальным СД2 не получали сахароснижающей терапии в течение 12 нед до моделирования ИМ;

2.«СД+СИТА» (n=4) — через 4 нед после индукции СД была начата 8-недельная терапия ситаглиптином (Янувия, Merck Sharp & Dohme B.V., Нидерланды) 50 мг/кг per os 1 раз в день, до моделирования ИМ;

3.СД+ЭМПА» (n=4) — через 4 нед после индукции СД была начата 8-недельная терапия эмпаглифлозином (Джардинс, Boehringer Ingelheim, Германия) 2 мг/кг per os 1 раз в день, до моделирования ИМ;

4.«СД+КАНА» (n=4) — через 4 нед после индукции СД была начата 8-недельная терапия канаглифлозином (Инвокана, Janssen-Cilag S.p.A, Италия) 25 мг/кг per os 1 раз в день, до моделирования ИМ;

5.«Контроль» (n=6) — крысы содержались на стандартном корме в течение 16 нед до моделирования ИМ.

МЕТОДЫ РЕГИСТРАЦИИ ИСХОДОВ

Оценка гемодинамических параметров

При проведении исследования на модели изолированного сердца в полость левого желудочка через левое предсердие вводили неэластичный полиэтиленовый баллон, соединенный с датчиком давления, для регистрации ВЛЖД в период ишемии, а также СВЖД и ДВЖД исходно и в реперфузионном периоде. Значение ПЛЖД рассчитывалось как разница между СЛЖД и ДЛЖД. Указанные параметры регистрировали с помощью программы PhysExp (Cardioprotect Ltd., Санкт-Петербург, Россия). Скорость коронарного кровотока определяли путем измерения времени оттока перфузата.

Определение площади инфаркта миокарда

По окончании реперфузии осуществлялось измерение объема необратимо поврежденного миокарда желудочков методом гистохимического окрашивания поперечных срезов сердца 1% раствором 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (MP Biomedicals, США). Срезы инкубировались в указанном растворе в течение 15 мин, при этом жизнеспособный миокард окрашивался в ярко-красный цвет. Участки необратимо поврежденного миокарда оставались неокрашенными. Затем производились фотографирование срезов и компьютерная обработка изображений с последующим вычислением значения площади поврежденного миокарда, выражаемой в процентах от общей площади миокарда желудочков, с помощью программ ImageJ, Adobe Photoshop 8.0.

Определение гликемии

Производилась пункция хвостовой вены, после чего содержание глюкозы в полученной капле венозной крови измерялось при помощи прибора определения гликемии и кетонемии StatStrip (Nova Biomedical, США).

Определение веса животных и корма

Масса тела крыс и масса потребленного корма определялись 1 раз в 2 дня в одно и то же время при помощи портативных весов.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Проведение настоящего исследования одобрено Комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных (IACUC) Национального медицинского исследовательского центра им. В.А. Алмазова, протокол № 19-1П3#V1 от 14.01.2019. Резюме Комиссии по контролю содержания и использования лабораторных животных: «Протокол утвержден».

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: Статистическая обработка данных производилась при помощи программного пакета IBM SPSS Statistics-22 (IBM, США) и Statistica-10 (Statsoft, США). Статистический анализ производился при помощи непараметрических методов. Значимость различий между группами оценивалась с помощью непараметрического критерия Крускала–Уоллеса и Манна–Уитни для независимых выборок, с применением непараметрического дисперсионного анализа (апостериорное попарное сравнение групп при помощи критерия Данна). Все показатели представлены в виде «медиана (25%; 75%)». Значения Р меньше 0,05 рассматривались как значимые.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

За время акклиматизационного периода у животных не были обнаружены симптомы, не позволившие включить их в дальнейшее исследование. В опыт были включены 24 крысы Вистар массой 121,00 (201,75; 222,25) г.

Основные результаты исследования

Уровень гликемии в группе «СД» был достоверно выше такового в группе «Контроль» на протяжении всего эксперимента. Контроль гликемии при применении всех трех исследуемых препаратов был удовлетворительным и не превышал уровня 7,8 ммоль/л, характеризующего постпрандиальную гликемию в норме, в отсутствие СД. Показатели гликемии не различались между группами «СД+СИТА», «СД+ЭМПА» и «СД+КАНА» и не превышали таковые в группе здорового контроля (рис. 2).

Рисунок 2. Динамика гликемии в ходе эксперимента.
Результаты представлены в виде медианы (25; 75)%. * — p<0,05 по сравнению с группой «Контроль». § — p<0,05 по сравнению с группой «СД». СТР — стрептозотоцин.

В ходе моделирования глобальной ишемии в группе «СД» наблюдалось достоверно более выраженное нарастание ВЛЖД, чем в контрольной группе. Ни один из исследуемых препаратов не вызвал значимого снижения ВЛЖД по сравнению с группой животных с СД без лечения. В то же время нами были обнаружены различия в степени выраженности ишемической контрактуры при применении СИТА, ЭМПА и КАНА. Так, ишемическая контрактура в группе «СД+КАНА» имела тенденцию к снижению по сравнению с таковой в группе «СД+СИТА» через 10 и 15 мин и была достоверно менее выраженной на 20-й минуте. Более того, ВЛЖД в группе «СД+КАНА» было ниже, чем в группе «СД+ЭМПА», начиная с 20-й минуты до конца периода ишемии. Необходимо отметить, что ВЛЖД у животных, получавших КАНА, не отличалось от значений данного параметра у здоровых животных контрольной группы на 10-й и 15-й минутах ишемического периода (рис. 3А). Таким образом, мы можем предположить, что КАНА способен уменьшать выраженность ишемической контрактуры, чем может быть обусловлен его потенциальный кардиопротективный эффект.

Мы не выявили различий в уровне ДВДЖ в реперфузионном периоде между группами «Контроль» и «СД». В то же время необходимо отметить, что в группе «СД+СИТА» уровень ДВДЖ был выше, чем в контрольной группе и даже выше, чем в группе «СД» в ряде точек измерения. У животных с СД, получавших ЭМПА, ДВЖД достоверно не отличалось от такового у животных с СД без лечения, в то же время будучи достоверно выше, чем в контрольной группе на 75-й и 90-й минутах реперфузии. Аналогично, в группе «СД+КАНА» ДВЖД не отличалось от этого показателя в группе «СД», но было выше, чем в группе «Контроль». ДВЖД было выше в группе «СД+СИТА», чем в группе «СД+ЭМПА», различия между группами «СД+ЭМПА» и «СД+КАНА» находились на уровне статистической тенденции (рис. 3Б).

Значение ПВЖД исходно было выше в группе «Контроль» по сравнению с группой «СД», однако, как и в случае с показателем ДВЖД, в реперфузионном периоде достоверных различий между группами выявлено не было. ПВЖД у животных с СД на фоне терапии СИТА не отличалось от такового у животных с СД без лечения. Аналогично, терапия ЭМПА не привела к нарастанию ПВЖД по сравнению с животными с СД без лечения. Достоверные различия между группами «СД+СИТА» и «СД+ЭМПА» отсутствовали. В то же время необходимо отметить, что у крыс, получавших КАНА, ПВЖД в ряде точек измерения было достоверно ниже, чем у крыс, получавших ЭМПА, и преимущественно не отличалось от ПВЖД в группе «Контроль», в ряде точек будучи также ниже показателей контрольной группы (рис. 3В).

Таким образом, можно заключить, что КАНА, достоверно снижая выраженность ишемической контрактуры, не оказывает положительного влияния на гемодинамические параметры в реперфузионном периоде.

Мы не обнаружили значимых различий в коронарном кровотоке между группами «Контроль» и «СД» исходно и в течение периода реперфузии. Коронарный кровоток в группе «СД+СИТА» не отличался от такового в группе «СД». В то же время крысы с СД, получавшие ЭМПА, имели значимо более высокую скорость кровотока на 15-й и 30-й минутах реперфузионного периода, чем крысы с СД без лечения, применение же КАНА не привело к нарастанию скорости кровотока по сравнению с группой «СД» без лечения. Коронарный кровоток был выше в группе «СД+ЭМПА», чем «СД+СИТА», во всех точках измерения, а также выше, чем в группе «СД+КАНА», на 30-й и 45-й минутах реперфузионного периода (рис. 3Г).

Площадь повреждения миокарда в группе «СД» (57,26 (45,51; 70,08)%) была больше, чем в группе «Контроль» (42,98 (33,26; 61,84)%), р<0,05. Применение СИТА не оказало инфаркт-лимитирующего действия, площадь некроза в группе «СД+СИТА» (62,92 (41,29; 75,84)%) не отличалась от таковой в группе «СД» без сахароснижающей терапии (57,26 (45,51; 70,08)%), р>0,05. В то же время размер инфаркта в группах «СД+ЭМПА» (37,90 (20,76; 54,66)%) и «СД+КАНА» (46,15 (29,77; 50,55)%) был достоверно меньше, чем в группе «СД» (р<0,05 для обоих сравнений). Различий между группами «СД+ЭМПА» и «СД+КАНА» не было. Более того, площадь некроза в группах «СД+ЭМПА» и «СД+КАНА» не отличалась от таковой в группе «Контроль» (р>0,05) (рис. 3Д). Репрезентативные изображения срезов миокарда при инкубации их с раствором 1% трифенилтетразолия хлорида представлены на рис. 3Е.

Рисунок 3. Гемодинамические параметры и размер инфаркта миокарда в изолированном сердце в условиях 30-минутной глобальной ишемии с последующей 90-минутной реперфузией.
(A) Ишемическая контрактура, (Б) ДВЖД, (В) ПВЖД, (Г). Коронарный кровоток исходно и в течение эксперимента. Результаты представлены в виде медианы (25; 75)%. (Д) Площадь инфаркта миокарда. (Е) Репрезентативные изображения срезов миокарда при инкубации с раствором 1% трифенилтетразолия хлорида. * — p<0,05 по сравнению с группой «Контроль». § — p<0,05 по сравнению с группой «СД». ¶ — <0,05 при сравнении между группами «СД+ЭМПА» и «СД+КАНА».

Дополнительные результаты исследования

Как в группе «Контроль», так и в группе «СД» прибавка массы тела была равномерной, при этом в группе «СД» она была более интенсивной на протяжении всего эксперимента. В группе «СД+СИТА» прибавка массы тела была больше, чем в контрольной группе, и больше, чем в группе «СД». Назначение КАНА животным с СД привело к замедлению прибавки массы тела, последняя оставалась стабильной на протяжении всего времени применения препарата. Масса тела крыс в группе «СД+КАНА» была достоверно меньше, чем в группе «СД+СИТА», в течение всего времени применения препаратов. Примечательно, что, вопреки имеющимся клиническим данным о способности ЭМПА снижать массу тела [17][18], мы не наблюдали данного феномена в ходе нашего эксперимента. В группе «СД+ЭМПА» прибавка массы тела была более интенсивной, чем в группах «СД», «СД+КАНА» и «СД+СИТА» (рис. 4А).

Потребление корма в группе «Контроль» было равномерным в течение всего эксперимента. В группе «СД» наблюдалось прогрессивное нарастание потребления корма, наиболее выраженное с 8-й по 12-ю неделю. Данный показатель был достоверно больше в группе «СД» по сравнению с «Контролем». В группе «СД+СИТА» после значительного нарастания потребления корма наблюдалась его стабилизация. В большинстве точек измерения различий между группами «СД» и «СД+СИТА» не было. Примечательно, что потребление корма в группах «СД+ЭМПА» и «СД+КАНА» превышало таковое в группе «СД» в конце эксперимента, с 14-й по 16-ю недели (рис. 4Б).

Рисунок 4. Динамика массы тела и потребления корма в ходе эксперимента.
Динамика (A) массы тела и (Б) потребления корма. Результаты представлены в виде медианы (25; 75)%. * — p<0,05 по сравнению с группой «Контроль». § — p<0,05 по сравнению с группой «СД». ¶ — <0,05 при сравнении между группами «СД+ЭМПА» и «СД+КАНА».

Таким образом, мы показали, что потребление корма при применении СИТА стабильно и не отличается от такового у животных с СД без лечения. СИТА не оказывает влияния на массу тела, не замедляя ее закономерный прирост. Нам не удалось выявить супрессивного действия иНГЛТ-2 ЭМПА и КАНА на аппетит животных — потребление корма при применении этих двух препаратов не различалось и было высоким, превышая даже таковое у животных с СД без лечения. В то же время применение КАНА, но не ЭМПА, привело к стабилизации массы тела, замедлив ее закономерный прирост. На наш взгляд, такое различие во влиянии данных двух препаратов на массу тела может быть связано со степенью селективности их взаимодействия с НГЛТ. Возможно, в данном случае замедление прибавки массы тела под влиянием КАНА обусловлено взаимодействием препарата с НГЛТ 1 типа в кишечнике, а значит, уменьшением всасывания углеводов [19][20], чего не происходит на фоне терапии высокоселективным в отношении НГЛТ-2 ЭМПА.

Нежелательные явления

В ходе исследования нежелательных явлений выявлено не было.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

В ходе нашего исследования было выявлено, что длительная терапия ЭМПА и КАНА оказывает инфаркт-лимитирующее действие у крыс с СД при моделировании транзиторной 30-минутной глобальной ишемии миокарда. Данный эффект одинаково выражен у высокоселективного иНГЛТ-2 ЭМПА и низкоселективного КАНА. Кроме того, оба препарата обладают положительным, при этом различным, влиянием на параметры гемодинамики. Так, применение КАНА позволяет уменьшить выраженность ишемической контрактуры, ЭМПА приводит к нарастанию перфузии миокарда. СИТА не обладает положительным влиянием ни на гемодинамические параметры, ни на площадь повреждения миокарда у крыс с экспериментальным СД. Кардиопротективный эффект ЭМПА и КАНА является плейотропным, не обусловленным положительным воздействием препаратов на гликемический профиль.

Обсуждение основного результата исследования

Насколько нам известно, наша работа представляет собой первое экспериментальное сравнительное исследование кардиопротективных свойств двух иНГЛТ-2 с разной степенью селективности в отношении типов НГЛТ. Мы не выявили различий в выраженности инфаркт-лимитирующего действия высокоселективного ЭМПА и низкоселективного КАНА.

НГЛТ-2 экспрессируется преимущественно в проксимальных канальцах почек и ответственен за реабсорбцию около 90% глюкозы, попадающей в первичную мочу. Отсутствуют достоверные данные о наличии НГЛТ-2 в эндотелии сосудов или миокарде. НГЛТ-1 представлен в слизистой оболочке тонкой кишки, в проксимальных канальцах почек, а также в миокарде и в капиллярах различных органов и тканей [21]. В связи с описанной экспрессией НГЛТ 1 и 2 типа особый интерес вызывает факт отсутствия существенных различий в выраженности кардиопротективного эффекта высоко- и низкоселективных иНГЛТ. Вероятным представляется вовлечение в процесс непрямых механизмов защиты.

Было показано, что применение ЭМПА до моделирования ишемии миокарда приводит к снижению уровня малонового диальдегида и интерлейкина-6, а также уменьшению экспрессии миокардиальной индуцибельной NO-синтазы, положительно влияя на регуляцию окислительно-восстановительных процессов и подавляя воспалительную реакцию [22]. Кроме того, терапия ЭМПА при экспериментальном ИМ приводит к снижению повреждения митохондриальной ДНК и стимулирует митохондриальный биогенез, что сопровождается нормализацией захвата и окисления глюкозы и жирных кислот кардиомиоцитами [6].

A.A. Sayour и соавт. обнаружили, что КАНА увеличивает фосфорилирование аденозин-монофосфат-активируемой протеинкиназы (АМРК) и эндотелиальной NO-синтазы. Кроме того, при применении исследуемого препарата в условиях экспериментального ИМ изменялось соотношение Bax/Bcl-2 в пользу превалирования антиапоптотических факторов. Наконец, при лечении КАНА наблюдалась значимо меньшая активность 4-гидроксиноненала, что свидетельствует о меньшей выраженности оксидативного стресса. Показательно, что in vitro инкубация поперечных срезов аорты с КАНА достоверно увеличивала эндотелий-зависимую вазодилатацию [8].

Несмотря на выявленный нами достоверный кардиопротективный эффект ЭМПА и КАНА, мы не обнаружили положительного воздействия СИТА ни на параметры гемодинамики, ни на площадь некроза миокарда. В то же время контроль гликемии был сходно удовлетворительным при применении всех трех изучаемых препаратов. Это позволило нам сделать вывод о том, что кардиопротективный эффект ЭМПА и КАНА является самостоятельным, не обусловленным их влиянием на гликемический профиль. Непосредственные механизмы реализации данного эффекта требуют дальнейшего изучения.

Мы предполагаем, что, учитывая наличие инфаркт-лимитирующего действия как у высокоселективного ЭМПА, так и у низкоселективного КАНА, можно заключить, что способность данных препаратов уменьшать объем повреждения миокарда в условиях ишемического и реперфузионного повреждения является класс-эффектом. Полученные данные, на наш взгляд, создают предпосылки для проведения дальнейших клинических исследований с оценкой способности иНГЛТ-2 уменьшать объем повреждения миокарда, что, в свою очередь, обусловливает потенциальное влияние этого класса на ближайший и отдаленный прогноз у данных больных.

Ограничения исследования

Ограничения данного исследования, на наш взгляд, связаны с тем, что проведение опыта на изолированном сердце не позволяет оценить выживаемость после ИМ на фоне различных вариантов сахароснижающей терапии, а также влияние препаратов на функциональный статус организма. В дальнейшем целесообразным представляется моделирование ИМ in vivo с последующим динамическим наблюдением за животными на фоне применения различных препаратов, в том числе иНГЛТ-2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, ранее проведенные экспериментальные исследования предоставляют противоречивые данные о способности различных представителей класса иНГЛТ-2 оказывать инфаркт-лимитирующий эффект при моделировании ишемии миокарда. Сравнение выраженности кардиопротективного действия ЭМПА и КАНА между собой, а также с препаратом другого класса с нейтральным влиянием на сердечно-сосудистую систему, каким является СИТА, в рамках одного исследования ранее не производилось. Мы показали, что как высокоселективный иНГЛТ-2 ЭМПА, так и низкоселективный КАНА обладают одинаково выраженной способностью уменьшать площадь повреждения миокарда у животных с СД2 в условиях экспериментального ИМ. При этом, вероятно, кардиопротективный эффект КАНА, по крайней мере отчасти, обусловлен его способностью уменьшать ишемическую контрактуру, а ЭМПА — улучшать показатели перфузии миокарда, повышая коронарный кровоток.

Требуется дальнейшее изучение влияния иНГЛТ-2 на показатели гемодинамики и объем некроза миокарда in vivo, а также исследование подлежащих механизмов.

Данная экспериментальная работа создает предпосылки для клинического изучения потенциального инфаркт-лимитирующего действия иНГЛТ-2 с целью использования данного класса препаратов в качестве первичной и вторичной профилактики ИМ у пациентов с СД2.