Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов ADIPOQ, ADIPOR1 и ADIPOR2 с сахарным диабетом 2 типа

Актуальность

Сахарный диабет (СД) – это группа обменных заболеваний, характеризующихся стойким повышением уровня глюкозы в крови вследствие нарушения секреции инсулина, действия инсулина или влияния обоих указанных факторов. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), количество больных СД неуклонно растет, особенно в промышленно развитых странах, и к 2030 г. СД станет седьмой по значимости причиной смерти, что представляет серьезную медико-социальную проблему во всем мире. Кроме того, последствиями СД являются нарушения функций разных органов (ВОЗ, 1999 г.). Самым распространенным типом диабета является СД 2 типа, на который приходится до 90% всех случаев заболевания диабетом в мире. Этот тип СД обычно развивается в зрелом возрасте и связан с ожирением, отсутствием физической активности и неправильным питанием. В настоящее время ключевыми звеньями патогенеза СД2 считают инсулинорезистентность (ИР), нарушение секреции инсулина, повышение продукции глюкозы печенью, а также наследственную предрасположенность и особенности образа жизни и питания, ведущие к ожирению. Свое­временная диагностика СД2 затрудняется тем, что в 50% случаев это заболевание не сопровождается никакими симптомами, и, как следствие, развиваются различные осложнения диабета, которые зачастую уже на этапе постановки диагноза носят необратимый характер.

В настоящее время наследственность как фактор риска, существенно увеличивающий возможность проявления болезни, не вызывает сомнения. В связи с этим изучение наследственной предрасположенности к СД2 крайне важно для его диагностики и терапии. Для оценки роли наследственных факторов в развитии СД2 большое значение для практики представляет исследование полиморфных маркеров в генах-кандидатах, продукты которых вовлечены в патогенез многофакторного заболевания. Кроме того, стоит учитывать характерную полигению, свойственную СД2, которая является результатом действия нескольких генетических локусов [1]. Различают две основные наследственные причины в формировании СД2 – это генетические дефекты β-клеточной функции и генетические дефекты действия инсулина. В свою очередь, генетический вклад можно разделить на два типа: гены, влияющие на развитие ИР в периферических тканях (мышцы, печень), и гены, связанные с нарушением развития, роста, пролиферации и функции β-клеток поджелудочной железы.

С целью поиска полезных генетических маркеров были выбраны гены адипонектин-опосредованного пути, которые, как известно, связаны с нарушением толерантности к глюкозе, ИР, ожирением и СД2. Генетические изменения в адипонектине (ADIPOQ) и рецепторе-1 и -2 адипонектина (ADIPOR1 и ADIPOR2) могут оказывать действие на развитие СД2.

Адипонектин играет важную роль в регуляции уровней глюкозы и окислении жирных кислот. Продукт гена ADIPOQ (расположен на хромосоме 3q27) – белок адипонектин, вырабатывается клетками белой жировой ткани и относится к семейству коллектинов. Он имеет гомологичное строение с коллагеном типа VIII и Х и комплементом С1q и участвует в регуляции различных метаболических процессов, включая обмен глюкозы и распад жиров [2]. Низкая концентрация адипонектина в крови ассоциирована со снижением окисления липидов, увеличением концентрации триглицеридов и нарушением потребления глюкозы клетками периферических тканей (такими, как печень, мышцы). Уменьшение уровня адипонектина в плазме отмечено у людей, страдающих ожирением и СД2, а также в линии мышей ob/ob (мыши с врожденным ожирением и гипергликемией) [3, 4]. Повышение концентрации эндогенного [5], а также введение экзогенного рекомбинантного адипонектина увеличивает чувствительность клеток к инсулину, а его пониженная концентрация, наоборот, ведет к развитию ИР и ожирения [5, 6]. Показано, что однонуклеотидная замена T45G (rs2241766) во втором экзоне гена ADIPOQ ассоциирована с ИР, нарушением глюкозотолерантности и высоким уровнем липопротеинов и холестерина в крови. Кроме того, этот полиморфный маркер был ассоциирован с повышенным риском развития инфаркта миокарда (ИМ) у арабов [7], а также показывал корреляцию с прогрессированием диабетической нефропатии у тайваньских мужчин с СД2 [8]. Другой полиморфный маркер G276T (rs1501299) гена ADIPOQ, исследованный в данной работе, связан с более высоким риском ИБС у китайских и бразильских пациентов [9, 10].

Рецептор типа 1 (AdipoR1, расположен на хромосоме 1q32) у человека синтезируется преимущественно в скелетной мускулатуре, тогда как рецептор типа 2 (AdipoR2, расположен на хромосоме 12р13.33) экспрессируется главным образом в печени. Аминокислотные последовательности рецепторов обнаруживают 67% гомологии.

При искусственном нарушении секреции инсулина, вызванном токсическим действием на β-клетки стрептозотоцина, и последующем развитии гипергликемии содержание мРНК AdipoR1 и AdipoR2 в скелетных мышцах и печени возрастает, а после введения инсулина снижается. Отмечена корреляция между экспрессией генов рецепторов адипонектина и чувствительностью к инсулину у человека [11]. Также показано, что экспрессия обоих генов снижена в скелетной мускулатуре у больных СД2 и в линии мышей с ИР и ожирением [12]. У мышей с инактивированными AdipoR1 и AdipoR2 наблюдали повышение уровня триглицеридов и развитие воспаления и окислительного стресса. Это приводило к состоянию ИР и невосприимчивости к повышению концентрации глюкозы [13]. В исследованиях на финской популяции найдена ассоциация трех маркеров гена ADIPOR1 (rs10920534, rs12045862 и rs7539542) с увеличением массы тела и снижением чувствительности к инсулину [14]. У европеоидов США достоверную связь с СД2 показали маркеры T(–102)G и A5843G гена ADIPOR1. При этом полиморфный маркер T(–102)G обнаружил неравновесное сцепление с полиморфным маркером Т(-106)С [15].

Некоторые варианты ADIPOR2 показали ассоциацию с ИР, снижением концентрации триглицеридов и уменьшением уровня окисления липидов [16, 17]. В финской популяции полиморфный маркер G795A (rs16928751) гена ADIPOR2 был связан с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний у лиц с нарушенной толерантностью к глюкозе [18]. Однако следует отметить, что исследования ассоциации с СД2 в нескольких европейских популяциях показали противоречивые результаты [14, 19–21].

Цель

Целью настоящей работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров rs2241766 и rs1501299 гена ADIPOQ, rs2275737 и rs2275738 гена ADIPOR1, rs11061971 и rs16928751 гена ADIPOR2с СД2 у русских больных, проживающих в г. Москве.

Материалы и методы

В исследование было включено 500 пациентов с установленным диагнозом СД2 («СД2+») (диагноз установлен на основании стандартных диагностических критериев) – группа Б. Контрольная группа («СД2-») представляла собой случайную выборку из 500 пациентов без признаков заболевания – группа К. Группы были сопоставимы по основным клиническим показателям: полу, возрасту и индексу массы тела (табл. 1).

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика групп пациентов

1Измерение уровня глюкозы проводилось в плазме венозной крови

2Пероральный глюкозотолерантный тест

Значения приведены как среднее +/- стандартное отклонение

У всех пациентов были измерены следующие параметры: концентрация глюкозы и инсулина в крови натощак, концентрация глюкозы и инсулина в крови через 2 ч после перорального глюкозотолерантного теста (ПГТТ), а также рассчитаны индексы HOMA-IR (Homeostasis model assessment-insulin resistance) и HOMA-β (homeostasis model assessment of β-cell function), необходимые соответственно для оценки функционирования β-клеток и оценки ИР тканей. Исследуемые группы формировались из числа пациентов ФГБУ «Эндокринологический научный центр». Все пациенты подписали информированное согласие на проведение исследования. Данное исследование было одобрено Этическим комитетом ФГБУ ЭНЦ. Выборки были этнически однородны и составлены из русских (по данным анкетирования).

Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия.

Амплификацию полиморфных участков исследуе­мых генов проводили с помощью ПЦР «в реальном времени» на термоциклере ABI StepOnePlus (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 250 нМ флуоресцентных зондов, 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (термостабильная ДНК-полимераза Taq производства ЗАО «Евроген», г. Москва, олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген», г. Москва, флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез», г. Москва), 50–100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагментов ДНК: 95°C/2 мин – 1-й цикл; 94°C/10 сек, 54–66°C/60 – 40 циклов, условия ПЦР, последовательности праймеров, флуоресцентных зондов приведены в табл. 2. Для всех исследованных локусов использовался метод детекции генотипов – TaqMan.

Таблица 2. Условия амплификации, последовательности праймеров и флуоресцентных зондов

Используемые в зондах флуоресцентные красители – FAM (карбоксифлуоресцеин) и HEX (гексахлорофлуоресцеин), тушитель флуоресценции – BHQ-1.

Обозначения полиморфных маркеров даны в соответствии с базой данных dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/).

Статистический анализ распределения частот генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (χ2). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях "случай-контроль"» (http://gen-exp.ru/calculator_or.php) и пакета статистических программ SPSS версии 17. Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ ассоциации полиморфных маркеров rs2241766 и rs1501299 гена ADIPOQ.

Полиморфные маркеры rs2241766 и rs1501299 представляют собой замены T/G в экзоне 2 и G/Т в интроне 2 соответственно. Множественные данные указывают на связь изменения уровня адипонектина с нарушением многих метаболических характеристик, а также с уменьшением чувствительности клеток к инсулину. Так как состояние невосприимчивости к действию инсулина участвует в патогенезе СД2, то были предприняты попытки поиска ассоциации различных полиморфных маркеров с ИР [3–6].

При анализе распределения частот и аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs2241766 и rs1501299 гена ADIPOQ в группах «СД2+» – Б и «СД2-» – К значимых статистических различий обнаружено не было (табл. 3, 4). Для полиморфного маркера rs2241766 данные согласуются с работой, выполненной на меньшей (129 против 500 в настоящей работе) выборке пациентов русской популяции [22].

Таблица 3. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ в группах Б и К

*OR – odds ratio (http://gen-exp.ru/calculator_or.php)

Таблица 4. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1501299 гена ADIPOQ в группах Б и К

Анализ ассоциации полиморфных маркеров rs22753738 и rs2275737 гена ADIPOR1

Ген рецептора 1-го типа к адипонектину экспрессируется в основном в скелетной мускулатуре. Нарушение работы рецепторов этого типа было ассоциировано с развитием ожирения и ИР, а также повышением уровня триглицеридов [11–13]. Все это может способствовать развитию СД2.

При анализе распределения частот и аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs22753738 и rs2275737 гена ADIPOR1 в группах «СД2+» и «СД2-» значимых статистических различий обнаружено не было (табл. 5, 6). Для полиморфного маркера rs22753738 данные согласуются с работой, выполненной на меньшей (129 против 500 в настоящей работе) выборке пациентов русской популяции [22].

Таблица 5. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2275738 гена ADIPOR1 в группах Б и К

Таблица 6. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2275737 гена ADIPOR1 в группах Б и К

Анализ ассоциации полиморфных маркеров rs11061971 и rs16928751 гена ADIPOR2

Ген рецептора 2-го типа, в отличие от 1-го, экспрессируется в основном клетками печени. Это может иметь дополнительное значение в развитии глюкозотолерантности, так как печень является основным депо глюкозы в организме.

При анализе распределения частот и аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs11061971 и rs16928751 гена ADIPOR2 в группах «СД2+» – Б и «СД2-» – К, для полиморфного маркераrs11061971 была обнаружена статистически значимая ассоциация с СД2 в русской популяции (табл. 7).

Таблица 7. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11061971 гена ADIPOR2 в группах Б и К

Так, наличие аллеля А и генотипа АА снижало риск развития СД2 (OR=0,76 и 0,75 соответственно), в то же время у носителей аллеля Т и генотипа ТТ риск развития СД2 был увеличен (OR=1,31 и 1,63 соответственно). Данные согласуются с работой, выполненной на меньшей (129 против 500 в настоящей работе) выборке пациентов русской популяции [22]. В то же время, для полиморфного маркера rs16928751 в группах «СД2+» – Б и «СД2-» – К значимых статистических различий обнаружено не было (табл. 8).

Таблица 8. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs16928751 гена ADIPOR2 в группах Б и К

Заключение

На основании полученных нами данных можно сделать вывод о том, что в русской популяции гены, определяющие пониженную чувствительность периферических тканей к действию инсулина (ADIPOQ, ADIPOR1 и ADIPOR2), в гораздо меньшей степени ассоциированы с развитием СД2, чем в зарубежных исследованиях. В то же время следует отметить, что один из полиморфных маркеров гена ADIPOR2 показал ассоциацию с развитием СД2 в русской популяции, хотя в полных геномных поисках ассоциация этого гена с СД2 не была обнаружена.

Все эти данные говорят о важности исследования предрасполагающих генетических факторов, вклад которых в развитие заболевания существенно изменяется в зависимости от популяции. Выявление генетических маркеров риска СД2 позволяет лучше понять основной патологический механизм развития этого заболевания и в соответствии с этим выбрать оптимальную терапию заболевания, а также использовать полученные данные для профилактики СД2 у здоровых людей.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Финансирование исследования осуществлялось за счет Государственного задания ФМБА России.