Гаплотипический кластер генов десатуразы жирных кислот FADS1, FADS2 и сахарный диабет 2 типа у якутов

ОБОСНОВАНИЕ

По данным Международной диабетической федерации (IDF) на 2021 г., каждый 10-й взрослый человек в мире страдает сахарным диабетом (СД), из которых 90% болеют сахарным диабетом 2 типа (СД2) [1]. В России на начало 2023 г. общая численность больных, состоящих на диспансерном учете с диагнозом СД2, — более 4,5 млн человек. По Республике Саха (Якутия) на начало 2023 г. количество больных, состоящих на диспансерном учете по СД2 во всех возрастных группах, — более 25 тысяч человек, что составляет 2535 на 100 тыс. населения [2]. Возможно, число страдающих СД2 гораздо выше, так как СД2 часто протекает бессимптомно и может оставаться недиагностированным в течение многих лет. Ogurtsova K с соавт. (2022 г.) при анализе 215 стран и регионов по распространенности не диагностированного СД установили, что в 2021 г. почти каждый 2-й взрослый с диабетом не знал о том, что болен [3].

В развитии СД2 основную роль играет неправильное питание и малоподвижный образ жизни, а также наследственная отягощенность, которая увеличивает риск его развития в 1,5–3 раза [4].

В клинических рекомендациях Американской ассоциации клинической эндокринологии в лечении пациентов с предиабетом и СД2 особое внимание уделяется изменению образа жизни, включающему физическую активность, регулярные физические упражнения, а также рекомендации по питанию, предназначенные для улучшения профилей глюкозы, липидов и поддержания здорового веса. Для лиц со стойко повышенным уровнем триглицеридов натощак рекомендуется лечение с помощью диеты с очень низким содержанием жиров и высокими дозами омега-3-жирных кислот [5].

На уровни полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в крови влияет не только потребление их с пищей, а также их метаболизм с помощью ферментов десатуразы, кодируемыми генами десатуразы жирных кислот 1 (FADS1) и десатуразы жирных кислот 2 (FADS2). Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) rs174537, расположенный в энхансере генов FADS1 и FADS2 у людей, тесно связан с метаболическим превращением линолевой кислоты в арахидоновую. Лица, гомозиготные по минорному аллелю Т rs174537, демонстрируют самую медленную конверсию пищевых ПНЖК, почти в два раза медленнее по сравнению с гомозиготными носителями основного аллеля G. Кроме того, носители генотипа ТT часто считаются дефицитными по длинноцепочечным ПНЖК, в отличие от носителей генотипа GG, которые имеют значительно более высокие уровни арахидоновой кислоты в крови и тканях [6]. SNP rs174546 гена FADS1 также тесно связан с концентрациями жирных кислот в плазме и с высоким неравновесием по сцеплению (LD) (r² >0,8) с другими вариантами в FADS1 [7]. SNP rs3834458 (T/del) расположен в промоторной области гена FADS2, носители минорного аллеля (Tdel+deldel) обладают более высокими уровнями линоленовой кислоты и более низкими уровнями эйкозапентаеновой, докозапентеновой и докозагексаеновой кислоты, по сравнению с теми, кто несет гомозиготу основного аллеля T [8].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования было изучение связи генов FADS1, FADS2 с СД2 у якутов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Набор пациентов и постановка диагноза проводились в эндокринологическом отделении Республиканской больницы №2 Государственного бюджетного учреждения «Центр экстренной медицинской помощи» (ГБУ РБ№2 «ЦЭМП»). Для контрольной выборки группы сравнения использованы образцы ДНК из коллекции биоматериала ЯНЦ КМП с использованием УНУ «Геном Якутии» (рег.№USU_507512). Генетическое исследование и биоинформационная обработка данных проведены в лаборатории наследственной патологии отдела молекулярной генетики Якутского научного центра комплексных медицинских проблем (ЯНЦ КМП).

Время исследования. В исследование включены пациенты и контрольная группа, подписавшие информированное согласие на проведение генетических исследований с января 2018 по декабрь 2023 гг.

Изучаемые популяции

Всего протестирован 541 человек якутской национальности, этническая принадлежность учитывалась до третьего поколения. В первую группу вошли пациенты эндокринологического отделения Республиканской больницы №2 с установленным диагнозом «Сахарный диабет 2 типа» (n=95). Во вторую группу для сравнения были отобраны образцы ДНК 446 добровольцев без хронических заболеваний из коллекции биоматериала ЯНЦ КМП.

Анализ в подгруппах

Группа здоровых якутов (n=446) была разделена на подгруппы по показателям индекса массы тела (ИМТ) на 3 подгруппы. В 1-ю подгруппу вошли пациенты с нормальным ИМТ (от 18,0 до 24,9 кг/м²) в количестве 160 человек, во 2-ю — с высоким ИМТ (предожирение — от 25 до 29,9 кг/м²) и в 3-ю подгруппу вошли пациенты с ожирением (n=185, ИМТ>30 кг/м²).

Дизайн исследования

Одноцентровое сравнительное исследование.

Методы

Генетическое исследование

Выделение геномной ДНК проводили из цельной крови коммерческим набором для выделения ДНК Newteryx (г. Якутск, Россия).

Условия полимеразной цепной реакции (ПЦР), прямые и обратные праймеры, температуры отжига и эндонуклеазы рестрикции приведены в табл. 1.

Определение генотипов проводилось анализом размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза на 4% агарозном геле с бромистым этидием в стандартном трис-ацетатном буфере при 120 В в течение 1 часа.

Статистический анализ

Достоверность различий в частотах аллелей и генотипов между группами рассчитывалась с использованием критерия хи-квадрат (χ²) с поправкой Иейтса. Отношения шансов (OШ) и соответствующий 95% ДИ были рассчитаны для оценки силы ассоциации SNP генов FADS1 и FADS2 с использованием IBM SPSS Statistics и вероятности менее 0,05 были приняты как значимые. Анализ неравновесия по сцеплению 3 SNP изучали путем попарного сравнения r² и D с использованием программного обеспечения Haploview (версия 4.2; Broad Institute, Кембридж, Массачусетс, США) [9] и пакетом программ «Office Microsoft, Excel 2010».

Этическая экспертиза

Протокол исследования одобрен локальным комитетом по биомедицинской этике при ЯНЦ КМП (протокол №60 от 10 апреля 2024 г. Решение 2). Все участники подписали информированное добровольное согласие перед включением в исследование.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы исследовали вариабельность генов FADS1 и FADS2 с помощью трех однонуклеотидных полиморфизмов rs174537, rs174546 и rs3834458. Анализ распределения аллелей полиморфизмов rs174537, rs174546 и rs3834458 показал преобладание предковых аллелей по двум SNP (rs174537, 72,8–78,1%; rs174546, 71,3–78,1%) и по третьему SNP (rs3834458, 72,8–77,5%) высокую частоту мутантного аллеля (делеция) во всех исследованных группах (табл. 2). Частота аллелей исследованных полиморфизмов существенно не отличается от восточно-азиатских популяций и некоторых американских, представленных в проекте «1000 Genomes» [10]. Распределение генотипов для каждого SNP не отклонялось от равновесия Харди-Вайнберга (p>0,05). Анализ силы связи аллелей и генотипов посредством расчета «отношения шансов» у пациентов с СД2 с подгруппами здоровых лиц не показал статистически значимые значения (табл. 3).

В связи с тем, что обозначение предковой и производной гаплогруппы частично определяется генотипом SNP rs174537, а также чтобы показать генетические отношения между тестируемыми SNP, был проведен анализ парного неравновесия сцепления и оценки гаплотипов по 3 SNP (rs174537, rs174546 и rs3834458) в генах FADS1 и FADS2. Гаплотипы были построены с использованием данных генотипирования полученных в настоящей работе. Паттерны неравновесия по сцеплению (LD) для комбинаций из 3 SNP показаны в таблице 3. Всего в нашей исследованной выборке якутов найдено 7 гаплотипов по трем SNP генов FADS. В расчет брались гаплотипы, встречающиеся с частотой не менее 0,1%. Наибольшее количество гаплотипов идентифицировано в группе здоровых, наименьшее — в группе больных СД2. В подгруппах здоровых наименьшее количество гаплотипов у лиц с предожирением.

Найденные гаплотипы мы условно разделили на частые и редкие. Частые два гаплотипа отмечены в табл. 3 как гаплотип №1 (TTd) и №2 (GGT). В общей сумме частые гаплотипы составляют 96,8% в группе больных СД2 и 98,6% в группе здоровых (табл. 4).

Результаты по частотам различных вариантов исследуемых SNP данного исследования были сопоставлены с данными проекта «1000 genomes» и выявило следующее: частый у якутов гаплотип TTd соизмеримо высокой частотой встречается у народности кинь из Вьетнама (81,3%), с одинаковой частотой — у китайской народности дай и у перуанцев — 78%, также высокая частота у мексиканцев — 68,7%. Реже всего встречается у кенийцев с частотой 2%. Гаплотип №2 чаще всего встречается у африканцев и индусов (89–96%). Гаплотип №2 у китайцев дай — 21,5%, кинь — 18,2%, перуанцев — 18,8% и мексиканцев — 30,5%, что сопоставимо с частотой у якутов — 23,9%. Редкие гаплотипы, к которым относятся № 3, 4, 5, 6, 7 найдены во всех группах и подгруппах с разной частотой. В группе больных СД2 (ГД) встречается только один редкий гаплотип 3 с высокой частотой 3,2%. У здоровых якутов редкий гаплотип №3 встречается только в подгруппе с нормальным ИМТ (ПЗН, 0,6%) вместе с гаплотипами №5 и №6 (0,9%). В подгруппе с предожирением (ПЗВ) найден один редкий гаплотип №4 (1,5%). В подгруппе с ожирением (ПЗО) присутствуют два редких гаплотипа, это №4 (0,3%) и №7 (0,3%), эти варианты не встречаются в группе больных СД2 и в подгруппе с нормальным ИМТ. Таким образом, редкие гаплотипы №4 (0,3%) и №7 (0,3%) выявлены только у якутов с ожирением и не болеющих СД2 (ПЗО). Гаплотип №7 не найден в других популяциях из проекта «1000 геномов». Частота редких гаплотипов представлена табл. 4, из которых выше частота только у гаплотипа №3 в перуанской популяции. Редкий гаплотип 8 (GGd) присутствует только в выборке японцев (0,5%).

Анализ силы связи гаплотипов с СД2 посредством расчета отношения шансов, относительной меры риска носительства конкретного гаплотипа показал достоверную статистическую связь редкого гаплотипа №3 (ТТТ) с СД2 у якутов (ОШ=14,5 ДИ (1,49–141,1)).

ОБСУЖДЕНИЕ

Многочисленные исследования свидетельствуют о связи между ПНЖК и риском развития СД2 [11][12]. В этом исследовании генов FADS мы обнаружили у якутов преобладание предковых аллелей по сравнению с европейскими популяциями. По мнению многих исследователей, преобладание различных генетических вариантов генов FADS1 / FASD2 в различных популяциях — следствие адаптации к изменениям в рационе с целью достижения наивысших концентраций длинно-цепочечных ПНЖК (ДЦ ПНЖК) [13][14]. В исследованиях Мэттью Т. Бакли с соавт. в 2017 г. показали, что гены FADS являются мишенью естественного отбора, и пришли к выводу, что в Европе отбор отдал предпочтение аллелям с улучшенной способностью метаболизировать ДЦ ПНЖК в связи с преобладанием в рационе продуктов растительного происхождения [15]. Исследователи Дэниел Н. Харрис с соавт. в 2019 г. предположили, что предковая гаплогруппа может быть связана с адаптацией к холодному климату как реакция на диетические ограничения [16].

Исследования связи генов FADS1 / FASD2 с СД2 в различных популяциях показывают противоречивые результаты. В исследовании пациентов больницы Чжуннань Уханьского университета Сэй Вэй Ли и соавт. (2016 г.) установили связь генотипа GG полиморфизма rs174537 с риском развития СД2 и ишемической болезни сердца, а в исследовании, проведенном в Польше у женщин в постменопаузе с метаболическим синдромом, Агата Музик и соавт. (2020 г.) установили, что носители аллели Т полиморфизма rs174546 (FADS1) и делеции в гене FADS2 (rs3834458) были связаны с неблагоприятным статусом жирных кислот, способствующим развитию метаболического синдрома [17][18]. В проведенном нами исследовании распределение частоты аллелей и генотипов и анализ силы связи у пациентов с СД2, с подгруппами без СД не показал статистически значимые значения. Противоречивые результаты во взаимосвязи с аллелями и генотипами генов FADS1 / FASD2 скорее всего связаны с различием в рационах и указывают на более значимый вклад соотношения ω-3 и ω-6 ПНЖК в развитие данных забоолеваний. Возможно, высокая частота предковых аллелей в популяции якутов связана с прошлым преобладанием в рационе пищи высокого содержания ω-3 ПНЖК. Происходящие в настоящем изменения рациона в сторону преобладания растительных продуктов снижают концентрацию ω-3 ПНЖК и одновременно повышают уровень ω-6 ПНЖК, что в свою очередь влияет на различные метаболические показатели в организме. Пищевые ПНЖК метаболизируются преимущественно в печени и могут оказывать непосредственное влияние на возникновение неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которое связано с повышенным риском развития СД2 [19]. В обзорном исследовании метаболизма липидов и метаболических нарушений в популяции якутов Сивцевой Т.М. и соавт. (2021 г.) установлено, что у якутов благоприятные показатели липидного обмена и характеризуются высоким содержанием холестерина, липопротеидов высокой плотности, низкого содержания триглицеридов и значений индекса атерогенности плазмы крови. Они предполагают, что основным патологическим фактором развития нарушения обмена веществ среди коренных жителей является абдоминальный тип ожирения [20]. Показатели липидного профиля, возможно, связаны с высокой частотой встречаемости среди якутов негативной аллели G полиморфизма rs738409 гена PNPLA3 [21], который ассоциируется со снижением уровня холестерина и триглицеридов в плазме крови, и накоплением липидов в печени, приводящий к НАЖБП [22][23].

Наше наблюдение блока неравновесия по сцеплению, охватывающего ген FADS1 и прилегающую часть гена FADS2, соответствовало предыдущим результатам нескольких популяционных исследований [11][16][17]. Основным результатом нашего исследования стала статистически значимая связь редкого гаплотипа ТТТ (3,2%) с СД2 у якутов (р=0,018). Учеными из Чехии Алешем Жаком с соавт. установлены значимые ассоциации генотипов SNP (rs174537, rs174545 и rs174546; p<0,01), SNP (rs174570 и 174602, p<0,05) и двух предполагаемых гаплотипов (GGGCC ( p<0,01) и TCACT ( p<0,05)) с расщеплением метаболического синдрома на два фенотипа (MetS1 и MetS2), из которых первый имел более вредный клинический и метаболический профиль, чем второй фенотип [11]. Мари С. Конвей с соавт. из Инновационного центра питания и здоровья в систематическом обзоре влияния генотипов SNP FADS на статус ПНЖК у беременных женщин, грудного молока и детей, установили, что в восьми проведенных исследованиях у беременных повышаются концентрации молекул — предшественников линолевой и альфа-линоленовой кислот у носителей предковых аллелей различных SNP FADS. Также они установили, что носители предковых аллелей гена FADS1 имели более низкую функциональность ферментов десатуразы [24]. В обсервационном когортном исследовании ассоциации между полиморфизмами FADS и весом установлено, что женщины, несущие хотя бы один предковый аллель SNP FADS1 и FADS2, были связаны с более высоким риском наличия ИМТ≥25, чем гомозиготы по мутантному аллелю [25].

Клиническая значимость результатов

Результаты данного исследования могут внести вклад в будущие исследования питания и диеты, в изучение влияния воздействия ПНЖК с пищей на эпигенетическую регуляцию биосинтеза и метаболизма ПНЖК. Несмотря на то, что в данном исследовании не было проведено биохимических исследований на уровни ДЦ ПНЖК, по результатам многочисленных зарубежных и отечественных исследований подтверждена прямая связь предковых аллелей по SNP rs174537, rs174546 и делеции rs3834458 с низкими уровнями n-3 ДЦ ПНЖК. Соответственно, потребление/добавка n-3 ДЦ ПНЖК среди якутской популяции может быть наиболее эффективна для снижения риска заболеваемости СД2 и НАЖБП.

Ограничения исследования

Основным ограничением этого исследования являлось то, что не были исследованы профили и соотношения жирных кислот для оценки потенциальных функциональных последствий генетических вариаций в кластере генов FADS.

Направления дальнейших исследований

Необходима дальнейшая работа для выяснения конкретных механизмов, с помощью которых кластер генов FADS и диета влияют на уровни ДЦ ПНЖК у людей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом в настоящем исследовании в популяции якутов установлена высокая частота предковых аллелей по SNP rs174537 (72,8–78,1%), по SNP rs174546 (71,3–78,1%) и по делеции rs3834458 (72,8–77,5%). Анализ силы связи аллелей и генотипов генов FADS1 / FASD2 с диабетом 2 типа не показал статистически значимые значения. Анализ парного неравновесия сцепления и оценки гаплотипов по исследованным полиморфизмам составил r²=0,93-1,00. Выявлена ассоциация гаплотипа ТТТ с СД2, который у больных встречался в 14,5 раза чаще.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках НИР «Изучение груза наследственной патологии и генофонда народов Республики Саха (Якутия)» № 122041800120-9 с использованием УНУ «Геном Якутии» №USU_507512.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Павлова Н.И. — концепция и дизайн исследования, лабораторные исследования, написание и редактирование текста, анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных; Крылов А.В. — набор материала, подготовка образцов, редактирование текста, лабораторные исследования; Бочуров А.А. — набор материала, подготовка образцов, редактирование текста, лабораторные исследования; Куртанов Х.А. — концепция и дизайн исследования, набор материала, редактирование текста, анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.