Роль микробиоты кишечника в развитии сахарного диабета 1 типа

Биологическая среда человека представлена экологическими нишами, заселенными различными типами микроорганизмов. В процессе филогенеза в организме налажена работа ферментов, кодируемых геномами всех симбиотических резидентных микроорганизмов. Они участвуют в контроле оптимального уровня метаболических процессов, создают колонизационную резистентность к условно-патогенным микроорганизмам [1]. В 2011 г. введен термин «микробиом» для характеристики уникальной для каждого человека совокупности всех генов микроорганизмов. Микробиом отражает коллективный геном микробиоты, тогда как микробиота ­является микробиоценозом внутри определенной среды отдельных органов и систем. Из всех клеток в составе ­человеческого ­организма до 90% принадлежит бактериям, населяющим различные биотопы человека (данные Национального института здоровья США, National Institutes of Health, NIH) [2]. Взаимодействие человеческого макроорганизма с микробиотой кишечника (МК), в зависимости от таксономического состава микроорганизмов и метаболитов в процессе их жизнедеятельности, является индикатором здоровья либо детерминантой различных заболеваний [3].

За последнее десятилетие появились данные, указывающие на роль различий в составе, особенностей наследования и функциональных изменений МК, в том числе интродукции определенных микробных групп, в развитии множества заболеваний. Большое внимание направлено на изучение места дисбиоза в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника, онкологических заболеваний, рассеянного склероза, болезней печени, ожирения, иммуноопосредованных заболеваний, в том числе сахарного диабета 1 типа (СД1).

Согласно данным Федерального регистра больных сахарным диабетом Российской Федерации, прослеживается тенденция к росту заболеваемости обоих типов СД. Поиск дополнительных этиологических факторов, в том числе вклад измененной МК в патогенез СД1, создает перспективы в разработке мер первичной профилактики и дополнительных методов терапии заболевания.

РОЛЬ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

МК называется ассоциация микроорганизмов, которые составляют микроэкологическую систему, населяющую желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) [4]. Количество симбиотических микроорганизмов неодинаково в различных отделах ЖКТ и варьирует от 10² до 10³ колониеобразующих единиц в 1 г содержимого (КОЕ/г) в желудке и до 10¹²–10¹³ КОЕ/г — в дистальных отделах толстой кишки. Максимальное количество бактерий обнаруживается в слепой и поперечно-ободочной кишках. Основными факторами, ограничивающими размножение бактерий в верхних отделах ЖКТ, являются быстрое продвижение пищевых масс, кислая среда и воздействие протеолитических ферментов [5]. В толстой кишке условия среды диаметрально противоположны, в связи с чем наблюдается большее разнообразие и количество микроорганизмов. Несмотря на разнообразие МК, наличие более 2000 видов микроорганизмов, 93,5% всего состава принадлежат 5 типам (филам): Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia, при этом Firmicutes и Bacteroidetes составляют более 90% всех представителей МК [6]. Технологический прорыв с возможностью использования шотган-метагеномного секвенирования ознаменовал собой начало широкомасштабных исследований по изучению метагенома человека [7]. МК является наиболее многочисленной и разнообразной в сравнении с микробными сообществами других экологических ниш внутри человеческого организма, поэтому привлекает наибольший интерес ученых со всего мира [8]. В первом десятилетии XXI в. организованы два крупнейших консорциума, ставившие целью расшифровку и изучение функции генов представителей МК человека: MetaHIT (Metagenome of Human Intestinal Tract) в Европе и HMP (Human Microbiome Project) в США [1].

Результаты работы глобальной программы изменили ранние представления об истинном количестве микроорганизмов, населяющих организм человека [9]. Ученые из MetaHIT установили, что человеческий геном содержит около 22 000 генов, но, по оценкам HMP, микроорганизмы населяют наш организм в количестве 8 млн генов, что в 360 раз больше генома человека [9].

ФУНКЦИИ КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ

Функции МК чрезвычайно разнообразны. К ним относятся обеспечение защиты ЖКТ от колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, иммуномодулирующая функция кишечника, участие в энергетическом обмене, участие в процессах нейроэндокринной регуляции слизистой оболочки кишечника, кишечной моторики, продукция короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), поддержание слабокислой среды в просвете кишечника и продукция ряда витаминов (К, витаминов группы В) [8].

Систематизируя функции МК, следует выделить защитную, пищеварительную, метаболическую и иммуномодулирующую (табл. 1) [5, 8].

Таблица 1. Основные функции микробиоты кишечника [5]

ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА В ОНТОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА

Формирование МК в ходе онтогенеза человека является поэтапным прогрессивным процессом. До недавнего времени считалось, что заселение кишечника ребенка происходит только после рождения и зависит от раннего прикладывания к груди, характера вскармливания, взаимодействия с окружающими его людьми, объектами и с пищей. Однако, согласно современному взгляду, становление МК плода начинается еще до рождения, о чем свидетельствует наличие микробной рРНК в плаценте, околоплодных водах, пуповинной крови и в меконии новорожденных [6, 8]. Внутриутробный и неонатальный периоды жизни — критические этапы формирования микробиома плода, от которых во многом зависит состояние здоровья человека в течение всей жизни [6, 10]. Начиная с возраста 2–3 лет МК детей практически полностью повторяет по составу МК взрослых, а окончательно формируется к концу пубертатного периода [11]. Первоначальное становление и формирование неонатального микробиома является мультифакторным процессом и во многом зависит от способа родоразрешения, типа вскармливания ребенка, лекарственной терапии, условий окружающей среды [12]. МК детей, рожденных естественным путем, преимущественно представлена вагинальной флорой матери (Prevotella, Sneathia и Lactobacillus) [13]. Во время естественных родов факультативные анаэробы колонизируют кишечник младенца, создавая анаэробную среду в течение первых нескольких дней жизни для роста облигатных анаэробов (таких как Bacteroides и Bifidobacterium) [11, 14, 15]. У детей, рожденных путем кесарева сечения, МК характеризуется скудным видовым разнообразием, низким содержанием Bifidobacterium и Bacteroides, а также наличием бактерий, присутствующих на кожных покровах матери (Staphylococcus, Acinetobacter, Corynebacterium и Propionibacterium) [16]. У этих младенцев чаще ­обнаруживаются различные условно-патогенные микробы (Clostridioides, Enterococcus, Klebsiella, Streptococcus, Haemophilus и Veillonella). Также замечено, что при родоразрешении путем кесарева сечения становление МК у детей происходит более длительно. Помимо способа родоразрешения, значимое влияние оказывает тип вскармливания. Грудное вскармливание служит важным фактором в становлении МК, поскольку грудное молоко является главным источником симбиотических бактерий и содержит вещества с антимикробным и пребиотическим потенциалом (бета-лактоза, лактоферрин, олигосахариды, секреторные иммуноглобулины А, лейкоциты, лизоцим и др.) [17]. Фукозилированные олигосахариды, присутствующие в грудном молоке, могут быть использованы Bifidobacterium longum и несколькими видами Bacteroides, позволяя им вытеснять другие бактерии, такие как E. coli и Clostridium perfringens. Микробиота голодных младенцев является незрелой, дисбиотической и содержит большее количество энтеропатогенов, таких как Enterobacteriaceae [1].

Значительное влияние на состав МК также оказывает географическое место проживания ребенка. В многоцентровом исследовании МК у грудных детей пяти европейских стран (Швеции, Шотландии, Германии, Италии и Испании) M. Fallani и соавт. изучали влияние места жительства. Так, у детей, проживающих на севере Европы, выявлено преобладание Bifidobacteria, Clostridiaceae, в то время как в южных регионах — Bacteroides, Eubacteria и Lactobacillus [18].

ДИАГНОСТИКА СОСТАВА КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ

Установлено, что подавляющее большинство клеток в составе МК не культивируется в известных микробиологических средах, в настоящее время МК изучают на метагеномном уровне, основанном на секвенировании не только последовательности гена 16S рибосомальной РНК (рРНК), но и всех генов и некодирующих участков (полное метагеномное секвенирование и шотган-метагеномика) [1, 19, 20].

1. Культивирование микроорганизмов

Традиционные методы выделения и культивирования микроорганизмов путем выращивания на плотных и жидких питательных средах продолжают широко использоваться на практике, однако предоставляют возможность культивировать менее одной трети всей МК и получить данные о ее составе только ее конечной части ЖКТ — толстой кишки [20].

2. Секвенирование гена 16S рРНК

Методы молекулярной биологии активно развивались в течение последних десятилетий [20]. В настоящее время в качестве золотого стандарта анализа состава МК используется секвенирование гена 16S рРНК, поскольку этот ген присутствует во всех бактериях [1]. Данный ген характеризуется наличием консервативных и вариабельных участков (доменов), обозначаемых как V1–V9 и различающихся по своей первичной структуре между видами бактерий. Подобная структура гена 16S рРНК сделала его удобной мишенью для исследований в области таксономии и эволюции бактерий [8, 14, 21].

Одно из последних достижений в области диагностики — использование филогенетического микрочипа (чип кишечного тракта человека (the Human Intestinal Tract Chip), HIT-Chip), созданного на основе гипервариабельной области из 1140 уникальных последовательностей рРНК, сгруппированных с использованием сходства филотипа из набора более 16 000 последовательностей 16S рРНК МК человека, который позволяет определять видовой профиль населяющих микроорганизмов, последовательно сменяющих друг друга в процессе жизнедеятельности индивидуума [20].

3. Метагеномное секвенирование

В качестве альтернативы секвенированию 16S рРНК применяется секвенирование метагенома для достижения более точного, независимого от культур микроорганизмов состава бактериальных сообществ [20]. Использование молекулярно-генетических подходов дает точные результаты даже в тех случаях, когда возбудитель относится к группе некультивируемых микроорганизмов, а также присутствует в небольшом количестве [22]. Полное метагеномное секвенирование используется при сравнительных геномных исследованиях. Метод определения последовательностей ДНК, названный «шотган-метагеномика» («shotgun metagenomics», или «метод «дробовика»), разработанный международным проектом «Геном Человека», дает возможность секвенировать весь выделенный из образца пул нуклеотидов, благодаря чему впервые выявлена полная нуклеотидная последовательность генома человека [20, 22]. Однако высокая стоимость и потребность в дополнительных вычислительных знаниях специалистов делают данные методы труднодоступными. В таблице 2 представлена краткая характеристика методов анализа состава МК [8, 14, 20–22].

Таблица 2. Характеристика методов анализа состава микробиоты кишечника

ИЗМЕНЕНИЯ ТИПОВОГО СОСТАВА МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 1 ТИПА

СД1 — иммуноопосредованное эндокринное заболевание с бессимптомным продромальным периодом, характеризующееся абсолютной недостаточностью инсулина в результате разрушения Т-лимфоцитами большей части β-клеток поджелудочной железы (ПЖ) у генетически детерминированных людей [20, 23].

Заболеваемость СД1 значительно увеличилась в большинстве промышленно развитых стран после Второй мировой войны [19, 23]. Например, в Финляндии в 1950-х годах на 100 000 человек ежедневно диагностировались 12 новых случаев СД1 у детей в возрасте до 15 лет, а в 2006 г. этот показатель достиг 65 заболевших на 100 000 человек в день, что свидетельствует об увеличении частоты развития СД1 более чем в 5 раз за 55 лет [19, 23]. Промышленные и экономические достижения в послевоенные годы (улучшение гигиенических условий, диетические изменения и чрезмерное использование антибиотиков), несомненно, имеют решающее значение для иммунного развития [1, 24].

Такой стремительный рост заболеваемости не может быть обусловлен только генетическими факторами, так как для изменения генома требуются сотни лет, соответственно, изменения в образе жизнедеятельности человека должны быть основными причинами увеличения заболеваемости СД1 [23].

Появление специфических панкреатических аутоантител (АТ) в сыворотке крови предшествует манифестации СД1, к ним относятся АТ к глутаматдекарбоксилазе (GAD), тирозинфосфатазе (IA-2), инсулину (IAA), транспортеру цинка 8 (ZnT8 Ab) и островковым клеткам (ICA) [24]. Аутоиммунный процесс, ведущий к развитию СД1, чаще всего инициируется в течение первых лет жизни ребенка, когда МК претерпевает критические этапы динамического развития [23]. В исследовании DIABIMMUNE выявлены различия в составе МК младенцев, у которых впоследствии развился СД1 [25]. Наблюдение за изменениями, предшествующими началу развития заболевания, предполагает, что измененный состав МК играет важную роль в патогенезе и прогрессировании заболевания.

Дисбиоз состава МК представляет собой различные нарушения в микробной экосистеме различных отделов кишечника: избыточный рост одних микроорганизмов и гибель других. Как уже говорилось ранее, Firmicutes и Bacteroidetes составляют более 90% всех ­представителей МК человека [26]. В результате анализа многочисленных научных публикаций и исследований на предмет дисбиоза МК при СД1 выявлено, что самым распространенным отличием состава МК у пациентов с СД1 является снижение уровней Firmicutes с одновременным повышением Bacteroidetes. Бактерии Firmicutes ответственны за синтез бутирата, защитные и иммуномодулирующие функции которого были раскрыты в предыдущих разделах [20, 21]. По аналогии со снижением количества Firmicutes выявляется снижение Bifidobacterium, выполняющих схожие с Firmicutes функции: продукция одной из важнейших КЦЖК (бутират), которая участвует в поддержании целостности защитного барьера слизистой оболочки кишечника и оказывает широкий спектр эпигенетических эффектов, влияющих на развитие и функционирование иммунной системы [21, 23, 27]. Также обращает внимание снижение количества лактат-продуцирующих бактерий, обладающих выраженной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

ИММУНОПАТОГЕНЕЗ РАЗВИТИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1 ТИПА ПРИ ДИСБИОЗЕ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА

Бесспорно, развитие СД1 — мультифакторный процесс: возникновение данного заболевания происходит при генетической предрасположенности и патологическом дисбалансе состава микроорганизмов различных локусов кишечника человека (рис. 1) [21].

Рисунок 1. Факторы, влияющие на развитие сахарного диабета 1 типа.

Созревание кишечного микробиома тесно связано с развитием иммунной системы. Первые предположения о том, что МК может играть важную роль в развитии иммуноопосредованных заболеваний, таких как СД1, были представлены еще в 1970–1980-х гг. [19]. Точный иммунопатогенез развития СД1 при дисбиозе состава МК в настоящее время неизвестен. Однако есть данные о развитии аномального иммунного ответа на условно-патогенные и/или патогенные микроорганизмы, что может являться триггером развития СД1 при наличии генетических полиморфизмов (наличие HLA-DR3/DR4 генов) [19, 24]. При ­дисбиозе МК происходит созревание аутореактивных лимфоцитов, способных взаимодействовать с аутологичными антигенами организма человека. Аутоиммунная агрессия против β-клеток поджелудочной железы в итоге приводит к повреждению β-клеток, а при гибели более 80% клеток — развитию СД1. Схематично иммунопатогенез развития СД1 представлен на рисунке 2 [5, 19, 24].

Рисунок 2. Иммунопатогенез развития сахарного диабета 1 типа [4, 18, 23].
1. Гемопоэтические стволовые клетки (предшественники Т-лимфоцитов) из костного мозга мигрируют в тимус, где происходит дифференцировка Т-клеток, генетически детерминированных к взаимодействию с определенным антигеном, с последующим поступлением зрелых Т-лимфоцитов в кровь [5].
2. При снижении микробного разнообразия нарушается целостность кишечного барьера, повышается проницаемость слизистой оболочки, что может вызвать сбой иммунологической толерантности перекрестно реагирующими микробными антигенами [24, 32].
3. Реализация иммуномодулирующего эффекта МК обусловлена влиянием на дифференцировку Т–клеток в пейеровых бляшках. При аномальном иммунном ответе на комменсальные или патогенные микроорганизмы аутореактивные Т-лимфоциты, активированные перекрестнореагирующими антигенами микроорганизмов, способны распознавать и реагировать с аутоэпитопами собственных клеток организма индивидуума [5, 19, 24, 32].
4. Наивные аутоантиген-специфические Т-лимфоциты (Т-клетки, которые еще не встречались с антигеном) в лимфатических узлах поджелудочной железы распознают фрагменты островковых молекул из поврежденных β-клеток (например, при инфекционном воспалении, вызванном вирусами и бактериями). Т-клетки памяти помогают В-клеткам, специфичным для аутоантигенов, дифференцироваться в плазматические клетки, которые продуцируют аутоантитела к островковым клеткам поджелудочной железы [5, 19, 24].
5, 6. Образование тканевых антигенов и поверхностная экспрессия молекул HLA класса I на поврежденных β-клетках, представляющих аутоантигены CD8+ цитотоксическим Т-клеткам [5, 19, 24]
7. Длительное повреждение β-клеток поджелудочной железы аутоантителами приводит к потере значительной части функционирующих β-клеток, в связи с чем развивается СД 1 типа [5, 19, 24].

КИШЕЧНАЯ МИКРОБИОТА У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ ЛЕЧАЩЕГО ВРАЧА

Выяснение общих звеньев этиопатогенеза СД1 позволяет существенно продвинуться в вопросах профилактики возникновения данного заболевания.

МК является не просто ассоциацией микроорганизмов, это многокомпонентная динамичная система с внутренней структурой, активно взаимодействующая с организмом человека. Патогенез возникновения СД1 прямо или косвенно связан с нарушением ферментативного и биохимического равновесия жизнедеятельности нормальной МК и его влиянием на организм ­индивидуума [20, 22].

В некоторых странах кожа младенцев, рожденных путем кесарева сечения, обрабатывается вагинальной жидкостью матери с целью получения микробиома, сопоставимого по составу с микробиомом детей, рожденных естественным образом, — это метод вагинального посева [21].

При дефиците витамина А в рационе детей увеличивается соотношение Firmicutes/Bacteroidetes (изменение состава МК, обнаруживаемое у многих пациентов с СД1), снижается количество бутират-продуцирующих бактерий, что ведет к дисбиозу МК, нарушению ферментации полисахаридов и продукции КЦЖК, это влияет на развитие патологического иммунного ответа и может способствовать возникновению СД1. В работе, проводимой на поросятах, выявлено, что добавление цинка в рацион питания животных увеличивало бактериальное разнообразие и способствовало стабилизации МК [20].

В повседневной практике врач сталкивается с необходимостью выбора эффективных и безопасных средств коррекции дисбиоза МК. Детям из группы риска развития СД1 (наличие нескольких АТ по данным лабораторных исследований) в качестве профилактической меры необходимо составление персонализированного рациона питания, сбалансированного по содержанию пищевых компонентов, микронутриентов и макронутриентов для полноценного развития МК ребенка [24]. Дополнительные препараты для коррекции существующих нарушений МК включают пребиотики, пробиотики, синбиотики и метабиотики [1]. Также активно изучается возможность проведения трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ) здоровых доноров.

Пребиотики — элементы немикробного состава, ферментирующиеся МК толстого кишечника человека и стимулирующие ее рост и жизнедеятельность [1, 28]. Представителями этой группы являются полисахариды натурального происхождения [29].

Пробиотики — это живые микроорганизмы, оказывающие влияние на оптимизацию МК [29]. Одним из наиболее ожидаемых результатов пробиотической терапии, наряду с подавлением активности факультативной микробиоты, является нормализация метаболической активности МК [1]. Наиболее перспективными в данном отношении являются пробиотики, содержащие различные штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium. Недавнее исследование показало, что ежедневное потребление Lactobacillus reuteri в качестве пробиотического препарата увеличивало секрецию инсулина и инкретина у пациентов с СД [20].

Синбиотики — комбинация пробиотиков и пребиотиков, оказывающая взаимоусиливающее воздействие на обмен веществ в организме человека [1].

Метабиотики являются структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, сигнальных молекул с определенной химической структурой; применение метабиотиков позволяет создать управляемый микробиоценоз кишечника, поскольку метаболические, сигнальные, транспортные и другие функции представителей индигенной микробиоты имеют большее значение, чем количественное содержание в биотопе микроорганизмов тех или иных видов [29].

ТФМ — введение фекальной суспензии здорового донора в ЖКТ реципиента с целью восстановления стабильности и разнообразия состава МК у пациентов с заболеваниями, связанными с дисбиозом МК [1, 30]. На сегодняшний день основными возможными терапевтическими направлениями ТФМ являются лечение хронических воспалительных заболеваний ЖКТ (наиболее широко применяется для лечения рецидивирующего псевдомембранозного колита, вызванного Clostridium difficile), а также ожирения [31]. В 2018 г. в Китае описан первый случай ТФМ женщине с СД 2 типа (СД2) и диабетической полинейропатией с болевым синдромом и отсутствием положительного ответа на фоне доступных лекарственных средств. После проведенной ТФМ выявлено уменьшение выраженности симптомов (значительное уменьшение болевого синдрома), а также улучшение гликемического контроля с редукцией дозы гипогликемических препаратов. За 2 года последующего наблюдения после проведенной ТФМ пациентка больше не принимала обезболивающих лекарственных средств [30]. Полученные результаты показывают возможность ТФМ в улучшении качества жизни пациентов с СД, в связи с чем ученые продолжают исследования в направлении коррекции дисбиоза МК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Безусловно, расшифровка метагенома человека входит в число фундаментальных открытий современной медицины. Перспективой ближайшего будущего является накопление достаточного количества достоверных данных, устанавливающих роль и причинно-следственные связи между дисбиозом МК и развитием различных иммуноопосредованных заболеваний, в том числе СД1. Важной задачей является использование полученных знаний в клинической практике. Изменения нормальной МК могут быть предикторами различных патологических состояний, поэтому выявление диагностических маркеров позволит разработать практические меры диагностики, профилактики и лечения широкого спектра заболеваний.