Роль Th1/Th2 дисбаланса иммунного ответа в детерминации клинических особенностей аутоиммунного сахарного диабета взрослых

В настоящее время отмечается неуклонный рост заболеваемости сахарным диабетом (СД) во всех возрастных и этнических группах. Прогнозируемое увеличение распространенности СД среди лиц в возрасте от 20 до 44 лет к 2030 г. до 60 млн человек приведет к катастрофическим последствиям [1]. Этот возрастной интервал является интересным с эпидемиологической точки зрения, поскольку заболеваемость СД 1 типа (СД1) находится еще на довольно высоком уровне, а заболеваемость СД 2 типа (СД2), резко нарастая к 30 годам, сравнивается с заболеваемостью СД1 [2].

Среди пациентов с СД в данном возрастном диапазоне обозначилась особая группа больных латентным аутоиммунным диабетом взрослых – latent autoimmune diabetes mellitus in adults (LADA) [3, 4]. К моменту постановки диагноза СД у пациентов с LADA, как правило, сохраняется значительный уровень остаточной секреции инсулина. Исследование DCCT (1993) свидетельствует, что при аутоиммунном СД даже минимальная остаточная секреция С-пептида ассоциирована с лучшим метаболическим контролем [5, 6, 7]. Следовательно, группа больных с LADA представляет особый интерес для исследователей как модель для оценки эффективности терапевтических вмешательств с целью предупреждения снижения уровня эндогенного инсулина.

Известно, что морфологическим субстратом СД1 является воспаление, локализующееся в островке Лангерганса и приводящее к дисфункции и гибели β-клеток. Это воспаление имеет аутоиммунный характер (аутоиммунный инсулит, АИ) и вызывает гибель β-клеток как путем некроза, так и апоптоза [8, 9]. Т-лимфоциты играют важную роль в инициации и дальнейшем развитии аутоиммунного процесса [10]. При этом основная роль принадлежит CD8-лимфоцитам (цитотоксическим) и CD4‑лимфоцитам, преимущественно Th1‑профиля [11].

Цитокины играют принципиальную роль в индукции и поддержании иммунологической толерантности. Имеющиеся в литературе данные позволяют считать, что медленное повреждение β-клеток при LADA не является случайным, а отражает патогенетические особенности функционирования Т-звена иммунитета, отличные от механизмов развития классического СД1 [12]. Вклад каждого компонента цитокиновой сети в сохранение иммунологической толерантности к клеткам островкового аппарата поджелудочной железы и его повреждение остается до конца не выясненным. Исследование цитокинового дисбаланса при СД аутоиммунного генеза и его связи с клинико-метаболическими нарушениями представляет не только научный, но и практический интерес.

Цель работы – установить закономерности Th1/Th2-поля­ри­зации иммунного ответа у больных LADA и ее роль в реализации клинического фенотипа заболевания.

Материал и методы

В исследование было включено 70 пациентов (37 женщин и 33 мужчины) в возрасте от 21 до 61 года (средний возраст – 41,3±1,0 г.). Диагноз сахарного диабета устанавливался на основании критериев ВОЗ (1999 г.).

Группу больных с СД1 составили 13 человек (4 женщины и 9 мужчин); средний возраст – 34,6±7,2 г. Диагноз СД1 устанавливался на основании развития кетоацидоза в течение первых 6 мес от начала заболевания, персистирующей потребности в инсулинотерапии после ликвидации кетоза и достижения метаболической компенсации.

В группу пациентов СД2 входили 57 человек (32 женщины и 25 мужчин), средний возраст – 43,6±7,6 г. Заболевание характеризовалось постепенным началом без развития кетоацидоза; отсутствовала потребность в инсулинотерапии после ликвидации кетоза и для достижения метаболической компенсации как минимум в течение 6 мес после манифестации диабета. Среди этих пациентов, согласно критериям P. Zimmet [13], были отобраны пациенты с подозрением на LADA – 27 человек (17 женщин и 10 мужчин), средний возраст – 41,2±1,6 г. В качестве клинических критериев диагноза LADA использовались: манифестация в возрасте от 30 до 50 лет без развития кетоацидоза, индекс массы тела (ИМТ) менее 25 кг/м2, отсутствие признаков метаболического синдрома, наличие личного и семейного анамнеза аутоиммунных заболеваний. В качестве косвенного лабораторного маркера LADA считали отсутствие гиперинсулинемии натощак и/или отсутствие прироста секреторной реакции β-клеток на 120-й мин. стандартного теста толерантности к глюкозе (ТТГ).

Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром натощак.

Определение присутствия в сыворотке у больных аутоантител к декарбоксилазе глутаминовой кислоты (GAD65), к клеткам островков Лангерганса (ICA) и к инсулину (IAA) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Biomerica» (Германия) для GAD и ICA; «Orgentec» (Германия) для IAA). Определение С-пептида в сыворотке у больных, полученной утром натощак и на 120-й мин ТТГ, проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой производителем тест-системы («AccuBind», США). Учет результатов иммуноферментного анализа проводили с помощью фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 405 нм для GAD и ICA, 450 нм – для IAA и С-пептида. Концентрации GAD, IAA и С-пептида вычислялись автоматически по калибровочным кривым.

Мононуклеарные лейкоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Для получения супернатантов выделенные клетки ресуспендировали в полной питательной среде, стандартизируя их количество до 2,0×106/мл. Для стимуляции мононуклеарных лейкоцитов в пробы вносили фитогемагглютинин (ФГА) («Difco», Германия) (10 мкг на 1 мл) с дальнейшей инкубацией клеточных суспензий в течение 24 ч.

Определение спонтанного и ФГА-стимулированного уровней интерлейкинов-2, -4 и -10 (IL-2, IL-4, IL-10) в супернатантах клеточных культур проводили с использованием твердофазного иммуноферментного метода по инструкциям, предлагаемым производителями («ВекторБест», Новосибирск). Учет результатов иммуноферментного анализа осуществляли при длине волны 450 нм.

Все лица, участвующие в исследовании, подписали информированное согласие.

Результаты исследования обрабатывали с использованием пакета программ Statistica for Windows (2008 г., версия 8.0) и пакета программ Microsoft Exсel (2007 г.). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался менее 0,05.

Результаты и обсуждение

Основным лабораторным критерием LADA является наличие циркулирующих аутоантител (АТ) к b-клеткам панкреатических островков. После выполнения иммуноферментного анализа из группы пациентов с предварительным диагнозом СД2 была выделена подгруппа пациентов с LADA, у которых регистрировалось повышение титра аутоантител хотя бы одного типа (табл. 2).

Интересно отметить, что LADA был подтвержден серологически у 26% пациентов, у которых его подозревали на основании клинических критериев, и у 10% пациентов, не удовлетворяющих этим критериям. По нашим данным, чувствительность и специфичность клинических критериев LADA составили 70 и 57% соответственно (p<0,05). Это позволило сделать вывод, что клинические критерии, взятые изолированно, не позволяют достоверно различить LADA от СД2 (табл. 2). Обязательным для диагностики LADA является исследование лабораторных маркеров аутоиммунного процесса, направленного против β-клеток.

АТ хотя бы одного типа (GAD, ICA или IAA) выявлены у 24,3% пациентов среди всех больных СД (17/70). Причем, среди больных с клиническим фенотипом СД2 – у 18% (10/57). Это согласуется с данными литературы относительно доли LADA в структуре заболеваемости СД с клиническим фенотипом типа 2 [6]. Причем концентрация GAD- и ICA-АТ и процент АТ-положительных пациентов были выше у пациентов с LADA, а IAA – в группе с СД1 с классическим вариантом развития. Одновременно два типа аутоантител присутствовали у 17% (4/23) пациентов с аутоиммунным СД, без статистически значимых различий между группами LADA и СД1.

При анализе особенностей клинического течения диабета было отмечено, что ИМТ у больных LADA был достоверно ниже, чем при СД2. Тенденция к более низкому уровню триглицеридов в сыворотке крови были у больных LADA. Это отражает значение для развития СД2 метаболического синдрома, компонентами которого являются ожирение и дислипидемия. Также зарегистрировано, что дебют СД1 приходился на более ранний возраст, а длительность инсулинотерапии была достоверно больше, чем у пациентов с LADA (табл. 1, 3).

При анализе структуры и частоты микро- и макроангиопатий у пациентов с СД было отмечено преобладание в группе пациентов с СД2 частоты артериальной гипертензии. В группе с LADA чаще, в сравнении с группой СД2, регистрировался аутоиммунный тиреоидит (табл. 3).

Пациенты с LADA характеризовались достоверно более низким базальным уровнем С-пептида, чем пациенты с СД2. Отмечена тенденция к более низкой стимулированной секреции С-пептида при LADA по сравнению с пациентами с СД2, что отражает снижение секреторной способности β-клеток при их аутоиммунном повреждении.

Основную роль в аутоиммунном разрушении инсулинсинтезирующих клеток островков играют CD8+-лимфоциты, в то время как CD4+-лимфоциты имеют второстепенное значение [11]. CD4+-лимфоциты и макрофаги, привлеченные в островки, начинают активно синтезировать интерферон-гамма (IFN-γ), который определяет дальнейший характер аутоиммунных реакций в островках. Он привлекает антигенпрезентирующие клетки (АПК), которые участвуют в презентации антигена [14]. IFN-γ подавляет функцию клеток Th-2 типа, снижая тем самым выработку цитокинов, ответственных за активацию В-лимфоцитов [15]. На роль IFN-γ в качестве медиатора деструкции β-клеток указывает то, что подавление его синтеза защищает мышей линии NOD (линия мышей, склонных к развитию СД в отсутствие ожирения, None-Obese Diabetic Mice) от развития аутоиммунного инсулита [16, 17].

IFN-γ относится к плейотропным провоспалительным цитокинам Th1-профиля. В эксперименте на животных, изолированных островках Лангерганса человека и грызунов было показано, что IFN-γ обладает выраженным цитотоксическим действием на инсулинпродуцирующие клетки, особенно – при совместном его применении с IL-1 или TNF-α [18, 19, 20, 21].

Некоторые авторы [22, 23] сообщают о сниженном уровне продукции IFN-γ мононуклеарными лейкоцитами крови (особенно CD3+клетками) после их стимуляции митогенами у больных с впервые выявленным СД1 и АТ-положительных пациентов. При проточно-цитометрическом определении интрацеллюлярного содержания IFN-γ в CD4+- и CD8+-лимфоцитах у больных СД1 было обнаружено значительное уменьшение количества клеток, содержащих IFN-γ по сравнению с контролем и лицами из группы риска. Этот феномен объясняют двояко: как уходом CD4+- и CD8+-популяций лимфоцитов в очаг воспаления, так и тем, что сниженное образование IFN-γ в организме делает β-клетки более чувствительными к вирусным инфекциям, вызывающим их деструкцию [24].

В нашем исследовании отмечено повышение базальной продукции IFN-γ мононуклеарными лейкоцитами крови у всех пациентов с СД; достоверных различий между подгруппами пациентов с СД зарегистрировано не было. Митогенстимулированная продукция у всех пациентов с СД также достоверно отличалась от контрольных значений в сторону уменьшения, без существенных различий между подгруппами пациентов с разным фенотипом СД (табл. 4).

Известно, что повышение уровня IL-2 в периферической крови, а также его продукции мононуклеарными лейкоцитами крови регистрировалось у лиц, недавно заболевших СД1, а также у детей с нормогликемией из группы риска с отягощенной наследственностью [25], особенно – носителей АТ к антигенам β-клеток [26]. С другой стороны, имеются работы, в которых сообщается о снижении уровня IL-2 в крови и его продукции активированными мононуклеарными лейкоцитами у больных СД1 [27].

Проведенные нами исследования согласуются с работами той группы авторов, которые считают, что у большинства пациентов с аутоиммунным диабетом продукция IL-2 мононуклеарными лейкоцитами крови повышена, максимально – у пациентов с классическим течением СД1. У пациентов с СД2 отмечался инвертированный тип секреции IL-2, в отличие от  аутоиммунного диабета; различия были достоверны по сравнению с контролем (табл. 4).

Интерлейкин-4 (IL-4) – это ключевой цитокин профиля Th-2. Этот интерлейкин способствует формированию «толерантного Th-2-фенотипа», привлекая В-лимфоциты в качестве «непрофессиональных» антиген-представляющих клеток, которые стимулируют развитие анергии в большей мере, чем активации. Более того, IL-4 ингибирует освобождение активированными макрофагами провоспалительных молекул (интерлейкин-1, фактор некроза опухолей-α, интерлейкин-8, простагландин Е2 и др.). По данным литературы, IL-4 проявляет защитное действие при моделировании аутоиммунного диабета у грызунов [23]. Предварительная инкубация островковых клеток поджелудочной железы человека с IL-4 предотвращает апоптоз, вызываемый смесью IL-1+TNF-α+IFN-γ. Сведения относительно содержания этого цитокина в периферической крови у пациентов с СД1 и их сибсов, базальной и стимулированной ФГА продукции мононуклеарными лейкоцитами in vitro крайне противоречивы. Одни авторы определяли более низкий его уровень [28, 29], другие – не находили отличия от контрольной группы [30], третьи – отмечали даже его повышение в дебюте СД1 [25].

В проведенном нами исследовании отмечена тенденция к более высокой базальной продукции мононуклеарными лейкоцитами IL-4 у больных LADA и СД2 по сравнению с пациентами с СД1. ФГА-стимулированная продукция IL-4 при LADA и СД2 также достоверно выше, чем при СД1. Это, вероятно, отражает патогенетические особенности функционирования Т-звена иммунной системы при LADA, отличные от механизмов развития СД1 и определяющие медленное повреждение β-клеток при этом заболевании, что фенотипически приближает LADA к СД2.

Интерлейкин 10 – лимфокин с молекулярной массой около 19 кДа, продуцируемый Th-2 СD4+-клетками. Он тормозит пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, подавляет продукцию IFN-γ Th-1 СD4+-клетками, секрецию активированными макрофагами IL-1β, TNF, IL-6 и IFN-γ. В своем ингибирующем действии на клеточное звено иммунной системы IL-10 синергичен с IL-4 [31]. По данным литературы, большинство авторов считают IL-10 цитокином, оказывающим защитное действие в отношении развития СД1 [31, 32]. У больных с впервые выявленным СД1 отмечается значительное снижение его секреции мононуклеарными лейкоцитами крови [25, 30], в том числе, после введения адреналина.

При оценке базальной продукции IL-10 установлены достоверно более высокое его содержание в супернатантах у пациентов, страдающих LADA, затем – при СД2 и наименьшие – у больных СД1 (табл. 4).

Наиболее высокий уровень ФГА-стимулированной продукции IL-10 отмечался у пациентов, страдающих LADA и СД2, минимальные – у больных СД1. Высокий уровень базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-10 мононуклеарными лейкоцитами при LADA свидетельствует о повышении супрессорной активности мононуклеарных лейкоцитов, которая, возможно, имеет протективное значение в отношении аутоиммунной деструкции β-клеток и детерминирует постепенное развитие клинических симптомов инсулиновой недостаточности. Напротив, низкий уровень базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-10 при СД1 свидетельствует в пользу Th-1 поляризации иммунного ответа.

Заключение

Таким образом, обобщая данные литературы и результаты собственных исследований, можно прийти к заключению, что продукция различных видов цитокинов во многом определяет развитие и клинические особенности аутоиммунного СД. Цитокины Th1-типа активируют реакции клеточного иммунитета, т.е. цитотоксические и воспалительные реакции. Усиление реакций с участием цитокинов Th1-профиля приводит к возникновению органоспецифических аутоиммунных заболеваний. При таком условии развитие гуморального ответа является антагонистическим путем при аутоиммунном СД, подавляющим активность цитотоксических реакций со стороны Т-клеток в островках Лангерганса. Вследствие особенностей цитокинопосредованных клеточных взаимодействий при LADA потеря функциональной паренхимы и манифестация инсулиновой недостаточности развивается медленно, растягиваясь на годы. Вышеизложенное требует более активной и тщательной диагностической тактики с использованием иммунологических методов обследования в группе пациентов в старшей возрастной группе, где представлены различные патогенетические варианты СД.

Исследования выполнены при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины», ГК № 02.740.11.0311 и гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых «Молекулярные механизмы цитокин-опосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по Th1- или Th2-пути», ГК № 02.120.11.3842-МД.