Ассоциации полиморфизмов генов цитокинов и матриксных металлопротеиназ с минеральной плотностью костной ткани у женщин в постменопаузе с сахарным диабетом 2 типа

Значительная часть заболеваний, встречающихся в практике эндокринолога, может осложняться развитием остеопороза [1]. Все более частыми коморбидными состояниями становятся сахарный диабет 2 типа (СД2) и остеопороз [2]. Установлено, что пациенты с СД2 имеют повышенный риск переломов бедра, позвоночника, плеча и предплечья в сравнении с лицами без СД [3, 4], даже при равных показателях минеральной плотности костной ткани (МПК) и индекса Fracture Risk Assessment Tool (FRAX) [5]. При анкетировании больных СД2 в Москве низкоэнергетические переломы в анамнезе были выявлены в 30% случаев [6], что почти в 2 раза превышает среднюю распространенность переломов в российской популяции [7]. Увеличение риска переломов у больных СД2 связывают с нарушением процесса костного ремоделирования в условиях гипергликемии и связанных с ней метаболических и гормональных расстройств [8].

Важную роль в ремоделировании костной ткани играют цитокины: фактор некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкины1β, -4, -6, -10 (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и другие [9]. Цитокины оказывают прямое влияние на костную ткань, регулируя процессы пролиферации и дифференцировки остеобластов и остеокластов. Непрямое влияние цитокинов на ремоделирование кости опосредовано через изменения секреции лептина, адипонектина и других гормонов [10]. Увеличение продукции провоспалительных цитокинов вносит существенный вклад в развитие остеопороза при воспалительных заболеваниях [9]. Роль цитокинов в формировании остеопороза на фоне СД мало изучена. При этом известно, что при СД2 наблюдается дисбаланс в продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, отражающий развитие хронического воспаления низкой интенсивности [11, 12].

Ферменты из группы матриксных металлопротеиназ (MMPs: ММР-2, MMP-3, MMP-9 и другие) играют важную роль в обмене внеклеточного матрикса, формировании и ремоделировании кости [13]. Данные ферменты участвуют в рекрутировании остеокластов и реализации их функциональной активности, ангиогенезе, регуляции жизненного цикла остеоцитов. В связи с этим изменения продукции MMPs могут менять биомеханические свойства («качество») костной ткани [14].

Аллельные варианты генов цитокинов и MMPs определяют особенности продукции этих биологически активных молекул в нормальных и патологических условиях. В промоторах генов цитокинов и MMPs обнаружены полиморфные локусы, варианты нуклеотидов в которых влияют на уровень экспрессии генных продуктов [15, 16]. У больных СД2 выявлены связи между однонуклеотидными полиморфизмами генов TNFA, IL4, IL6, IL10, VEGFA и уровнем соответствующих цитокинов в крови [17, 18]. Роль вариативности в регуляторных участках генов цитокинов и ММРs в формировании индивидуальной предрасположенности к остеопорозу у больных СД2 не изучена.

Цель

Определить ассоциации вариантов генотипов в промоторах генов цитокинов (TNFA, IL1B, IL4, IL6, IL10, VEGFA) и MMPs (MMP2, MMP3, MMP9) со снижением МПК у женщин с СД2, находящихся в постменопаузе.

Методы

Дизайн исследования

В данном одномоментном сравнительном исследовании тестировалась гипотеза о влиянии полиморфных вариантов промоторов генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, а также ферментов группы MMPs на риск развития остеопении и остеопороза у женщин с СД2, находящихся в постменопаузе. Набор пациентов в исследование осуществлялся в одном клиническом центре в соответствии с критериями включения и исключения, установленными для гомогенизации выборки (см. ниже). После подписания информированного согласия у всех пациентов проводилось общеклиническое обследование и двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия, по результатам которой больных делили на группы с нормальной и сниженной МПК. Гипотеза исследования проверялась на основании оценки различий в частоте встречаемости аллелей и генотипов в полиморфных позициях промоторов генов цитокинов и MMPs, а также комбинаций этих генотипов, между группами больных с нормальной и сниженной МПК.

Критерии соответствия

Критериями включения в исследование являлись: женский пол, европеоидное происхождение, возраст от 50 до 70 лет, продолжительность менопаузы не менее одного года; диагноз СД2, установленный по критериям ВОЗ (1999 г.) не менее пяти лет назад.

Основными критериями исключения являлись факторы риска развития вторичного остеопороза: заболевания эндокринной системы (гиперкортицизм, тиреотоксикоз, гипопитуитаризм, полигландулярные синдромы), системные ревматические заболевания (ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, другие диффузные болезни соединительной ткани), заболевания органов пищеварения, сопровождающиеся нарушением всасывания кальция (синдром мальабсорбции, состояния после резекции желудка, шунтирующих операций на желудочно-кишечном тракте и др.), заболевания почек недиабетической природы, хроническая болезнь почек (ХБП) 4–5-й стадии или трансплантация почек в анамнезе, заболевания системы крови (кроме железодефицитной анемии легкой степени), онкологические заболевания. В исследование не включались женщины, получающие заместительную постменопаузальную терапию, а также женщины с анамнестическими указаниями на прием глюкокортикоидов, иммуносупрессантов, тиазолидиндионов, ингибиторов обратной реабсорбции глюкозы в почках и препаратов для лечения остеопороза.

Условия проведения

Набор пациентов осуществлялся в клинике Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии – филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (г. Новосибирск, Россия).

Описание медицинского вмешательства

Исследование МПК проводили с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии на аппарате Lunar Prodigy (GE, США). Определяли показатели МПК и T-критерий в позвоночнике (поясничные позвонки: L1–L4), проксимальных отделах бедра, шейке бедра, предплечье недоминантной руки.

Определение риска основных низкоэнергетических переломов проводилось с помощью опросника FRAX (веб-версия 3.8, расчет по российской модели). Оценивали общий риск низкоэнергетических переломов (FRAX total) и риск переломов шейки бедра (FRAX hip).

Типирование аллельных вариантов в полиморфных позициях промоторов генов TNFA: -238 G/A(rs361525), -308 G/A (rs1800629), -863 C/A (rs1800630), IL1B: -31 T/C (rs1143627), IL4: -590 C/T (rs 2243250), IL6: -174 G/C (rs1800795), IL10: -592 C/A (rs1800872), -1082 A/G (rs1800896), VEGFA: -2578 А/C (rs699947), +936 С/T (rs3025039), MMP2: -1306 Т/C (rs243865), MMP3 -1171 5A/6A (rs35068180) и MMP9: -1562 С/T (rs34016235) осуществляли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием коммерческих тест-систем на основе интеркалирующего красителя SYBR GreenI («Литех», Россия) и методом TaqMan зондов («Синтол», Россия) на амплификаторе «ДТ-96» («ДНК-Технология») согласно инструкциям фирм-производителей.

Анализ в подгруппах

На основании результатов двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии пациентки распределялись на группы с нормальной МПК, остеопенией и остеопорозом. При анализе данных молекулярно-генетического исследования женщины с остеопенией и остеопорозом рассматривались как группа со сниженной МПК.

Основной исход исследования

Основным показателем, оценивавшимся в исследовании, явились различия в частоте встречаемости аллелей и генотипов в полиморфных позициях промоторов генов цитокинов (TNFA, IL1B, IL4, IL6, IL10, VEGFA) и MMPs (MMP2, MMP3, MMP9) в группах женщин в постменопаузе с СД2 с нормальной и сниженной МПК.

Дополнительные исходы исследования

Дополнительными показателями, оценивавшимися в исследовании, явились различия в частоте встречаемости комбинаций генотипов в полиморфных позициях промоторов генов цитокинов (TNFA, IL1B, IL4, IL6, IL10, VEGFA) и MMPs (MMP2, MMP3, MMP9) в группах женщин в постменопаузе с СД2 с нормальной и сниженной МПК.

Этическая экспертиза

Проведение исследования одобрено локальным Этическим комитетом ФГБНУ Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии (протокол №104 от 20.10.2014). Все обследованные давали письменное информированное согласие на участие в  исследовании.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки

Размер выборки оценивали, исходя из ожиданий минимальной доли объясненной дисперсии полиморфизмов в 4%. Тогда для ожидаемой мощности анализа в 80% при уровне значимости 0,05 необходимый размер выборки равен 200. Мы пользовались стандартной процедурой вычисления мощности анализа, которая предполагает, что тестовая статистика при альтернативной гипотезе имеет распределение Хи-квадрат с одной степенью свободы и заданным параметром нецентральности NCP, равным NCP=R2*N, где R2 – это ожидаемая доля объясненной дисперсии; N – размер выборки. Ожидаемую мощность задали равной 80%, а порог значимости – 0,05.

Методы статистического анализа данных

Статистическая обработка проведена с использованием программы STATISTICA 10 (StatSoft, Inc, 2011, CША) и открытой программной среды R [19]. Учитывая, что распределение большинства изученных признаков было отличным от нормального, применяли методы непараметрической статистики. Межгрупповые различия оценивали с помощью критерия Манна-Уитни и ANOVA Краскела-Уоллиса. При статистическом анализе результатов генетического исследования рассчитывали частоту встречаемости аллелей и генотипов, отношение шансов (OШ), 95% доверительный интервал (95% CI), специфичность (Sp). Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ). Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц. При анализе использованы аддитивная, рецессивная, доминантная и сверхдоминантная модели наследования. Взаимодействие между генами оценивалось по стандартной модели взаимодействия Y~b1*SNP1+b2*SNP2+b12*SNP1*SNP2, где определялась значимость отличия эффекта взаимодействия b12 от нуля. Взаимосвязь клинических и генетических признаков со снижением МПК проверяли в моделях однофакторного и многофакторного регрессионного анализа. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05, для результатов биоинформационного анализа комбинаций полиморфизмов – 0,005.

Результаты

Объекты (участники) исследования

В исследование включены 197 женщин с СД2, считающих себя и своих родителей русскими. Индекс массы тела (ИМТ) обследованных варьировал от 23,7 до 50,3 кг/м2, составляя в среднем 33,3 кг/м2. Избыточную массу тела имели 48 женщин, ожирение – 146. О курении сигарет сообщили 6 женщин. Низкоэнергетические переломы в анамнезе зарегистрированы у 25 женщин, у 148 переломы отсутствовали, данные о переломах у 24 больных не  получены. Длительность СД2 варьировала от 5 до 36 лет (медиана 14,3 года). Диабетическая ретинопатия выявлена у 132 обследованных, поражения крупных сосудов – у 129. Диабетическая нефропатия имелась у 148 пациенток, из них у 27 диагностирована хроническая болезнь почек (ХБП) 1-й стадии, у 73 – 2-й стадии, у 39 – ХБП стадии 3А, у девяти – стадии 3Б. Все обследованные получали сахароснижающую терапию. Лечение инсулином получали 144 женщины, из них 82 – в сочетании с метформином, 5 – с препаратами сульфонилмочевины (ПСМ), 17 – с метформином и ПСМ. Шестнадцать пациенток принимали метформин в виде монотерапии, 8 принимали только ПСМ, 29 получали комбинацию метформина и ПСМ. Медиана уровня гликированного гемоглобина A1с (HbA1c) составила 8,2% (25–75 процентиль: 6,8–9,5%).

На основании наименьшего Т-критерия пациентки разделены на группы с нормальной МПК (n=73), остеопенией (n=90) и остеопорозом (n=34). Женщины, имеющие остеопороз, в сравнении с женщинами с нормальной МПК были старше, ниже ростом, имели меньшую массу тела и большую длительность постменопаузы (табл. 1). Уровень HbA1c оказался ниже у женщин с остеопорозом в сравнении с пациентками с нормальной МПК. Не выявлено достоверных отличий между группами по соотношению окружности талии к окружности бедер (ОТ/ОБ), длительности СД2, уровню липидов, скорости клубочковой фильтрации (СКФ). Показатели FRAX ожидаемо оказались выше у лиц с остеопенией и остеопорозом.

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика женщин с СД2, имеющих различную МПК

Примечания: данные представлены как медианы, 25-е; 75-е процентили; звездочка – статистически значимое (р<0,05) отличие: одна – с группой больных с нормальной МПК, две – с группой больных с нормальной МПК и остеопенией. Расчет СКФ осуществляли на основе уровня креатинина в сыворотке крови по формуле CKD-EPI (2009 г.), у лиц с морбидным ожирением – по пробе Реберга-Тареева.

Основные результаты исследования

В однофакторном регрессионном анализе значимую ассоциацию с МПК показали возраст (р<0,0001), рост (р<0,0001), масса тела (р<0,0001), ИМТ (р=0,002), длительность менопаузы (р=0,0001), курение (р=0,008). В многофакторной модели наиболее значимо с МПК были ассоциированы возраст (р<0,0001), ИМТ (p=0,003) и курение (p=0,01), которые в сумме объясняли 21,6% общей дисперсии Т-критерия и далее использовались как ковариаты для анализа ассоциаций с генотипами.

Результаты анализа ассоциаций полиморфизмов генов цитокинов и MMPs с Т-критерием представлены в табл. 2. В аддитивной модели установлена связь аллеля С и гомозиготного генотипа СС в позиции -1562 гена MMP9 с низкой МПК (ОШ 2,16, 95% ДИ 1,29–3,6, р=0,0007 и ОШ 2,02, 95% ДИ 1,08–3,79, р=0,0008 соответственно). Мы исследовали также неаддитивные модели наследования (рецессивная, доминантная и сверхдоминантная), однако анализ не выявил дополнительных значимых сигналов. При использовании клинических параметров в качестве ковариатов и аддитивной модели наследования показана достоверная ассоциация полиморфизма в гене MMP9 -1562 C/T (p<0,001) с МПК, объясняющая дополнительно 4% общей дисперсии Т-критерия.

Таблица 2. Ассоциации полиморфизмов генов цитокинов и MMPs с Т-критерием у женщин с СД2

Примечание: РХВ – равновесие Харди–Вайнберга.

Дополнительные результаты исследования

При биоинформационном анализе выявлено 12 комбинаций генотипов, положительно ассоциированных с низкой МПК с вероятностью р<0,005 (табл. 3). В составе этих комбинаций наиболее часто встречался гомозиготный генотип CC в позиции -1562 гена MMP9(7 комбинаций), генотип СС в позиции -863 гена TNFА (5 комбинаций), генотип GG в позиции -308 гена TNFА (4 комбинации) и генотип AA в позиции -1082 гена IL10 (3 комбинации). Особенностью выделенных комбинированных признаков являлась высокая специфичность ассоциации с изучаемой патологией: они практически не встречались в группе больных с нормальной МПК.

Таблица 3. Комбинации полиморфизмов генов цитокинов и MMPs, положительно ассоциированные со снижением МПК, у женщин с СД2

Нежелательные явления

В ходе исследования каких-либо нежелательных явлений не зафиксировано.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Представленное исследование показало независимую ассоциацию между низкой МПК и носительством генотипа СС в позиции -1562 промотора гена MMP9 у женщин с СД2 в постменопаузе.

Обсуждение основного результата исследования

Известно, что МПК человека в значительной степени детерминирована генетически [20]. В последние годы накоплены данные об ассоциациях остеопороза с большим количеством полиморфных вариантов генов. Так, база данных Public Health Genomics Knowledge Base содержит ссылки на исследования ассоциаций 180 генов (по состоянию на 18.07.2017) с постменопаузальным остеопорозом [21]. Наиболее обсуждаемыми являются гены рецептора витамина D (VRD), рецепторов эстрогенов (ESR1, ESR2), α1-цепи коллагена I типа (COL1A1), остеопротегерина (TNFRSF11B), IL-6 (IL6), метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), белка 5 типа, связанного с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP5). Полногеномные исследования выявили дополнительные полиморфные локусы, ассоциированные с МПК, качеством кости и/или риском переломов. Влияние этих локусов может реализоваться через связывание транскрипционных факторов, микроРНК, активность сигнального пути Wnt и других внутриклеточных путей передачи сигнала, дифференцировку стволовых мезенхимальных клеток и остеоцитов [22, 23].

Роль генетических факторов в развитии остеопороза на фоне СД2 остается малоизученной. В данном исследовании мы тестировали гипотезу о связи полиморфных вариантов промоторов генов цитокинов и MMPs со снижением МПК у женщин с СД2 в постменопаузе. Исследовав 13 точек полиморфизма в регуляторных областях 9 генов, мы выявили более высокую распространенность аллеля С и гомозиготного генотипа СС в позиции -1562 гена MMP9 у женщин с остеопенией и остеопорозом. Выявленная ассоциация сохраняла свою значимость после учета клинических факторов риска, таких как возраст, ИМТ и курение. Насколько нам известно, связь полиморфизма гена MMP9 с остеопорозом зафиксирована впервые. При этом компьютерный анализ (text mining) сетевых генно-белковых взаимодействий позиционирует ген MMP9 в составе генных кластеров, ассоциированных с остеопорозом [24]. Описана обратная взаимосвязь между уровнем MMP-9 и МПК у больных с хронической обструктивной болезнью легких [25]. Первоначально роль ММРs в биологии костной ткани связывали со способностью этих ферментов разрушать коллаген. В дальнейшем было показано, что ММРs участвуют в межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействиях, выполняя функции важных регуляторов в формировании, оссификации и постнатальном ремоделировании костей [26].

Взятый как отдельный признак, в совокупности с «традиционными» клиническими факторами риска, полиморфизм MMP9 позволял объяснить относительно небольшую часть дисперсии Т-критерия (около 25%). Одним из способов повышения прогностической значимости генетических признаков является поиск комбинаций генов (так называемых генных сетей), ассоциированных с развитием патологии. Этот подход все чаще используется для изучения наследственной основы мультифакториальных заболеваний человека, в том числе и СД [27, 28]. Показано, что больные СД2 отличаются от общей популяции структурой генных сетей цитокинов и MMPs [29, 30]. С помощью биоинформационного анализа мы выявили ряд комбинаций генотипов цитокинов и MMPs, ассоциированных со снижением МПК. Особенностью этих комбинаций оказалась необычно высокая частота гомозиготных генотипов в полиморфных позициях промоторов генов TNFА (генотип СС в позиции -863 и генотип GG в позиции -308) и IL10 (генотип AA в позиции -1082). Достаточно высокая сила ассоциации комбинированных генетических признаков со снижением МПК (показатели отношения шансов и специфичности) позволяет рассматривать эти признаки как потенциальные маркеры, пригодные для персонифицированного прогноза.

Ограничения исследования

Одномоментный дизайн не позволяет судить о причинно-следственных взаимосвязях между признаками. Относительно небольшой объем выборки и низкая распространенность комбинаций генотипов в обследованных группах требуют осторожности при интерпретации данных биоинформационного анализа.

Заключение

Снижение МПК у женщин с СД2, находящихся в постменопаузе, ассоциировано с увеличением возраста, уменьшением ИМТ, курением. Наличие аллеля С и генотипа СС в полиморфной позиции -1562 промотора гена MMP9(rs34016235) увеличивает вероятность снижения МПК, в дополнение к клиническим факторам риска. В составе генетических комбинаций, ассоциированных со снижением МПК у женщин с СД2, преобладают гомозиготные варианты в полиморфных позициях промоторов генов: генотип CC в позиции -1562 гена MMP9, генотип СС в позиции -863 гена TNFА, генотип GG в позиции -308 гена TNFА и генотип AA в позиции -1082 гена IL10. Поскольку указанные варианты связаны с различной интенсивностью транскрипции генов, можно предполагать их патогенетическую связь с формированием остеопении и остеопороза. Полученные данные указывают на перспективность анализа генных сетей факторов, вовлеченных в ремоделирование костной ткани, для поиска персонифицированных предикторов остеопороза при СД.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена за счет средств государственного задания Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии – филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Фазуллина О.Н. – сбор клинического материала, выполнение денситометрии, статистическая обработка результатов, написание текста; Климонтов В.В. – концепция и дизайн исследования, анализ данных, написание текста; Коненков В.И. – концепция и дизайн исследования, анализ данных; Шевченко А.В. – выполнение молекулярно-генетических исследований; Прокофьев В.Ф., Цепилов Я.А. – статистическая обработка результатов.