Иммуногенетические аспекты медленно прогрессирующего аутоимунного диабета у взрослых (LADA)

Сахарный диабет 1 типа (СД1) возникает в результате аутоиммунной деструкции инсулин-секретирующих клеток. При физиологических условиях существует баланс между эффекторными Т-клетками и регуляторными клетками, контролирующими аутоиммунитет. При СД1 и других аутоиммунных заболеваниях этот баланс нарушается [1]. Treg – уникальная популяция Т-клеток, которая относится к CD4+CD25+ Т-лимфоцитам [2, 3, 4] и экспрессирует транскрипционный фактор FoxP3. От интенсивности экспрессии FoxP3 зависит их супрессивная активность. Treg – хорошо известные иммунорегуляторы, которые могут подавлять пролиферацию эффекторных клеток путем ингибирования сигнальных путей активации IL-2 [5]. Они помогают иммунной системе сохранять гомеостаз Т-клеток, и это, в свою очередь, ведет к развитию воспалительных ответных реакций [6,7]. Treg стремятся ликвидировать активный ответ Т-клеток и предотвратить развитие аутоиммунных реакций, регулируя распространение популяции Т-клеток и их дифференциацию, а также функцию эффекторных Т-клеток [8]. Показано, что при СД1 наблюдаются нарушения функции Treg [9, 10].

Одним из вариантов течения аутоиммунного сахарного диабета является медленно прогрессирующий аутоиммунный диабет взрослых – »latent autoimmune diabetes in adults» (LADA) [11, 12, 13]. Он сопровождается клинической картиной, не типичной для классического СД1. Несмотря на наличие положительных аутоантител, характеризуется медленными темпами аутоиммунной деструкции, что не сразу приводит к развитию потребности в инсулине. Эпидемиологические исследования показали, что LADA встречается в 2–12% всех случаев СД [14, 15]. Данная форма СД занимает промежуточное положение между СД1 и СД 2 типа (СД2) и в последней классификации не выделяется в отдельный тип. Тем не менее, при диагностике заболевания важно не забывать о существовании подобного варианта течения аутоиммунного СД. В попытках стандартизировать определение LADA иммунологическое общество диабета (Immunology of Diabetes Society) предложило учитывать следующие критерии — возраст выявления заболевания, наличие положительных титров аутоантител, отсутствие потребности в экзогенном инсулине, по крайней мере, в течение первых 6 мес заболевания. Таким образом, основное отличие данной формы от СД1 — наличие периода «инсулинонезависимости» после постановки диагноза, а от СД2 — присутствие маркеров аутоиммунной деструкции.

По данным литературы, возраст дебюта LADA колеблется в пределах от 25 до 40 лет [16, 17]. В большинстве случаев LADA выявляется у людей в возрасте 30–35 лет.

Чаще всего у пациентов с LADA на момент постановки диагноза отмечается избыточная масса тела (индекс массы тела (ИМТ) >25 кг/м2), что объединяет этот вариант с СД2. При этом абдоминальное ожирение, если оно имеет место, менее выражено. Также могут встречаться и нормальные значения массы тела, поэтому данный показатель нельзя рассматривать как диагностический.

Аутоантитела к антигенам β-клетки являются маркерами аутоиммунного процесса. Диагноз LADA основывается на выявлении положительных титров хотя бы одного из следующих аутоантител: к глутаматдекарбоксилазе (GADA), поверхностным антигенам к β-клеткам (ICA), инсулину (IAA) и тирозин-фосфатаза-подобному белку IA (IA-2A) [18]. По данным UKPDS [17], при исследовании титров аутоантител, проведенном 3672 больным с типичным СД2, в 12% случаев были выявлены те или иные аутоантитела к антигенам β-клетки. Наличие аутоантител коррелировало с более молодым возрастом — в возрасте 25–34 лет в 21% выявлены ICA, в 34% GADA, а в возрасте 55–65 лет только 4% больных имели положительные титры ICA и 7% GADA. В скрининговых исследованиях пациентов с фенотипическим СД2 в 25–46% обнаруживается, по крайней мере, один тип аутоантител [16, 17, 19]. По данным литературы, наиболее часто у пациентов с LADA обнаруживаются положительные титры GADA и ICA [16, 20], в то время как у пациентов с СД1 чаще выявляются GADA и IA-2. Как показано в работе Seissler J. и соавт., GADA и IA-2A встречаются в сыворотке крови приблизительно у 60% пациентов с СД1 и только у 37,5% людей с LADA [21]. Наличие аутоантител в сыворотке крови отличает LADA от СД2 [22]. Поэтому для своевременной диагностики LADA необходимо проведение иммунологического исследования пациентам в возрасте 30–45 лет с клинической картиной СД2 без ожирения.

Известно, что аллели DRB1*03, DRB1*04 и DQB1*0201, DQB1*0302 ассоциируются с повышенным риском развития СД1, а аллели DRB1*15 и DQB1*0301, DQB1*0602 являются протективными в отношении развития СД1. В европейских исследованиях показано, что у пациентов с LADA чаще выявляются «предрасполагающие» аллели, чем у здоровых людей [18, 17]. Интересно отметить, что по данным исследования, проведенного в Швейцарии, с положительными титрами GADA особенно часто ассоциировался аллель DQB1*0302 [18]. Однако частота встречаемости генотипов высокого риска развития СД1 при LADA оказалась значительно ниже, чем при СД1 у детей и взрослых. При этом у пациентов с LADA чаще определялись «протективные» аллели DQB1*0602. Протекция, ассоциированная с DRB1*15/DRB1*0602, может объяснять возраст манифестации LADA. Таким образом, для LADA характерно одновременное присутствие как «предрасполагающих», так и «протективных» аллелей HLA II класса.

Одним из критериев LADA является отсутствие потребности в экзогенно вводимом инсулине, как минимум, в течение 6 мес после постановки диагноза СД [16, 17]. На длительность этого периода наибольшее влияние оказывают такие факторы, как выраженность аутоиммунного процесса, остаточная секреция инсулина, поддержание оптимального гликемического контроля.

Как и классический СД1, LADA связан с потерей иммунологической толерантности к собственным антигенам. Между тем, при LADA количественная и функциональная активность Тreg как центральных регуляторов иммунного ответа и главных носителей феномена иммунологической толерантности до сих пор остаются не изученными, как и их взаимосвязь с показателями апоптоза. При СД1 одной из причин развития аутоиммунитета является нарушение процесса элиминации аутореактивных иммунных лимфоидных клеток. В норме клоны аутореактивных клеток подвергаются апоптозу [23]. Система Fas-FasL является наиболее изученной системой активации апоптоза. Взаимодействие поверхностных маркерных молекул СD95(Fas) с лигандом – СD95L(FasL) запускает процесс клеточной гибели. Таким образом, уровень экспрессии CD 95 на поверхности клетки определяет ее готовность к вступлению в апоптоз. Однако маркеры апоптоза у пациентов с LADA недостаточно изучены.

Цель

Определение количественных и функциональных изменений, происходящих на уровне регуляторного звена иммунитета у пациентов с различной длительностью LADA, их взаимосвязь с показателями апоптоза, иммунологическими и генетическими маркерами.

Материалы и методы

В исследование были включены 74 пациента (51 мужчина, 23 женщины) с LADA. Больные были разделены на группы в зависимости от длительности заболевания: впервые выявленный LADA (первые 6 мес заболевания) (группа 1) — 14 человек, 6–12 мес (группа 2) – 20 человек, с длительностью СД от 1 года до 5 лет (группа 3) — 26, от 5 до 10 лет (группа 4) — 14. Диагноз медленно прогрессирующего аутоиммунного диабета взрослых – LADA, согласно критериям P. Zimmet, ставился пациентам с дебютом заболевания в возрасте старше 30 лет, постепенным началом, положительными аутоантителами к аутоантигенам β-клетки и/или инсулину, отсутствием кетонурии, нормальными значениями базальной концентрации С-пептида в сыворотке крови [13].

Медиана возраста дебюта заболевания LADA составила 38,0 лет [30,0; 43,0], ИМТ 28,82 кг/м2 [23,83; 31,23].

Контрольную группу составили 56 практически здоровых лиц (30 мужчин и 26 женщин), сопоставимых по возрасту с пациентами исследуемых групп. Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие нарушений углеводного обмена и отрицательные аутоантитела к антигенам β-клетки (GADA, IA-2A, ICA, IAA). Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили с помощью наборов пробоподготовки «DNA prep». ДНК-типирование выполнялось по аллельным вариантам 3 генов HLA II класса: DRB1 (14 специфичностей), DQA1 (8 аллелей) и DQB1 (13 аллелей) методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения полиморфных аллелей данных генов применялись коммерческие наборы производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология». ПЦР проводилась согласно регламенту, указанному производителем. Амплификацию проводили на амплификаторе «Терцик». Идентификацию продуктов амплификации проводили после электрофореза в 3% агарозном геле и окрашивания продуктов амплификации бромистым этидием. Гаплотипы составлялись на основе известных таблиц сцепления.

Иммунологическое исследование включало определение аутоантител к ICA, GADA, IA-2A и антиинсулиновых аутоантител IAA. Количественное определение ICA, GADA и IAA в сыворотке крови обследованных определяли с помощью иммуноферментных наборов «Isletest-ICA, GADA, IAA» фирмы «Biomerica» согласно методике производителя. Количественное определение IA-2A в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов «Medizym» фирмы «Medipan MGBH».

Содержание гликированного гемоглобина (HbA1c) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) на аппарате D-10 («Bio-Rad») по стандартной методике производителя.

Определение базальной концентрации С-пептида в крови для оценки функционального состояния β-клеток проводили иммунохемилюминесцентным методом на аппарате «Elecsys 2010» («Roche»).

Определение субпопуляционного состава лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD38+, CD95+, CD95L+, DR+) периферической крови проводили на проточном цитометре «FACSCalibur» с использованием моноклональных антител одинарной и двойной меткой («Becton Dickinson») к дифференцировочным антигенам лимфоцитов по стандартной методике. При этом оценивали процентное содержание, экспрессию дифференцировочных антигенов и абсолютное количество указанных субпопуляций лимфоидных клеток.

Для определения интенсивности экспрессии гена Fox P3 проводилось выделение тотальной РНК из образцов крови данных групп пациентов и получение комплиектарного ДНК (кДНК) по матрице РНК. Определение интенсивности экспрессии гена Fox P3 было проведено методом ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR). Для проведения Real-time PCR были синтезированы праймеры и отработаны оптимальные условия амплификации. При оптимизации метода Real-time PCR был определен диапазон значений, в котором соблюдается линейная зависимость интенсивности флюоресценции от концентрации кДНК.

Статистическая обработка результатов исследования выполнена с помощью пакета прикладных программ Statistica v 6.0 for Windows. Сравнение показателей выделенных групп пациентов проводилось по U-критерию Манна-Уитни. Корреляционный анализ осуществлялся непараметрическим методом ранговой корреляции по Спирмену. Количественные показатели представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха [Q25; Q75].

Критический уровень значимости принимался равным 5%.

Для определения диапазона нормальных показателей интенсивности экспрессии гена Fox P3 было обследовано 85 здоровых доноров.

Результаты и их обсуждение

У всех обследуемых пациентов с LADA в дебюте заболевания были выявлены положительные аутоантитела (табл. 1). Наиболее часто во всех группах встречались GADA.

Результаты определения HbA1c, С-пептида и GADA как наиболее часто встречающихся аутоантител при LADA представлены в таблице 2.

Учитывая аутоиммунный характер СД и выраженную генетическую ассоциацию заболевания с генами (DRB1, DQA1, DQB1) локуса HLA класса II [20] нами были определен ряд генетических и иммунологических характеристик при LADA.

Анализировали частоту встречаемости различных комбинаций гаплотипов в генотипе HLA у пациентов LADA.

В качестве «предрасполагающих» и «протективных» к заболеванию анализировали следующие гаплотипы.

«Предрасполагающие» гаплотипы:

1. DRB1*03-DQA1*0501-DQB1*0201;
2. DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302;
3. DRB1*01-DQA1*0101-DQB1*0501.

«Протективные» гаплотипы:

1. DRB1*13-DQA1*0102-DQB1*0602-8;
2. DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8;
3. DRB1*11-DQA1*0501-DQB1*0301;
4. DRB1*13-DQA1*0501-DQB1*0301.

Обращает на себя внимание, что в группе пациентов с LADA частота генотипов с двумя предрасполагающими гаплотипами значительно ниже (18,9%), чем с одним предрасполагающим гаплотипом в сочетании с протективным или нейтральным (54%) (табл. 3).

Возможно, отмеченные частотные генотипические отличия HLA локуса могут являться относительными критериями LADA в комбинации с другими диагностическими маркерами.

Исследование иммунологических показателей в различные сроки наблюдения может быть полезным для анализа степени выраженности аутоиммунного процесса и общей иммунореактивности. Учитывая значение Тreg в регуляции иммунных реакций. нами были проанализированы CD4+CD25+-лимфоциты и их активность по оценке экспрессии гена FOXP3, а также ряд маркерных молекул апоптоза.

Субпопуляционный состав лимфоидных клеток в группе больных LADA с различной продолжительностью заболевания представлен в таблице 4.

Не отмечено статистически значимых изменений основных субпопуляций лимфоидных клеток периферической крови при различной длительности заболевания LADA.

Для оценки регуляторного звена иммунитета были определены Тreg, экспрессия FoxP3 и показатели апоптоза на разных сроках LADA.

Прямая взаимосвязь между количеством Тreg и интенсивностью экспрессии гена FoxP3 выявлена только в контрольной группе.

Изменение экспрессии гена FoxP3 у пациентов с LADA носит волнообразный характер, что не наблюдается у пациентов с СД1. Начало заболевания характеризуется показателями экспрессии, не отличающимися от контрольных значений, при этом наблюдается достоверное повышение относительного количества CD4+25+high-Т-лимфоцитов. Возможно, увеличение численности Тreg компенсирует их функциональный дефицит. Снижение экспрессии гена FoxP3 при диабете LADA, в отличие от СД1, наблюдается через 6–12 мес от начала заболевания, при этом количество CD4+25+high-Т-лимфоцитов нормализуется и при дальнейшем течении заболевания не отличается от контрольных значений. В период от 1 до 5 лет вновь наблюдается нормализация экспрессии гена FoxP3, при длительности болезни более 5 лет – достоверное снижение (рис. 1 и рис. 2).

Нарастание процентного содержания Тreg в период до 6 мес может отражать их регулирующую роль на подавление активности аутоиммунитета.

В настоящей работе нами были исследованы маркеры апоптоза у пациентов с LADA.

Известно, что CD95L экспрессируется на активированных лимфоцитах, а при взаимодействии рецептора CD95 с лигандом происходит индукция апоптоза клеток, несущих CD95 на поверхности.

Показатели в течение первого года были сопоставимы с контролем и не отличались между собой (p>0,05).

Снижение экспрессии CD95 на клетках может свидетельствовать о резистентности лимфоцитов к апоптозу и способствовать пролонгации иммунного ответа.

Уровень экспрессии CD95 на лимфоцитах у пациентов с LADA во всех группах был сопоставим с контролем. Нарастание в период 1–5 лет маркерных молекул CD95 (в небольшой степени) и CD95L может отражать относительно вялотекущий аутоиммунный процесс до 1 года и его отстроченную (замедленную) активацию на более поздних этапах, что может быть одним из проявлений динамики процесса при LADA (рис. 3 и рис. 4).

Запуск апоптотического процесса может осуществляться и при взаимодействии с CD95 и его растворимого лиганда.

Исследована концентрация растворимых форм апоптотических маркеров в сыворотке крови (sCD95 и sCD95L) в течение первого года заболевания.

У пациентов с LADA концентрация sCD95 в сыворотке крови оказалась немного выше показателей группы контроля, однако различия статистически недостоверны на всех этапах наблюдения (p >0,05). В дебюте — 92,7 пг/мл, через год — 81,7 пг/мл, в группе контроля — 72,2 пг/мл.

Концентрация sCD95L у всех пациентов и в группе контроля была ниже пороговых значений (0,16 пг/мл).

В исследованных группах была обнаружена умеренная обратная взаимосвязь между возрастом дебюта СД и: весом пациента (r=-0,63, p=0,004), ИМТ (r=-0,54, p=0,018), титром ICA (r=-0,49, p=0,030). Между возрастом дебюта и концентрацией ИРИ была подтверждена выраженная обратная зависимость (r=-0,81, p=0,026), а между ИМТ и концентрацией С-пептида — умеренная положительная (r=058, p=0,02). Выявленные закономерности позволяют утверждать, что чем больше ИМТ и содержание ИРИ, тем в более молодом возрасте может развиться LADA. Для более молодого возраста дебюта характерен больший титр ICA (р=0,02). При этом у пациентов не наблюдалось корреляции между содержанием С-пептида и титром аутоантител в крови. В то же время, между содержанием HbA1c и С-пептида у обследованных пациентов обнаружена умеренно выраженная обратная зависимость (r=-0,54, p=0,05).

При анализе взаимосвязи иммунологических маркеров СД и количественных показателей интенсивности апоптоза была обнаружена сильная положительная корреляции между количеством антител к GAD и содержанием CD95L (%) (r=0,94, p=0,05), умеренная обратная корреляция между концентрацией антител к GAD и относительным количеством CD20 (r=‑0,60, p=0,02) — маркером активных антител-продуцирующих β-клеток.

В ходе исследования была выявлена умеренная положительная корреляция между титром IAA и относительным количеством CD8 (r=0,54, p=0,04) (рис. 5).

Воздействие активированных CD8 цитотоксических Т-лимфоцитов на клетки-мишени может приводить к разному эффекту. После распознавания иммуногенного комплекса на клетке-мишени CD8-лимфоциты выделяют целый набор эффекторных молекул, совместное действие которых вызывает либо некроз, либо апоптоз этих клеток.

Таким образом, при заболевании LADA функциональный дефицит Тreg отсрочен, а прогрессирование индуцированной аутоиммунной реакции при длительности заболевания от 1 до 5 лет по неизвестным пока причинам замедляется, несмотря на наличие антител. Возможно, индукция аутоиммунного процесса происходит на фоне имеющейся периферической инсулинорезистентности, характерной для больных LADA.

Вероятно, высокие потребности в инсулине у инсулинрезистентных пациентов приводят их к диабету при меньшем повреждении β-клеток (у худых, с хорошей чувствительностью к инсулину требуются более серьезные повреждения β-клеток для развития клинической манифестации диабета).