Спонтанная и индуцированная секреция провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у пациентов с сахарным диабетом 2 типа и синдромом диабетической стопы

Сахарный диабет 2 типа (СД2) в настоящее время является актуальной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Согласно прогнозам, к 2035 г. количество пациентов с СД возрастет до 471 млн [1], а к 2045 г. увеличится до 629 млн человек [2].

Число пациентов с поздними осложнениями СД ожидаемо увеличивается. К многочисленным осложнениям СД, развивающимся в условиях гипергликемии, относится и дистальная симметричная полинейропатия (ДСПН) [3]. Наиболее частой причиной неблагоприятного воздействия на нервную систему является длительный метаболический дисбаланс. Различные клинические исследования подтверждают этот факт. Диабетические невропатии и ангиопатии также вызывают клеточную дисфункцию и нарушение гомеостаза тканей и целых органов. В случаях дефицита инсулина потребность в глюкозе в нервной ткани активирует полиоловый путь, что приводит к развитию окислительного стресса (ОС) через чрезмерную выработку свободных радикалов [4]. В условиях гипергликемии атеросклероз прогрессирует в результате окислительной модификации липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) с последующим усилением поглощения моноцитами, которые превращаются в пенистые клетки, участвующие в доатерогенной липидной инфильтрации сосудистой стенки [5]. Модифицированные частицы ЛПНП начинают самопроизвольно агрегировать после изменения поверхностного заряда [6]. Наличие медиаторов воспаления, таких как фактор некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкины (IL) в атеросклеротической бляшке, поддерживает хроническое воспаление. Признаки локальных и системных неспецифических воспалительных процессов при атеросклерозе появляются на начальных стадиях поражения в стенке артерии [7]. Клетки крови, такие как моноциты, играют ключевую роль в процессе атеросклеротического воспаления. ­Моноциты, мигрируя в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги с участием многих транскрипционных факторов, причем основным фактором является фактор ядерной транскрипции каппа B (NF-κB). Цитокины и медиаторы воспаления активируют NF-κB в нейронах и нейроглии, способствуя пролиферации нервов [8]. Активированный NF-κB во время ОС отвечает за экспрессию 500 различных генов, ферментов, и про- и противовоспалительных медиаторов. Экспрессия NF-κB наиболее выражена у пациентов с хроническими заболеваниями, включая пациентов с диабетом. Активация NF-κB при СД связана с самоокислением глюкозы и избыточным образованием активных форм кислорода (АФК), что приводит к активации протеинкиназы С (ПКС) [9]. Моноциты, которые проникают в интиму, частично проходят дифференцировку и пролиферацию, превращаясь в макрофаги под воздействием колониестимулирующих факторов (макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и др. факторы, секретируемые эндотелиальными клетками). Они экспрессируют рецепторы акцептора, а затем трансформируются в пенистые клетки. Пластичность макрофагов связана с их трансформацией в провоспалительные и противовоспалительные фенотипы. M-CSF индуцирует образование фенотипа моноцитов, который не трансформируется в пенистые клетки и дополнительно секретирует провоспалительные цитокины, такие как IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF-α. Этот путь трансформации моноцитов определяется как классический (М1) путь провоспалительной активации [10]. GM-CSF активирует противовоспалительный (М2) путь. Модифицированные по этому пути моноциты приобретают способность секретировать противовоспалительные цитокины и хемокины, т.е. IL-4, IL-10, IL-13, трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), C-C мотив-хемокиновый лиганд 18 (CCL18) и др. Этот альтернативный путь трансформации обеспечивает контроль над всеми хроническими воспалительными процессами. В нормальных условиях моноциты неактивны. Провоспалительный фенотип активируется в присутствии внутриклеточных патогенов или под влиянием интерферона-γ (IFN-γ), тогда как противовоспалительный фенотип стимулируется внеклеточными паразитами или IL-4. Их способность к активации оценивается по уровням секретируемого цитокина и хемокина. Моноциты ­могут активироваться в воспалительной среде, и этот процесс зависит от микросреды. Дисрегулированные моноциты контролируют развитие воспалительных заболеваний [11]. С развитием регенеративной медицины и тканевой инженерии роль моноцитов, цитокинов и хемокинов, выделяемых ими, приобрела важное значение. Дисфункция моноцитов связана с возникновением и развитием аутоиммунных заболеваний, новообразований и других хронических воспалительных состояний. Недавние исследования показали роль молекулярных механизмов в развитии СД. Они включают регуляцию и транспорт пептидов, а также контроль за тенденцией и интенсивностью иммунной атаки [12]. СД ассоциируется с хроническим воспалительным состоянием, которое в конечном итоге приводит к дисбалансу и нарушению регуляции иммунной функции кожи. Нарушение регуляции образования АФК, реактивного азота и протеаз приводит к сохранению воспаления. Диабетическая раневая среда характеризуется чрезмерным и длительным воспалением, что связано с плохим заживлением, а у человека приводит к развитию диабетических язв на стопе. Тем не менее основные механизмы, которые способствуют чрезмерному воспалению, остаются неизвестными.

Состояние иммунной системы также может способствовать развитию хронических ран нижних конечностей. В нормально заживающих ранах воспалительные клетки первоначально проявляют как М1-, так и М2-активацию фенотипов во время воспалительной фазы (первые ­несколько дней), затем переходят к преимущественному фенотипу активации М2 при пролиферативной/неоваскуляризации фазе заживления (к 7-му дню). Влияние диабетической среды на активацию воспалительных клеток также было недавно изучено [13]. Однако в этих исследованиях не учитывался ответ отдельных воспалительных клеток in situ. Имеются лишь ограниченные данные относительно регуляции активации про- и противовоспалительных моноцитов и их эффективности in vivo. Открытым остается вопрос о том, предопределяются ли про- и противовоспалительные ответы моноцитов в процессе регенерации ткани или их дифференциация зависит от местной среды. Поскольку про- и противовоспалительные процессы имеют решающее значение в различных фазах заживления ран, можно предположить, что нарушения иммунной системы могут мешать тканевому гомеостазу и заживлению ран после появления язв и привести к развитию хронических незаживающих ран, которые характерны для синдрома диабетической стопы (СДС).

В связи с этим, помимо борьбы с гипергликемией, открываются новые перспективы в лечении ДСПН, которые заключаются в проведении терапии, направленной на улучшение метаболизма нервной ткани и восстановление макрофагального баланса – снижение провоспалительной активности макрофагов. Клинически перспективным является подход с применением нейротропных витаминов группы В и их производных, которые воздействуют непосредственно на поврежденные ткани [14].

ЦЕЛЬ

Изучение спонтанной и индуцированной секреции провоспалительного цитокина TNF-α и противовоспалительного хемокина CCL18 моноцитами-макрофагами в культуральной среде пациентов, длительно страдающих СД2, как на фоне язвенных поражений стоп, так и без них, а также влияния курсового применения препарата Кокарнит в составе комплексной симптоматической терапии на динамику выраженности симптомов ДСПН и цитокиновый фенотип в подгруппе пациентов с длительно незаживающими язвами нижних конечностей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено наблюдательное проспективное контролируемое нерандомизированное исследование.

Критерии соответствия

В исследование включали пациентов:

1.подписавших датированное информированное согласие;

2.мужчин и женщин в возрасте ≥35 лет;

3.с впервые выявленным СД2, не получавших ранее сахароснижающую терапию, или

4.длительно страдающих СД2 с ДСПН без СДС, получающих комбинированную сахароснижающую ­терапию, или

5.длительно страдающих СД2 с СДС, получающих терапию инсулином.

Основными критериями исключения были:

1.текущее воспалительное состояние (одонтогенное, легочное, тазовое и т. д.) и/или хроническое заболевание;

2.злоупотребление алкоголем;

3.табакокурение;

4.стадия хронической болезни почек ≥С3b, включая диализ при острой почечной недостаточности в течение 12 месяцев до включения в исследование;

5.острая ВИЧ-инфекция, гепатит С/В, цирроз печени;

6.анамнез инфаркта миокарда и/или инсульта в течение 2 мес до включения в исследование;

7.беременность или кормление грудью;

8.декомпенсированный гипотиреоз;

9.острая травма, хирургическое или другое состояние;

10.язва стопы с признаками системной воспалительной реакции.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) в рамках научно-исследовательской темы «Разработка и совершенствование клинико-фармакологических технологий персонализированной медицины для повышения эффективности и безопасности фармакотерапии социально-значимых заболеваний» совместно кафедрами клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней и эндокринологии Института клинической медицины. Набор пациентов проводился на клинических базах кафедр: ГБУЗ ГКБ №4 ДЗМ, ГБУЗ ГКБ №70 им. Е.О. Мухина ДЗМ, ГБУЗ ГКБ №67 им.  Л.А. Ворохобова ДЗМ, филиал №1 ГП №67 ДЗМ.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось в течение 2014–2018 гг.

Описание медицинского вмешательства

В исследование был включен 121 пациент с СД2 с различной длительностью заболевания. Уровень гликемии в сыворотке крови определяли гексокиназным методом. Определение гликированного гемоглобина (HbA_1c) проводили с помощью автоматизированной системы капиллярного электрофореза Capillarys 2 (SebiaSA, Франция), липидного спектра крови – на автоматическом биохимическом анализаторе AU 680 (BecmanCoulter, США). Неврологическое обследование нижних конечностей проводили с помощью количественных тестов. Оценка клинической эффективности проводимой терапии осуществлялась по шкале ТSS (Total Symptom Score – общая оценка симптомов невропатии). Нами проведены исследование по изучению эффективности применения препарата Кокарнит в составе комплексной терапии ДСПН, а также оценка цитокинового статуса пациентов при применении Кокарнита у пациентов с длительными незаживающими язвенными дефектами стоп. Кокарнит представляет собой комплекс метаболически активных соединений: трифосаденина динатрия тригидрат 10 мг, ­кокарбоксилаза 50 мг, цианокобаламин 0,5 мг, никотинамид 20 мг. Препарат выпускается в виде лиофилизата для приготовления раствора. Рекомендованная продолжительность курсового применения препарата в соответствии с инструкцией к медицинскому применению составляет 9 дней, препарат вводят 1 раз в сутки внутримышечно в дозе 2 мл. Пациенты наблюдались в течение 12 нед. Проведено 4 визита: 0 визит – базовый (подписание формы информированного согласия, оценка критериев включения, невключения, назначение препарата); 1-й визит – через 9 дней от начала терапии; 2-й визит – через 4 нед от ­начала терапии; 3-й визит – через 12 нед от начала терапии. Во время всех визитов у пациентов для количественной оценки выраженности симптомов использовалась шкала TSS. На 0 визите у всех пациентов определен цитокиновый статус; на 1-м визите в подгруппе пациентов с длительно незаживающими язвами нижних конечностей повторно определен цитокиновый статус. На визитах 0, 1 и 2 проведены стандартные общий и биохимический анализ крови. На визите 3 исследователем сделаны общее заключение об эффективности лечения, оценка наличия/отсутствия побочных эффектов от лечения.

При включении в исследование ни у одного из пациентов не отмечалось клинических симптомов системного воспаления. Пациенты с длительным анамнезом СД получали инсулиновую терапию для достижения целевого уровня HbA_1c. Пациенты не получали гиполипидемические препараты, а также другие препараты, влияющие на воспаление.

Процедура выделения моноцитов/макрофагов крови человека и стимуляция клеток по провоспалительному (М1) и противовоспалительному (М2) фенотипам.

Кровь в количестве 20 мл забирали натощак в стерильных условиях из локтевой вены в стерильную пластиковую пробирку объемом 20 мл, содержащую 2 мл стерильного 3,8% цитрата натрия в изотоническом фосфатном буфере (ИФБ) в качестве антикоагулянта. Полученные образцы крови транспортировали в лабораторию медицинской генетики НМИЦ кардиологии (руководитель лаборатории профессор д.м.н. И.А. Собенин) в день забора крови. Из образцов крови отбирали плазму и добавляли в кровь раствор ИФБ до первоначального объема. Для получения чистой популяции моноцитов проводили магнитную сепарацию положительных к кластеру дифференцировки 14 (CD14⁺) клеток с использованием парамагнитных наночастиц, конъюгированных с антителами к CD14. Раствор парамагнитных наночастиц добавляли непосредственно к образцу крови в количестве 50 мкл на 10 мл крови и инкубировали в течение 30 мин. Далее образец наносили на колонку для магнитной сепарации, после чего оставшиеся в колонке CD14⁺ моноциты вымывали из колонки и переносили в культуру. Этот подход позволял получать клеточную популяцию, содержащую не менее 95% моноцитов. Полученные клетки ресуспендировали в концентрации 10⁶ клеток/мл в среде «X-vivo 10». Полученную суспензию клеток распределяли в 24-луночный планшет из расчета 1×10⁶ клеток на лунку. Клетки культивировали при 37 °С и 5% СО₂ в СО₂-инкубаторе.

Функциональный анализ активации моноцитов заключался в измерении концентраций цитокинов, секретируемых клетками в стандартных условиях в ответ на провоспалительную стимуляцию интерфероном-гамма (ИФН-γ) в концентрации 100 нг/мл или противовоспалительную стимуляцию интерлейкином-4 (ИЛ-4) в концентрации 10 нг/мл. Секреция фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α) рассматривалась как маркер провоспалительной активации моноцитов, а секреция ССL18 – как маркер противовоспалительной активации. Концентрации ФНО-α и ССL18 в культуральной среде измерялись твердофазным иммуноферментным анализом через 1 и 6 дней после стимуляции моноцитов соответственно. Полученные результаты уровней цитокинов выражены в пг/мл. Из пациентов основной группы была выделена подгруппа с длительно незаживающими язвенными дефектами стоп (n=18). В данной группе пациентов дополнительно было проведено определение базального и стимулированного уровней цитокина TNF-α и хемокина ССL18 в 1-й и 9-й день применения препарата Кокарнит.

Основной исход исследования

За первичную суррогатную точку принимали показатель про- и противовоспалительной поляризации моноцитов/макрофагов у больных СД2 с ДСПН без СДС и с СДС, за вторичную суррогатную точку принимали секрецию про- и противовоспалительных цитокинов на фоне применения метаболического препарата у больных с длительно незаживающим язвенным дефектом при СДС.

Этическая экспертиза

Проведение данного исследования было одобрено комитетом по этике Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (выписка из протокола №11–13 от 13.11.2013 г.). Получено информированное согласие на участие в исследовании у всех пациентов.

Статистический анализ

Математико-статистическая обработка полученных результатов проведена на персональном компьютере с помощью полнофункциональной статистической системы IBM SPSS Statistics 18 и программы для работы с электронными таблицами MS Excel 2013 с определением медианы [Me] и перцентилей Q [25; 75]. Различия между группами выявляли по U-критерию Манна–Уитни, Z-критерию Колмогорова–Смирнова. Попарный частотный анализ между группами проводили с помощью достоверности различий хи-квадрата и точного решения Фишера. Корреляционную зависимость определяли с помощью ранговой корреляции Спирмена (p) и линейного коэффициента Пирсона (r). Статистически значимым считали до 5% уровня значимости (p<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование был включены121 пациент с СД2 с различной длительностью заболевания. В 1-ю группу вошли 28 пациентов с впервые выявленным СД2, во 2-ю  – 51 пациент с СД2 с ДСПН без поражений стоп (длительность анамнеза СД2 10 [5; 15] лет), в 3-ю – 42 пациента с язвенными дефектами (длительность анамнеза СД2 12 [6; 20] лет). 14 пациентов с СДС (7 м/7 ж) страдали нейропатической формой СДС; 38 пациентов (22 м/6 ж) – нейроишемической формой. В зависимости от фазы раневого процесса местно применялись антисептические атравматические повязки, суперпоглотители, альгинаты кальция и др. Клинико-лабораторные показатели обследуемых представлены в таблице 1. Пациенты с СД2 с различной длительностью течения заболевания СД значимо не различались между собой.

Таблица 1. Характеристика обследованных пациентов с сахарным диабетом 2 типа

Примечания: параметрические данные представлены с помощью средних величин [m] и среднеквадратического отклонения [σ], непараметрические – в виде медиан (me) и перцентилей (q) [q25; q75]. Различия между группами выявляли с помощью т-критерия Стьюдента, u-критерия Манна–Уитни и z-критерия Колмогорова–Смирнова, р<0,001**; р<0,05*. СД2 – сахарный диабет 2 типа; СДС – синдром диабетической стопы; ИМТ – индекс массы тела; ХС – холестерин; ТГ – триглицериды; ЛПВП – липопротеины высокой плотности; ЛПНП – липопротеины низкой плотности; HbA_1c – гликированный гемоглобин.

До начала терапии у пациентов с ДСПН суммарная балльная оценка выраженности симптомов по шкале ТSS (Total Symptom Score) составила 9,32 балла; выраженность болевого синдрома в баллах по шкале TSS составила у пациентов основной группы 2,82±0,21, у пациентов контрольной группы – 2,78±0,24 (табл. 2). На фоне проводимой терапии через 9 дней лечения у пациентов как контрольной, так и основной группы выявлена статистически значимая регрессия болевого синдрома. Выраженность интенсивности болевого синдрома соответственно составила у пациентов основной группы 2,05±0,12 баллов; у пациентов контрольной группы – 2,3±0,11 баллов (р<0,05) (табл. 2). У пациентов основной группы, получавших дополнительно к стандартной терапии инъекции препаратом Кокарнит, динамика регрессии болевого синдрома в дельта процентах в 1,7 раза превысила динамику регрессии у пациентов контрольной группы. Через 4 нед (основная группа 1,9±0,17; контрольная группа 2,4±0,18 баллов) и 12 нед (основная группа 2,0±0,18; контрольная группа 2,5±0,17 баллов) после начала терапии у пациентов основной группы болевой синдром был статистически значимо менее выражен по сравнению с пациентами контрольной группы (р<0,05).

Балльная оценка выраженности симптома онемения по шкале TSS на фоне проводимого лечения за первые 9 дней наблюдения статистически значимо уменьшалась как в основной (с 2,71±0,12 до 1,9±0,09 баллов, р<0,05), так и в контрольной группах (с 2,65±0,11 до 2,2±0,10 баллов, р<0,05) (см. табл. 2).

Таблица 2. Динамика регрессии суммарной балльной оценки симптомов диабетической полинейропатии по шкале TSS (р<0,05) за период наблюдения

Примечания: * – статистически достоверно по сравнению с контрольной группой: p<0,05

При этом в основной группе динамика снижения симптома в 1,76 раза превысила динамику в контрольной группе. Через 4 и 12 недель после начала терапии у пациентов основной группы синдром онемения был менее выражен по сравнению с пациентами контрольной группы, однако разница не явилась статистически значимой.

Из оцениваемых симптомов ДСПН у пациентов, включенных в исследование, жжение было наименее выражено. В течение первых девяти дней наблюдения некоторая положительная динамика в регрессии данного симптома выявлена в обеих группах пациентов. Через 4 и 12 недель наблюдения выраженность симптома клинически значимых изменений не претерпела.

На фоне проводимой терапии выраженность парестезий по шкале ТSS у пациентов основной группы (1,8±0,11 баллов) была статистически значимо ниже (р<0,05) по сравнению с пациентами контрольной группы (2,2±0,10 баллов). Через 4 и 12 нед после начала терапии у пациентов основной группы парестезии были также менее выражены по сравнению с пациентами контрольной группы, однако разница не явилась статистически значимой.

Динамика регрессии суммарной балльной оценки симптомов ДСПН по шкале TSS (р<0,05) за период наблюдения была более ­выражена у пациентов основной ­группы, получавших инъекции препаратом Кокарнит в течение первых 9 дней лечения. На протяжении всего периода наблюдения за пациентами на фоне проводимой терапии балльная оценка симптомов полинейропатии у пациентов контрольной группы статистически значимо превышала балльную оценку симптомов нейропатии у пациентов основной группы (р<0,05).

Состояние фенотипов М1/М2 у больных с различной длительностью сахарного диабета 2 типа

Базальная секреция TNF-α культивируемыми моноцитами-макрофагами из крови больных с впервые выявленным СД2 составила 650 пг/мл культуральной среды. Стимулированная INF-γ секреция TNF-α моноцитами-макрофагами достигала 1679,5 пг/мл культуральной среды, (р<0,001). У пациентов с СД2 и длительностью заболевания 10 [5; 15] лет с ДСПН без поражений стоп базальная секреция TNFα была заметно выше и составила 924,1 пг/мл. В ответ на стимуляцию INF-γ мы получили 1,31-кратное повышение провоспалительного ответа (p<0,001). У пациентов с длительностью СД2 12 [6; 20] лет и с язвенными дефектами стоп базальная секреция провоспалительного цитокина была ниже, чем у больных ДСПН без СДС и составила 674,3 пг/мл. Стимуляционный выброс дал 1,88-кратное повышение (p<0,001), при этом между группами мы не получили значимых различий. При анализе противовоспалительной активности моноцитов-макрофагов периферической крови уровень секреции базального и стимулированного противовоспалительного ­хемокина (CCL18) у пациентов с впервые выявленным СД2 был значимо выше, чем у длительно страдающих диабетом пациентов, и составил 27,5 пг/мл. После стимуляции IL-4 мы получили повышение до 1123 пг/мл (p<0,001). ­Базальная секреция ССL18 культивируемыми моноцитами-макрофагами у пациентов с длительным течением СД2 без СДС была значительно ниже – 3,0 пг/мл, чем у больных с СДС – 9,38 пг/мл. У больных без СДС стимуляция IL-4 превысила 2,23-кратно исходный уровень, (p<0,05). Индуцированная секреция ССL18 у больных с СДС показала лишь 1,36-кратное повышение (p=0,069), (табл. 3).

Таблица 3. Статистические параметры распределений величин маркеров

Примечания: данные представлены в виде медианы и 25;75 квартилей (**p<0,001;*p<0,05). СД2 – сахарный диабет 2 типа.

Таким образом, у больных с различной длительностью заболевания получена поляризация по провоспалительному фенотипу. И напротив, у пациентов с впервые выявленным СД2 сохранена поляризация по противовоспалительному фенотипу и прослеживается тенденция снижения поляризации при длительности диабета более 10 лет. Различия по способности клеток к стимулированному М2 ответу моноцитов-макрофагов периферической крови также были значимыми (р<0,001).

Состояние углеводного обмена и фенотипов М1/М2 поляризации макрофагов

У пациентов с длительным течением СД2 без СДС средний уровень HbA_1c составил 9,0±1,5%, у пациентов с СДС – 8,8±1,8%, р_1,2=0,529. Различия в показателях между группами не имели статистической значимости. Для анализа состояния углеводного обмена в соответствии с клиническими рекомендациями в качестве целевого уровня был выбран HbA_1c ≤7,5%, так как средний возраст исследуемых составил 62 года. При сравнении пациентов с HbA_1c ≤7,5% и HbA_1c >7,5% отмечались различия по базальному и стимулированному противовоспалительному фенотипу (р<0,05) (табл. 4).

Таблица 4. Статистические параметры распределений величин базального и стимулированного TNFα/ССL18 у пациентов с длительным течением сахарного диабета 2 типа в зависимости от уровня гликированного гемоглобина

Примечания: данные представлены в виде медианы и 25;75 квартилей (**p<0,001, *p<0,05). СДС – синдром диабетической стопы; СД2 – сахарный диабет 2 типа.

Обнаружено, что у пациентов с язвенными дефектами при HbA_1c ≤7,5% нет стимуляции поляризации моноцитов-макрофагов по провоспалительному фенотипу и снижена способность к стимуляции противовоспалительного ответа, тогда как при декомпенсации углеводного обмена (HbA_1c >7,5%) значительно повышается стимуляция провоспалительной поляризации и незначительно – противовоспалительной. У пациентов без язвенных дефектов при HbA_1c >7,5% при отсутствии стимулированной провоспалительной поляризации мы получили корреляционную зависимость (r=0,574, p=0,010) между базальным уровнем TNFα и уровнем HbA_1c (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость уровня базального TNFα от уровня гликированного гемоглобина.

В том числе выявлены корреляционные взаимосвязи у пациентов с язвенными дефектами между уровнем HbA_1с и стимулированными медиаторами воспаления TNFα, пг/мл (r=0,726; p=0,027), CCL18 (r=-0,949; p=0,051). Таким образом, независимо от наличия язвенных дефектов, пациенты, достигшие на момент обследования целевых показателей углеводного обмена, не имеют активации провоспалительного фенотипа, тогда как, напротив, при HbA_1c >7,5% активируется поляризация по М1 фенотипу.

Cостояние фенотипов М1/М2 поляризации макрофагов в зависимости от длительности язвенного дефекта

Нами также рассмотрены фенотипы поляризации при длительно незаживающих язвенных дефектах у больных с СД2. Выявлено, что на протяжении всего воспалительного процесса сохраняются высокие уровни провоспалительного фенотипа с активным стимуляционным ответом, р<0,05, тогда как при длительном процессе, более 6 мес, стимуляционный противовоспалительный ответ отсутствует, р=0,033, (рис. 2).

Рис. 2. Провоспалительная активация цитокина TNF-α и противовоспалительная активация хемокина CCL18 у пациентов с синдромом диабетической стопы (n=42) с различной продолжительностью язвенного процесса (от <1 до ≥ 6 мес). Двенадцать пациентов с продолжительностью менее 1 мес, 17 пациентов с продолжительностью от 1 до менее 6 мес и 13 пациентов с длительностью продолжительностью язвы более 6 мес. Гистограммы отображают срединные значения, а усы отражают IQR [Q25; Q75]. Уровень значимости рассчитан с использованием тестов Колмогорова–Смирнова и Манна–Уитни, *p<0,05.

При пролонгации воспалительного процесса отмечается избыточная продукция TNF-α как отражение провоспалительного фенотипа и ослабление противовоспалительного ответа. По-видимому, нарушение равновесия М1 и М2 является одной из причин ингибирования стадии пролиферации и ремоделирования тканей, что может приводить к рецидированию дефекта, не достигнув его закрытия. С этой целью мы попытались воздействовать на патогенетическое звено с помощью метаболической терапии, поскольку результаты нашего исследования показали неблагоприятную картину состояния фенотипов именно у больных с нейропатической формой СДС. На 9-й день лечения отмечено снижение базальной секреции TNF-α на 25% (р<0,05) и ССL18 – на 20% (р<0,05) по сравнению с исходными значениями (см. рис. 2). При стимуляции моноцитов на 9-й день лечения отмечено снижение на 17% стимулированной секреции TNF-α (р<0,05) по сравнению с исходным. Противовоспалительный маркер в ответ на стимуляцию IL-4 показал высокий потенциал к стимулированию, а именно 2,5-кратное повышение по сравнению с исходными значениями (р<0,05) (рис. 3 А, В).

Рис. 3. Провоспалительная активация цитокина TNF-α и противовоспалительная активация хемокина CCL18 у пациентов с длительным течением язвенного процесса синдрома диабетической стопы (n=18). Гистограммы отображают срединные значения, а усы отражают IQR [Q25; Q75]. Уровень значимости рассчитан с использованием тестов Колмогорова–Смирнова и Манна–Уитни, *p<0,05.

Таким образом, метаболическая терапия оказывает противовоспалительное действие на макрофагальное звено за счет подавления провоспалительного фенотипа и активации противовоспалительного ответа. Безусловно, для регулирования пропорционального механизма своевременного переключения с фенотипа М1 на М2 необходимо не только устранение дисбаланса в системе «оксиданты-антиоксиданты», но и применение иммунокорригирующей терапии, особенно у пациентов с длительным язвенным дефектом – более 6 мес.

ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно нашим предыдущим исследованиям, у пациентов с впервые выявленным СД2, которые не получали гипогликемическую терапию, отмечалось значительное усиление стимулированной провоспалительной и противовоспалительной активации моноцитов по сравнению со здоровыми донорами [15]. Оценивая активацию моноцитов у этих пациентов с СД2, мы обнаружили более выраженный стимулированный про- и противовоспалительный ответ по сравнению с пациентами с длительным анамнезом заболевания. Это может быть связано с влиянием более высокой гликемии (HbA_1c=9,9%) и, как результат, глюкотоксичности на поляризацию моноцитов по провоспалительному пути из-за более высокого ОС у нелеченых пациентов, что включает в себя значительное образование свободных радикалов, продуктов неферментного гликирования, приводя к активации NF-κB, который запускает секрецию провоспалительных цитокинов [8].

Разница в базальной секреции провоспалительного цитокина между пациентами с ДСПН без СДС и с СДС не достигла статистической значимости (p=0,118). Однако тенденция к повышению базального уровня секреции TNF моноцитами у пациентов с СД2 без СДС может отражать повышенную провоспалительную активность моноцитов, что может способствовать постепенному образованию язвенного повреждения стоп. В результате язвенный дефект, в свою очередь, может больше не требовать высокой активности врожденного иммунитета, что выражается в относительном снижении секреции базального ФНО моноцитами.

По нашим данным, у пациентов с нелеченым СД2 выявлены высокий уровень базального противовоспалительного ответа и его значительная (примерно в 40 раз) активация при стимуляции IL-4. Пациенты с длительным анамнезом заболевания показали чрезвычайно низкую активацию моноцитов на противовоспалительный ответ, что определяется секрецией CCL18 культивируемыми моноцитами. Кроме того, базальный уровень CCL18 у пациентов ДСПН без СДС составлял всего 3,0 пг/мл, но демонстрировал умеренную активацию (в 2,23 раза) при стимуляции IL-4, что является косвенным свидетельством отсутствия периферического воспаления и потенциальной способности к М2 активации к поляризации у этих пациентов. В отличие от этого, у пациентов с СДС наблюдалась более высокая базальная секреция CCL18 по сравнению с пациентами без СДС, которая, однако, не превышала уровень противовоспалительных цитокинов у пациентов с впервые выявленным СД2, что указывает на наличие воспалительного процесса. Однако стимуляция противовоспалительной активности IL-4 не вызывала ожидаемой адекватной активации моноцитов по отношению к моноцитам с противовоспалительным ответом у этой категории пациентов и была даже ниже (только в 1,36 раза), чем у пациентов без СДС (см. табл. 2). У пациентов с длительным анамнезом СД2 наблюдалось снижение секреции CCL18 моноцитами, стимулированными IL-4, по сравнению с впервые выявленного СД2. Учитывая такое снижение способности индуцированной противовоспалительной активации моноцитов во время длительного течения заболевания, мы рассматриваем это как результат истощения способности моноцитов формировать противовоспалительный ответ на фоне хронического воспаления. Однако конкретные механизмы, ответственные за такое снижение, остаются неясными.

Таким образом, наши результаты ex vivo согласуются с данными литературы о повышении провоспалительной активности и снижении противовоспалительной активности при диабетических ранах in situ у мышей и людей [16]. В попытке приблизиться к ответу на вопрос, с чем связана такая дисрегуляция в поляризации моноцитов-макрофагов у пациентов с язвенными дефектами при СД2, мы оценивали влияние степени компенсации углеводного обмена на дифференцировку фенотипов моноцитов. В качестве целевого уровня компенсации углеводного обмена в соответствии с международными рекомендациями для пациентов старше 60 лет был выбран уровень HbA_1c ≤7,5%. По нашим данным, у пациентов с язвенными дефектами при HbA_1c ≤7,5% нет стимуляции к пролиферации по провоспалительному фенотипу и падает противовоспалительный (М2) ответ при стимуляции IL-4. В условиях декомпенсации углеводного обмена провоспалительная поляризация моноцитов-макрофагов у пациентов с язвенными дефектами при стимуляции значительно повышается (р<0,001), в то время как поляризация по М2-фенотипу стимулируется незначительно. У пациентов с ДСПН без язвенных дефектов мы не выявили стимуляции провоспалительного ответа при HbA_1c ≤7,5%, но отмечался активный стимуляционный противовоспалительный (М2) ответ. При декомпенсации углеводного обмена (HbA_1c ≥7,5%) у этих пациентов не отмечалось выраженной провоспалительной поляризации и, соответственно, отсутствовал противовоспалительный ответ. При этом у пациентов без язвенных дефектов при HbA_1c ≥7,5% отмечена корреляционная зависимость (r=0,574; p=0,010) между базальным уровнем TNFα и HbA_1c, а при наличии язвенных дефектов – прямая корреляция между уровнем HbA_1с и стимулированным маркером воспаления TNFα, пг/мл (r=0,726; p=0,027) и обратная – между HbA_1с и противовоспалительным маркером CCL18 (r=-0,949, p=0,051). Таким образом, наши результаты показывают несомненную связь декомпенсации углеводного обмена и индукции хронического воспаления у больных с язвенными дефектами стопы. Современные данные связывают этот феномен с активацией продукции свободных радикалов, индукцией OC, запускающего цепочку последовательных событий, которые в конечном итоге приводят к дисбалансу и нарушению регуляции иммунной функции и пролонгации воспаления [17].

Развитие диабетической язвы стопы характеризуется чрезмерным и длительным воспалением, что обуславливает плохое заживление диабетических язв. Тем не менее основные механизмы, способствующие чрезмерному воспалению, остаются плохо изученными. Процесс заживления ран также связан с пластичностью макрофагов, так как они участвуют в гомеостазе и ремоделировании тканей [18], поскольку регенеративная способность сопряжена с секретируемыми М2 макрофагами факторами роста, которые стимулируют пролиферацию фибробластов. Дисрегуляция поляризации макрофагов является одной из основных причин замедленного заживления ран [19]. Мы изучали поляризацию макрофагов в крови пациентов с различной длительностью раневого процесса. Наши результаты показали значительное снижение противовоспалительного ответа по мере прогрессирования длительности язвенного дефекта, что, безусловно, свидетельствует о роли иммунной системы в процессе заживления диабетических язв и может быть обусловлено влиянием гипергликемии с развитием OC, что приводит к изменению поляризации макрофагов и подавлению процесса заживления язвы. Фазы процесса заживления у больных СД также подавляются и другими факторами, в том числе специфическими метаболическими нарушениями и нарушенными физиологическими реакциями, такими как гипоксия из-за гликирования гемоглобина, изменения мембраны эритроцитов и сужения кровеносных сосудов.

Витамины группы В в монотерапии или в виде комплексных препаратов используются для лечения повреждений центральной и периферической нервной системы: уменьшают симптомы нейропатической боли [20] и улучшают регенеративную способность нервной ткани [21]. Экспериментальное доклиническое изучение на крысах со стрептозотоцин-индуцированной диабетической полинейропатией подтвердило роль витаминов группы В в восстановлении проведения нервного импульса по большеберцовым нервам (SI и SII) к иннервируемым мышцам. Показано, что лечение комплексом витаминов группы В уменьшает экспрессию провоспалительных и повышает экспрессию противовоспалительных цитокинов, тем самым способствуя разрешению нейровоспаления. Параллельно витамины группы В снижали количество макрофагов М1 и увеличивали количество противовоспалительных М2-клеток [22]. Авторы этих экспериментальных работ определили цитокинмодулирующее влияние витаминов группы В как положительное патогенетическое воздействие на поврежденную нервную ткань. В этом ряду применение метаболической терапии, включающей витаминотерапию (бенфотиамины, цианокобаламин), давно и хорошо себя зарекомендовавшей, а также кофакторов ферментов, участвующих в энергетических обменных процессах (кокарбоксилаза, карнитин, гамма-линоленовая кислота), является вполне обоснованным. Недавно в России появился новый комбинированный метаболический препарат этого ряда – Кокарнит (WorldMedicine). Препарат состоит из 20 мг никотинамида, 50 мг кокарбоксилазы, 0,5 мг цианокобаламина, 10  мг динатрия аденозинтрифосфата тригидрата.

Никотинамид (витамин В₃) – водорастворимый витамин, который, благодаря своим антиоксидантным свойствам [23], является мягким ингибитором поли-АДФ-­рибозы-полимеразы (ПАРП) и предшественником НАД⁺. Таким образом, никотинамид активизирует окисление глюкозы по гликолитическому и пентозофосфатному путям, препятствуя прогрессированию дислипидемии и глюконеогенезу. Положительное влияние никотинамида на нарушения чувствительности и нервной проводимости, а также на эндотелиальную дисфункцию согласуется с ключевой ролью активации ПАРП ОС в развитии ДСПН. Подтверждением этого факта являются многочисленные исследования, выявившие положительный эффект никотинамида в эксперименте на нервную проводимость и кровоток в нервах крыс со стрептозотоциновым СД, снижение перекисного окисления липидов (ПОЛ) и образование свободных радикалов и вторичных продуктов ПОЛ в культуре шванновских клеток человека, инкубируемых в среде с высоким содержанием глюкозы [24]. Как препарат с множественными эффектами, который может использоваться у человека в высоких дозах ввиду малой токсичности, никотинамид может рассматриваться в качестве кандидата для лечения ДСПН.

Кокарбоксилаза (тиаминдифосфат) является готовой формой кофермента, образующегося из тиамина (витамина В₁) в процессе его превращения в организме. Витамин В₁, или тиамин, широко используется многие десятилетия для лечения различных неврологических заболеваний периферической нервной системы. При CД оказывает влияние на процессы ОС путем увеличения активности транскетолазы – фермента, регулирующего углеводный обмен, что нормализует содержание промежуточных продуктов обмена глюкозы за счет активации пентозофосфатного шунта. При этом уменьшается активность ПКС, снижается транскрипция NF-κB, уменьшается продукция эндотелиальной синтазы оксида азота и эндотелина-1, снижается содержание метилглиоксаля в цитоплазме клеток [25].

Тиамин также уменьшает изменения, связанные с активацией полиолового пути утилизации глюкозы, в первую очередь обусловленные истощением содержания антиоксидантного фермента восстановленного глутатиона и накоплением сорбитола. Известно, что тиамин, локализующийся в мембранах нервных клеток, оказывает существенное влияние на процессы регенерации поврежденных нервных окончаний, а также участвует в обеспечении энергетических процессов в нервных клетках, в том числе аксоплазматического тока.

Дефицит витамина В₁₂ (кобаламина) связывают с развитием анемии, нарушением когнитивных функций и прогрессированием нейропатии, связанной с нарушением миелинизации нервных волокон. Положительный эффект применения препаратов кобаламина на эти патологические изменения выявлен в целом ряде клинических исследований при СД. Снижение концентрации витамина В₁₂ при СД связывают с ОС. Были продемонстрированы и антиоксидантные свойства витамина В₁₂ in vitro [26], показавшие, что его производные ингибируют продукцию внутриклеточного пероксида, поддерживают внутриклеточный уровень глутатиона и предотвращают апоптоз и некротическую гибель клеток. Поэтому назначение В₁₂ при ДСПН является патогенетически обоснованным.

Аденозинтрифосфат (АТФ) – нуклеозидтрифосфат, играющий исключительно важную роль в обмене энергии и веществ. АТФ относится к так называемым макроэргическим соединениям, то есть к химическим соединениям, содержащим связи, при гидролизе которых происходит освобождение значительного количества энергии. АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. Известна роль АТФ в качестве медиатора в синапсах и сигнального вещества в других межклеточных взаимодействиях. Без учета физиологической роли внеклеточной АТФ трудно сейчас представить механизмы таких процессов, как восприятие болевых раздражителей, межклеточная передача возбуждения в центральной и периферической нервной системе, нейропротекторное действие эндогенных веществ, регуляция кровообращения и многое другое [27].

Кокарнит – комплексный метаболический препарат, составляющие которого известны как эффективные средства в лечении диабетической полинейропатии, был изучен в нескольких клинических исследованиях, показавших его положительное влияние данного осложнения, а также кардиальной автономной нейропатии.

В ранее проведенных клинических исследованиях проведено изучение эффективности комплексного метаболического препарата Кокарнит у пациентов с ДСПН при применении в виде монотерапии в дозе 2 мл ежедневно в течение 9 дней. В результате проведенного лечения наблюдалось улучшение показателей по PainDetect на 44,3% (р<0,05), NSS на 41,9% (р<0,05) и ТSS на 103,9% (р<0,05) [28].

В другом сравнительном исследовании также наблюдалась статистически значимая положительная динамика по шкалам VAS (р=0,0001), TSS (р=0,0001), NSS (р=0,001), NDS (р=0,0431), SF-36 (р=0,0008); результатам электронейромиографических обследований и определению уровня гликированного гемоглобина в группе пациентов, получавших метаболическую терапию комплексом Кокарнит [29].

Оценка неврологического статуса с помощью стимулирующей электронейромиографии волокон малоберцового нерва (n. peroneus) продемонстрировала, помимо значительного улучшения состояния по шкалам NSS, TSS, NDS, уменьшение латентного периода, увеличение амплитуды М-ответа и скорости распространения возбуждения по n. peroneus [30].

Ограничения исследования

Ограничением настоящего исследования является отсутствие параллельного анализа про- и противовоспалительной активации моноцитов при ДСПН in vitro, in vivo и in situ, что могло бы расширить наше понимание регуляции воспалительных изменений в организме в развитии СДС и расширить возможности терапевтических подходов к контролю воспаления при таких ранах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует о явном повышении провоспалительной поляризации моноцитов-макрофагов и снижении противовоспалительной активности у пациентов с СД2, зависящих от длительности анамнеза заболевания и степени компенсации углеводного обмена, что, возможно, является причиной развития вялотекущего, длительно незаживающего хронического течения раневого процесса. Метаболическая терапия препаратом Кокарнит способна воздействовать на этот процесс, оказывая противовоспалительное действие за счет подавления провоспалительной поляризации и активации противовоспалительного ответа моноцитов-макрофагов.