Анализ ассоциаций полиморфизма С1159А гена интерлейкина 12В с сахарным диабетом 1 типа в этнических группах Башкортостана

Сахарный диабет 1 типа (СД 1) – одна из наиболее острых научных и медико-социальных проблем. Существуют различные точки зрения на этиологию и патогенез заболевания. Известно, что СД 1 развивается при воздействии факторов окружающей среды на генетически предрасположенный организм, при этом вклад наследственности в развитие заболевания составляет 60–80% [1]. Заболевание развивается в результате аутоиммунной деструкции b-клеток поджелудочной железы. Критическую роль в инициации их гибели играют цитокины. При СД 1 происходит увеличение выработки интерлейкина 12 (ИЛ-12) активированными макрофагами. Этот процесс провоцирует дифференцировку Т0-хелперов в Т1-хелперы, которые посредством цитокинов активируют макрофаги и цитотоксические Т-лимфоциты, а последние, в свою очередь, способствуют гибели b-клеток и развитию абсолютного дефицита инсулина.

На лабораторных животных была показана роль ИЛ-12 в развитии СД 1. В исследованиях, которые проводили на изолированной поджелудочной железе крыс и мышей, выявлено, что ИЛ-12 подавляет выработку инсулина у здоровых животных [2]. A. Davoodi-Semiromi и соавт. продемонстрировали взаимосвязь между уровнем экспрессии гена ИЛ12 и степенью деструкции инсулинпродуцирующих клеток у NOD-мышей (non-obese diabetic mice – экспериментальная модель аутоиммунного диабета) [3].

ИЛ-12 состоит из двух полипептидных цепей, со­единенных между собой дисульфидными связями: тяжелая цепь р40 (40кДа) и легкая цепь 35р (35кДа). Ген, кодирующий субъединицу р40 (ИЛ12B), локализован на хромосоме 5q31.1–q33.1 и ограничен регионом 30 кб, а ген субъединицы р35 (ИЛ12А) – на хромосоме 3 (3р12–q13.2).

При обследовании семей больных СД 1 показано строгое неравновесие по сцеплению для аллеля А полиморфизма С1159А. Однако выявлена взаимосвязь аллеля С и генотипа AC с поздним началом заболевания [4, 5]. Согласно результатам отдельных работ, аллель А ассоциирован с более высоким уровнем экспрессии мРНК гена ИЛ12 [6, 7, 8]. В частности, уровень экспрессии мРНК клеточной линии с генотипом АА выше, чем линии с генотипом СС [6]. В связи с этим полагают, что полиморфизм С1159А гена ИЛ12B имеет функциональное значение. Однако такая точка зрения не подтверждается результатами другого исследования [9].

Цель настоящего исследования заключалась в анализе ассоциаций полиморфизма С1159А гена ИЛ12B c развитием СД 1 в трех этнически однородных группах (русские, башкиры, татары), проживающих на территории республики Башкортостан.

Объект и методы исследования

В исследовании приняли участие 313 пациентов в возрасте от 7 до 71 года (татар – 127, русских – 110, башкир – 66), в том числе мужчин – 155, женщин – 158. Возраст начала заболевания варьировал от 2 до 61 года. Выборка была сформирована из больных СД 1, находящихся на диспансерном учете в поликлиниках города Уфы и районов республики Башкортостан. В группу сравнения были включены практически здоровые лица, не родственные между собой и не имеющие родственников больных СД.

ДНК выделяли методом фенольно-хлороформной экстракции [10]. У всех пациентов, включенных в исследование, а также у всех лиц группы сравнения был исследован полиморфизм С1159А гена ИЛ12B. Анализ полиморфизма С1159А гена ИЛ12B осуществляли методом полимеразной цепной реакции, последовательности праймеров, условия ПЦР и процедура анализа продуктов амплификации соответствовали приведенным ранее [11]. Статистическую обработку материалов проводили с использованием программ Microsoft Excel 2000, Statistica (v 5.5). Соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому распределению оценивали по критерию χ2 [12, 13]. Сравнение групп по частотом аллелей и генотипов проводили с использованием точного двустороннего критерия Фишера. Относительный риск заболевания рассчитывали как отношение шансов (OR – odds ratio) [14].

Результаты и их обсуждение

Результаты типирования по полиморфизму С1159А гена ИЛ12B здоровых лиц и больных СД 1 представлены в табл. 1. Статистически значимых различий по распределению частот аллелей и генотипов между группами больными СД 1 и практически здоровых лиц не выявлено.

В предыдущих исследованиях показаны гендерные различия в распределение частот генотипов по полиморфизму DRB1 гена HLA класса II [15]. Согласно результатам нашего исследования, по частотам аллелей и генотипов полиморфизма С1159А гена ИЛ12B выборки мужчин и женщин не различались (данные не приводятся).

С учетом возраста манифестации заболевания выборка больных СД 1 была разделена на 2 группы: группу пациентов, у которых заболевание манифестировало в возрасте до 16 лет, и группу пациентов, заболевших в возрасте старше 16 лет (табл. 2). Как оказалось, в группе этнических русских аллель С чаще встречается у больных с поздней манифестацией СД 1 (30,5% против 17,1% в подгруппе пациентов с началом диабета в возрасте до 16 лет, p=0,047). Более высокая частота генотипа СС в подгруппе пациентов с поздним началом заболевания по сравнению с лицами, заболевшими в возрасте до 16 лет, недостоверна, но имеет характер выраженной тенденции (14,6% и 2,3% со­ответственно, p=0,052).

В этнической группе башкир среди пациентов с поздним началом заболевания по сравнению с другими пациентами с большей частотой обнаруживается генотип АС (53,6% и 33,3% соответственно, p=0,074).

Анализ литературных данных показал, что наблюдается выраженная дифференциация популяций народов мира по полиморфизму С1159А гена ИЛ12B. Распределение частот генотипов полиморфизма С1159А гена ИЛ12B в популяциях русских, башкир и татар Башкортостана схоже с таковым в большинстве европеоидных популяций и отличается от спектра частот генотипов в популяциях негроидов и монголоидов. По изучаемому полиморфному локусу структура популяций русских и башкир, а также башкир и татар одинакова, тогда как татары и русские достоверно различаются между собой (χ2=6,353, p=0,044).

Ген ИЛ12B, кодирующий один из ключевых медиаторов аутоиммунного воспаления, представляет особый интерес при изучении СД 1. В ходе проведения широкомасштабного геномного сканирования в странах Европы, его включили в число генов-кандидатов СД 1 (IDDM18). Установлено, что полиморфизм С1159 гена ИЛ12B влияет на уровень экспрессии субъединицы р40 ИЛ12, уменьшается синтез инсулина и ускоряется развитие СД 1 у экспериментальных животных.

В результате проведения скандинавского геномного скрининга не было найдено связи СД 1 с полиморфизмом С1159 гена ИЛ12B. Установлено, что у норвежцев, северных ирландцев, итальянцев, испанцев, шведов СД 1 не ассоциирован с полиморфным локусом С1159А гена ИЛ12B [9]. Однако в данных исследованиях не учитывался возраст манифестации заболевания. Вместе с тем многими авторами показана генетическая гетерогенность СД 1 в зависимости от возраста дебюта. В настоящем исследовании в этнической группе русских выявлена стойкая тенденция к увеличению частоты генотипа СС и аллеля С в выборке пациентов с поздней манифестацией заболевания по сравнению с заболевшими в возрасте до 16 лет.

В эксперименте была показана роль ИЛ-12 в патогенезе СД 1, в частности продемонстрировано увеличение выработки ИЛ-12 активированными макрофагами. Более высокий уровень экспрессии мРНК гена ИЛ12 ассоциирован с аллелем А, а пониженный – с аллелем С, в чем и заключается функциональное значение полиморфизма С1159А гена ИЛ12B. Можно предположить, что генотип СС и аллель С предрасполагают к менее агрессивному течению диабета, что проявляется в отсроченности манифестации заболевания. Соответственно, при воздействии одних и тех же средовых факторов, СД 1 развивается позднее у носителей генотипа СС и аллеля С.

Биологически активным ИЛ-12 является гетеродимер р70 или р75. При усилении экспрессии гена ИЛ12В, описанном некоторыми авторами, образуется излишек свободной р40 цепи. При этом возможно не только ее сочетание с ИЛ12А, но и самостоятельное функционирование или объединение с подобной субъединицей. Биологические эффекты свободной субъединицы р40 не достаточно изучены. Известно, что гомодимер р40 и в меньшей степени мономер р40 являются антагонистами рецептора ИЛ-12 [20]. Таким образом, в результате конкуренции субъединиц за соединение с рецептором, биологическое действие ИЛ-12 может изменяться.

Наряду с образованием гомодимера р40 и ИЛ-12 (p35p40), изучаемая субъединица входит в состав ИЛ-23 (p19p40), что также влияет на проявление функциональной активности полиморфизма гена, кодирующего субъединицу р40. Таким образом, изменение уровня экспрессии субъединицы р40 может неоднозначно сказываться на изменениях в цитокиновом каскаде организма, и этим отчасти можно объяснить противоречивость данных разных исследователей об ассоциации полиморфизма С1159А гена ИЛ12B с СД 1.

Для понимания сложных взаимодействий между полиморфизмом С1159А гена ИЛ12B, биологическими эффектами ИЛ-12 и генетической предрасположенностью к СД 1 требуется продолжить исследование.

Таким образом, нами охарактеризован полиморфизм С1159А гена ИЛ12B у этнических русских, татар и башкир (республика Башкортостан). Распределение частот генотипов по полиморфизму С1159А гена ИЛ12B в популяциях русских, башкир и татар Башкортостана схоже с таковым в большинстве европеоидных популяций и отличается от спектра частот генотипов в популяциях народов негроидной и монголоидной групп.

У этнических татар и башкир полиморфизм С1159А гена ИЛ12B не ассоциирован с СД 1.

У этнических русских наблюдается выраженная тенденция к возрастанию частоты генотипа СС и достоверно большая частота аллеля С среди больных с поздней манифестацией СД 1. Необходимы дополнительные исследования для подтверждения ассоциации полиморфизма С1159А гена ИЛ12B с СД 1 с поздней манифестацией у этнических русских.