Полиморфные маркеры генов IL2RA и IL2: популяционные различия в ассоциации с сахарным диабетом

Сахарный диабет 1 типа (СД1) – широко распространенное, тяжело протекающее заболевание, приводящее к ранней инвалидности и прежде­временной смерти больных. Для СД1 характерно аутоиммунное разрушение β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы и последующая полная зависимость больного от введения экзогенного инсулина, необходимого для регуляции уровня глюкозы в крови. СД1 представляет собой не только медицинскую, но и серьезную социальную проблему [1]. В русской популяции около 0,4% индивидов больны этой формой диабета, а средняя продолжительность жизни у заболевших СД1 в детстве на 20 лет меньше, чем средняя продолжительность жизни в общей популяции.

СД1 относится к полигенным, многофакторным заболеваниям. Генетическая предрасположенность к СД1 связана с наследованием определенных аллелей обычных «здоровых» генов [2]. Иногда эти аллели, которые определяют предрасположенность к СД1 и сцеплены с заболеванием, называют этиологическими мутациями или вариантами.

У генетически предрасположенных индивидов СД1 развивается только вследствие взаимодействия между не изученными до конца генетическими факторами и совсем не известными факторами внешней среды [3]. Отсюда следует, что развитие СД1 может быть предотвращено, или, как минимум, отложено и при этом контролируемо внесением определенных изменений в среду, в которой живет индивид, предрасположенный к развитию этого заболевания [4].

Интерлейкин-2 (IL-2) – основной регуляторный цитокин, который синтезируется в Т-лимфоцитах в ответ на их активацию антигеном или лектином [5–6]. Однако полученные недавно данные говорят о том [7–9], что развитие аутоиммунного процесса связано главным образом с резким снижением количества регуляторных Т-лимфоцитов CD4+CD25+, а не с гиперактивацией Т-клеток, в которой IL-2 тоже играет важную роль. В поддержку этой гипотезы свидетельствует тот факт, что инъекция непораженных регуляторных Т-клеток или пересадка здорового костного мозга делает организм животного нечувствительным к данному виду патологии [7–9].

Множество исследований доказали необходимость нормального функционирования сигнального пути IL-2/рецептор IL-2R (IL-2R) для поддержания популяции регуляторных Т-лимфоцитов [10–12], которые, несмотря на наличие высокоаффинного рецептора к IL-2, сами не синтезируют этот интерлейкин. Фактически, FoxP3 (транскрипционный фактор, специфичный для клеток CD4+CD25+FoxP3+) ингибирует экспрессию IL-2. Таким образом, развитие и гомеостаз регуляторных Т-клеток зависят от IL-2, который синтезируется другими типами клеток, и от уровня экспрессии и/или функциональ­ности IL‑2R. Так как в гене IL2RA (гене, кодирующем α-цепь IL‑2R) не было найдено аминокислотных полиморфизмов, по-видимому, этиологический вариант может быть связан с уровнем экспрессии гена или с синтезом белка на уровне мРНК.

Впервые ассоциация гена, кодирующего IL-2, с СД1 была обнаружена на модели мышей линии NOD (non-obese diabetic) [7]. Эти данные были подтверждены в двух полных геномных поисках маркеров, ассоциированных с СД1 у человека [13–14]. Однако это предварительные результаты, и для подтверждения роли гена IL2 в патогенезе СД 1 необходимо более тщательное картирование области максимальной ассоциации.

Действие IL-2 реализуется через его специфический рецептор, IL-2R (CD25). На поверхности большинства клеток, в том числе Т-хелперов, рецептор появляется в ответ на иммуногенный сигнал и обеспечивает пролиферацию данного типа клеток под действием IL-2. Рецептор представляет собой гетеродимер, который состоит из α- и β-цепей. Ген IL2RA, расположенный на хромосоме 10p15, кодирует α-цепь [15]. Она обладает слабой способностью связывать IL-2, которая резко усиливается после димеризации с β-цепью, продуктом гена IL2RB.

Эксперименты на животных позволили выявить значимость рецептора CD25 (IL2R) [7, 16]. Так, у мышей, из кровотока которых удалены клетки с фенотипом CD4+/CD25+, развивались специфичные для тех или иных органов аутоиммунные заболевания. Таким образом, CD25 обладает свойствами негативного регулятора аутоиммунных процессов.

Выраженная ассоциация с СД1 локуса IL15RA-IL2RA-RBM17 на хромосоме 10р15.1 обнаружена в 2005 г. [17] и подтверждена в 2007 г. [18]. Среди шести полиморфных маркеров, высокодостоверно ассоциированных с заболеванием, три находились в 5’-области гена IL2RA, а остальные – между генами IL2RA и RBM17. В следующей работе, выполненной в той же лаборатории [19], было показано, что в гене IL2RA и прилегающих областях можно выделить три группы маркеров, каждая из которых независимо ассоциирована с СД1 [19]. Максимальный уровень ассоциации был обнаружен для маркеров rs41295061 и rs11594656 гена IL2RA, кроме того, авторам удалось показать, что можно вычленить 4 гаплотипа региона IL2RA, ассоциированных с уровнем экспрессии гена IL2RA [19].

В данном исследовании нами изучена ассоциация полиморфных маркеров rs41295061 и rs11594656 гена IL2RA и полиморфного маркера rs2069762 гена IL2, для которых ранее была обнаружена ассоциация с СД1 в ряде исследований [13, 18, 20].

Материалы и методы

В работе использовали образцы крови от группы больных СД1 (451 человек) и группы здоровых индивидов (306 человек) русского происхождения.

Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (г. Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (г. Москва). Флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (г. Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [21].

Амплификацию полиморфных участков генов IL и IL2RA проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени» на термоциклере «ABI 7500 Fast» (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 100 нМ зондов, 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50–100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95°C/2 мин – 1-й цикл; 94°C/10 сек, 54°C/60 – 40 циклов для полиморфизма rs41295061 гена IL2-RA, 95°C/2 мин – 1-й цикл; 94°C/10 сек, 56°C/60–40 циклов для полиморфизма rs11594656 гена IL2-RA, 95°C/2 мин – 1-й цикл; 94°C/10 сек, 56°C/60 – 40 циклов rs2069762 гена IL2. Размер продукта амплификации 112 последовательность нуклеотидов (п.н.) для полиморфизма rs41295061 гена IL2-RA, 166 п.н. для полиморфизма rs11594656 гена IL2-RA, 122 п.н. – rs2069762 гена IL2. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств програм­много обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопря­жен­нос­ти и критерия хи-квадрат (χ2). Достоверными считали различия при p<0,05. Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях "случай-контроль"» [22].

Результаты и их обсуждение

Несмотря на то, что ключевые полиморфные маркеры rs41295061 и rs11594656 находятся между генами IL2RA и RBM17, развитие СД1 связывают с геном IL2RA, исходя из функций его белкового продукта. Аллель А полиморфного маркера rs41295061 (A/C) гена IL2RA, а следовательно и генотип АА, встречаются среди русских гораздо реже (табл. 1). В случае полиморфного маркера rs11594656 (A/T) аллель А и генотип АА также достаточно редко встречаются среди русских (табл. 2). Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов этих полиморфных маркеров в группах больных СД1 и здоровых индивидов не выявил статистически значимых различий (табл. 1, 2).

В случае полиморфного маркера rs2069762 (A/C) гена IL2 аллель А и генотип АА являются мажорными (табл. 3). Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2069762 гена IL2 в группах больных СД1 и здоровых индивидов также не выявил статистически значимых различий (табл. 3).

Данные результаты отличаются от результатов, полученных для популяции западной части Европы [10–11], где исследуемые полиморфные маркеры показывают сильную ассоциацию с СД1. Это, возможно, объясняется спецификой аутоиммунной регуляции Т-лимфоцитов у людей русского происхождения.

Частоты встречаемости генотипов и случаи развития СД1 не показывают определенной зависимости в нашей выборке. Поэтому можно предположить, что в русской популяции превалируют другие механизмы развития СД1 по сравнению с населением западной части Европы.

Несомненно, что сигнальный путь IL-2/IL-2R важен для поддержания уровня регуляторных Т-клеток, играющих ключевую роль в развитии СД1. Однако существует множество других генетических факторов, в большей степени определяющих этиологию развития СД1 у людей русского происхождения, например, экспрессия гена SH2B3 имеет более выраженное влияние на развитие СД1 у русских, чем у людей западноевропейской популяции [23].

Наши результаты выявляют популяционные отличия в частоте аллелей и генотипов, а также в ассоциации полиморфных маркеров СД, влияющих на аутоиммунную регуляцию. Поэтому так важно на ранних стадиях найти наиболее значимые генетические факторы, позволяющие проводить персонализированную терапию.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт 16.512.11.2045) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-01443-а).