Диагностическая и прогностическая значимость аутоантител при сахарном диабете. Новый маркер аутоиммунного процесса - антитела к ZnT8

Сахарный диабет 1 типа (СД1) развивается вследствие аутоиммунной деструкции β-клеток поджелудочной железы. Этот процесс протекает бессимптомно на протяжении многих лет. Нарушение толерантности к глюкозе и клинические проявления болезни возникают при разрушении большинства β-клеток. Об аутоиммунном процессе свидетельствует появление в сыворотке крови антител к β-клеткам поджелудочной железы и лимфоидная инфильтрация островков Лангерганса. Аутоантитела к β-клеткам поджелудочной железы появляются в сыворотке крови за 7 и более лет до клинической манифестации СД1 и служат надежным маркером риска развития этого заболевания. С их помощью возможно идентифицировать аутоантигены β-клеток человека, по отношению к которым сформировался аутоиммунный ответ. После разрушения β-клеток и элиминации аутоантигенов из организма исчезают и антитела. Несмотря на возможность заместительной терапии инсулином, СД1 остается хроническим заболеванием, поражающим преимущественно людей трудоспособного возраста, что имеет большое социально-экономическое значение. Уточнение молекулярных механизмов деструкции β-клеток поджелудочной железы и разработка методов профилактики аутоиммунной агрессии могут позволить излечить это заболевание [1].

В 1974 г. в журнале Lancet была опубликована статья G.F. Bottazzo с описанием антител к островковым клеткам поджелудочной железы (ICA) [2]. Именно это событие многие исследователи признают как дату установления аутоиммунного характера СД1.

Со времени первых сообщений об аутоантителах к островковым клеткам были идентифицированы многие аутоантигены у людей, Not obese diabetes (NOD) мышей и Biobreding (ВВ) крыс, способные стать мишенью для аутоиммунной агрессии. К таким аутоантигенам относятся: содержащий гликолипид аутоантиген островковых клеток со свойствами сиаловой кислоты [3], инсулин [4], рецептор инсулина [5], белок с молекулярной массой 52 кДа [6, 7], белок с молекулярной массой 69 кД [8, 9], декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD) [10], тирозинфосфатаза-2 (IA-2) [11, 12], белок теплового шока с молекулярной массой 52 кДА (HSP65) [13, 14], карбоксипептидаза Н (СНР) [15], транспортер глюкозы [16], аутоантиген с молекулярной массой 38 кДа [17, 18], ретровирусный антиген [19] и определяющий пол участок Y-ассоциированного белка [20].

В зависимости от наличия антител к поджелудочной железе и сохранности функции β-клеток выделяют подтипы: СД1А и СД1B. 1А(A+β–) характеризуется наличием аутоиммунного компонента на фоне выраженного снижения инсулин-секретирующей функции β-клеток. Подтип 1B (A–β–) предполагает отсутствие аутоиммунной агрессии и утрату функции β-клеток [21].

Прогнозирование риска развития диабета тесно связано с числом аутоантител: присутствие двух или более видов аутоантител свидетельствует о большей вероятности заболевания, чем присутствие одного вида антител. У 90% родственников первой линии родства больных СД1, которые имели антитела к IA-2, GAD или инсулину, в итоге развивался диабет в течение нескольких лет после обнаружения антител [22]. У детей с генетической предрасположенностью к СД1, имеющих 2 и более видов антител, в 50% случаев и более в течение 10 лет развивается СД1 [23, 24, 25].

По данным зарубежных авторов, частота обнаружения аутоантител у больных с «классическим» СД1 составляет: ICA – 60–90%, IAA – 16–69%, GAD – 22–81% [26, 27].

Аутоантитела к ферменту глутаматдекарбоксилазе (GAD)

Патогенетическая роль аутоантигенов в развитии СД1 наиболее детально изучена на примере GAD. Кроме того, в последние годы опубликованы работы, в которых показано, что и у больных с поздним аутоиммунным диабетом взрослых (LADA) аутоантитела к GAD являются наиболее информативными [28, 29].

В 1990 г. Беккетсов с сотрудниками [10] обнаружили в островковых клетках белок с молекулярной массой 64 кДа, являющийся меньшей изоформой фермента глутаматдекарбоксилазы (GAD 65), которая участвует в синтезе тормозного нейромедиатора ЦНС – гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Он был впервые выявлен у пациентов с генерализованными неврологическими расстройствами. GAD экспрессируется не только в центральной и периферической нервных системах, но также и в островках поджелудочной железы, яичках, яичниках, вилочковой железе и желудке [30-33].

С этим антигеном реагируют сыворотки 70–80% лиц с предиабетом и недавно диагностированным СД1. Антитела к GAD являются информативным маркером для идентификации предиабета, а также выявления индивидуумов с высоким риском развития СД1 [1]. Доказано, что именно GAD 65 у мышей линии NOD представляет собой аутоантиген, распознаваемый Т-клетками. Формирование толерантности к нему предотвращает развитие заболевания у мышей [1].

В ходе исследования UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study) у 3672 больных с типичной клиникой СД 2 типа (СД2) определяли аутоантитела к ICA и GAD. Антитела к ICA были выявлены у 6% обследуемых, к GAD – у 10%. Наличие аутоантител ассоциировалось с более молодым возрастом пациентов (в возрасте 25–34 года 21% имели антитела к ICA и 34% к GAD, в то время как в возрасте 55–65 лет только 4% к ICA и 7% к GAD) и с клиническими признаками, характерными для СД1 (более низкий ИМТ, более молодой возраст в дебюте заболевания, сниженная функция β-клеток). Среди пациентов моложе 35 лет у 94% с положительными антителами к ICA и 84% с положительными антителами к GAD возникла потребность в инсулине в течение первых 6 лет заболевания. Среди пациентов, не имевших аутоантител, у 14% [34].

По результатам проведенного в Финляндии популяционного исследования, в рамках которого было обследовано 1122 больных, аутоантитела к GAD встречались у 9,3% больных СД2, у 3,6% пациентов с нарушенной толерантностью к глюкозе, у 4,4% обследуемых контрольной группы (383 человека) [35]. Целью проведенного в Австралии исследования [36, 37] было изучение взаимосвязи между наличием у взрослых больных СД2 антител к GAD и ранним началом инсулинотерапии. Результаты исследования показали, что именно наличие аутоантител к GAD, а не фенотипические характеристики в большей степени определяют вероятность развития инсулинопотребности [38, 39].

Аутоантитела к тирозинфосфатазе (IA-2)

Второй компонент 64 кДА антигена – тирозинфосфатаза, получил название IA-2. С ним реагируют сыворотки 60–70% больных с СД1.

Тирозинфосфатаза – аутоантиген островковых клеток, локализованный в плотных гранулах панкреатических β-клеток. По данным Torii S. и соавт. [40], IA-2 (также известный как антиген островков поджелудочной железы (ПЖ) – ICA-512) и IA-2 beta (фогрин, гомолог фосфатазы в гранулах инсулиномы или инсулинома-ассоциированный протеин-2) в настоящее время являются основными маркерными антигенами для СД1, так как антитела к ним обоим появляются до клинической манифестации заболевания.

IA-2 и IA-2 β – трансмембранные белки, содержащие в своей цитоплазматической части неактивный белок-тирозинфосфатазу. Установлена их роль в функционировании различных нейроэндокринных клеток и клеток поджелудочной железы. Существование гомологов IA-2 у разных видов животных предполагает фундаментальную роль в нейроэндокринной функции. Исследования на животных показали влияние IA-2 и IA-2 β на поддержание гормонального статуса. Недавние исследования показали, что наличие IA-2 и IA-2 β способствуют росту β-клеток [40].

По некоторым данным, IA-2 вместе с антителами к инсулину встречаются чаще у детей, чем у взрослых пациентов, и указывают на агрессивную деструкцию β-клеток [22].

В исследовании Verge C.F. и соавт. [22] определяли концентрацию антител к глутаматдекарбоксилазе и фосфотирозинфосфатазе у 45 больных с впервые выявленным СД1, а также у 882 ближайших родственников этих больных и у 217 представителей контрольной группы. По результатам этого исследования был сделан вывод, что предвестником СД1 можно считать скорее сам факт выявления и концентрацию антител, чем определение какого-то их отдельного вида.

Аутоантитела к островковым клеткам (ICA)

По-видимому, на ранних стадиях развития заболевания именно ICA выступают в качестве триггеров аутодеструктивных процессов, выдавая команду на уничтожение собственных островковых клеток антиген-неспецифичным макрофагам и NK-клеткам (натуральным киллерам). Этот процесс может продолжаться годами, длительно оставаясь компенсированным. Антиген-специфичные цитотоксические Т-клетки вовлекаются в процессы аутодеструкции на более поздних стадиях, в результате вялотекущий процесс завершается быстрой деструкцией β-клеток, что переводит заболевание в стадию клинической манифестации. Это происходит при гибели 80–85% массы β-клеток.

Исследования показали, что ICA определяются у 70–80% больных с впервые выявленным СД1 по сравнению с контрольной недиабетической популяцией, где ICA выявляют в 0,1–0,5% случаев. ICA также обнаруживают у близких родственников больных СД1. Эти лица составляют группу повышенного риска развития СД1. В ряде исследований было показано, что у ICA-позитивных близких родственников больных диабетом впоследствии развивается СД1. У больных СД2 при наличии ICA можно с большой вероятностью прогнозировать появление потребности в экзогенном инсулине, а у родственников больных СД1 – развитие этого заболевания.

Аутоантитела к инсулину (IAA)

Еще одним известным аутоантигеном при СД1 является инсулин. Антитела к инсулину (IAA) обнаруживают в сыворотке крови больных СД1 еще до того, как им назначают лечение инсулином. Их появление тесно связано с возрастом. Антитела к инсулину обнаруживают примерно у 50% детей старше 5 лет с недавно выявленным диабетом. Предполагается, что они появляются на более поздних стадиях заболевания, так как индукция толерантности к инсулину у мышей NOD предотвращает развитие заболевания. Однако у мышей NOD, в отличие от мышей, толерантных к GAD 65, сохраняется инсулит [1].

Нередко IАА выявляют у пациентов с большой длительностью заболевания и длительной инсулинотерапией, что обусловлено иммунологической инсулинорезистентнос­тью – антитела вырабатываются к экзогенному инсулину. У больных с впервые выявленным диабетом антитела вырабатываются к собственному инсулину [41].

Аутоантитела к транспортеру цинка (ZnT8)

Недавно идентифицированы новые антитела, возникающие при СД1, – к транспортеру цинка (ZnT8) (рис. 1). ZnT8 – белок секреторных гранул β-клеток [42]. Аутоантитела к ZnT8 служат дополнительным маркером аутоиммунного диабета, часто сочетаются с IAA, GAD и IA-2. Считают, что инсулин хранится в везикулах с расположенными по краям ионами цинка, которые высвобождаются вместе с инсулином, под влиянием повышения гликемии.

Антитела к ZnT8 были обнаружены благодаря работам Wenzlau J.M. и коллег, которые исследовали РНК β-клеток человека и NOD мышей. Авторы обследовали 223 пациента с впервые выявленным СД1. У 62,3% пациентов в дебюте были обнаружены антитела к ZnT8, в то время как в контрольной группе они определялись лишь у 2%. У 26% имевших антитела к ZnT8 других маркеров аутоиммунного процесса выявлено не было [43].

Другое исследование было проведено с участием 193 пациентов с LADA, имевших антитела к GAD или IА-2, и 1056 пациентов с СД2, в сыворотке которых антител обнаружено не было. В результате антитела к ZnT8 были обнаружены у 18,6% пациентов с диабетом LADA против 1,4% пациентов с СД2. Кроме того, установлена взаимосвязь между наличием аутоантител к ZnT8 и более молодым возрастом, а также высоким титром аутоантител к GAD (рис. 2). Определение антител к GAD, IA-2 и ZnT8 позволило выявить фенотип с более ранним дебютом диабета и более выраженной инсулиновой недостаточностью (более высокая гликемия натощак, высокий показатель гликированного гемоглобина) у пациентов со всеми тремя маркерами. Эти показатели снижались соответственно убыванию количества видов антител и были минимальны у лиц, антитела у которых не определялись. Таким образом, наличие антител к ZnT8 позволяет определить выраженность инсулиновой недостаточности и точнее спрогнозировать течение заболевания [44].

Имеются данные о роли однонуклеотидного полиморфизма в молекуле ZnT8, увеличивающего риск развития СД2. Однонуклеотидный полиморфизм аминокислоты 325 в молекуле ZnT8 (С-аллель или Т-аллель определяют аргинин (Арг) или триптофан (Трп), соответственно, в положении 325) исследовали при CД2. Установлено, что С-аллель, кодирующая Арг в положении 325, ассоциирована с меньшим риском развития заболевания, более высокой чувствительностью к инсулину, повышенным соотношением проинсулин/инсулин, сниженным инсулиновым ответом во время внутривенного теста на толерантность к глюкозе у пациентов без диабета, имеющих родственников с СД2. Также была исследована связь однонуклеотидного полиморфизма ZnT8 и СД1.

Было выявлено, что у пациентов с СД1 аутоиммунный ответ был различным в зависимости от вида аллели, кодирующей соответственно Арг или Трп. При исследовании 351 пациента с СД1 97% оказались носителями С-аллели, кодирующей Арг, они имели АТ к ZnT8, cпецифичные к ZnT8 325Arg, а 100% носителей Т-аллели, кодирующей Трп, имели АТ к 325Trp. Это свидетельствует о том, что гуморальный иммунитет при СД1 против ZnT8 направлен против собственных клеток и противоречит гипотезе, согласно которой аутоиммунитет против ZnT8 может быть результатом молекулярной мимикрии [45].

Опубликованы результаты еще одного исследования, подтверждающие роль АТ к ZnT8 и гена, кодирующего ZnT8, – SLC30A8 (Solute carrier family 30 (zinc transporter), member 8 – семейство растворенных носителей (транспортера цинка) 8) в патогенезе СД1. Целью исследования было определение значения антител к ZnT8 и гена, кодирующего ZnT8, в оценке риска возникновения СД1.

Чтобы определить значимость AT к ZnT8 как дополнительного маркера СД1 и полиморфизма SLC30A8 как дополнительного фактора, определяющего риск развития СД1, было проведено проспективное когортное многоцентровое исследование BABYDIAB. Исследование проводилось в Германии на выборке детей, наблюдаемых с рождения до юности, и включало измерение антител и определение генотипа. Основная задача исследования сводилась к установлению роли антител в развитии СД1 у детей, родители которых больны СД. Было исследовано 1633 ребенка. У 1170 детей был исследован генотип на наличие однонуклеотидного полиморфизма гена ZnT8. Антитела против ZnT8 были обнаружены у 58 детей в возрасте 9 мес и позже (в среднем в 3 года). Они были выявлены у 55 из 128 (43%) детей, имевших аутоантитела к инсулину, GAD и/или IA-2 и у 34 из 42 (81%) детей, у которых впоследствии развился диабет. Дополнительное присутствие аутоантител к ZnT8 увеличивало риск развития СД1 у детей с антителами к ICA. Исследование показало, что ген SLC30A8 оказывает мощное влияние на формирование аутоантител к ZnT8 и значительно повышает риск развития диабета у ZnT8 позитивных детей.

Установлено также влияние гена SLC30A8 на предрасположенность к CД2. Предварительные данные по СД1 предполагают влияние этого гена на возраст дебюта заболевания [46].

Антитела, обнаруживаемые в 9 месячном возрасте, сохранялись и к двум годам. В 2 года антитела появились у 11% детей, у 3,5% детей обнаруживали более одного вида антител. Чаще всего выявляли IAA, они же были первыми антителами, появляющимися в кровотоке. Общий риск развития СД1 в течение 5 лет составил 1,8%, в то время как при наличии к 2 годам более одного вида антител этот показатель достигал 50%.

Для улучшения определения аутоантител был создан особый белок IA-2-ZnT8WR, включающий в себя 2 основных антигена, – IA-2 и ZnT8. При создании такого искусственного полиантигена учтен однонуклеотидный полиморфизм ZnT8; в итоге IA-2-ZnT8WR содержит молекулы ZnT8 как с Арг, так и с Трп в положении 325. С помощью данного искусственного антигена было исследовано 284 пациента с впервые выявленным диабетом, 10 пациентов с нарушением толерантности к глюкозе (НТГ) и/или повышением гликемии натощак (ПГН) и 110 человек из группы контроля с целью обнаружения у них соответствующих типов аутоантител. Отдельно для сравнения было проведено определение антител стандартными методами (отдельно с молекулами IA-2, ZnT8-R and ZnT8-W). В результате исследования установлено, что новый искусственный полиантиген IA2-ZnT8WR позволяет обнаружить антитела к IA-2 и основным формам ZnT8 с чувствительностью и специфичностью 100%. Было получено полное соответствие результатов при исследовании с тройной молекулой и при отдельном исследовании каждого из типов антител. Таким образом, использование подобных полиантигенов значительно повышает эффективность диагностики и делает ее более экономически выгодной [47].

Определение антител в периферической крови важно для выявления в популяции лиц, предрасположенных к развитию СД, и родственников больных СД1, имеющих генетическую предрасположенность к данному заболеванию. Для отбора лиц с высоким риском развития СД1 также необходимо проведение генетических (типирование локусов HLA DRB1, DQA1, DQB1) и метаболических (HbА1c, утрата первой фазы секреции инсулина после внутривенного теста на толерантность к глюкозе) тестов. Подобные исследования позволяют с наибольшей достоверностью проводить медико-генетическое консультирование в отношении риска развития СД у обследуемых и членов их семьи, а также дают возможность проводить профилактику СД1 и выявлять заболевание на самых ранних стадиях.