Терапия хронических трофических язв у больных сахарным диабетом с применением генных модификаций клеточного трансплантата

ВВЕДЕНИЕ. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ЯЗВЫ

Одним из основных осложнений сахарного диабета (СД) является нарушение регенерации ран; раны, которые не заживают в течение четырех недель, считаются хроническими и требуют дополнительного терапевтического вмешательства. Длительно незаживающие язвы стопы при диабете (ДЯС) представляют собой комплексную проблему при терапии из-за того, что существуют гипо- и гипергликемия, а также нарушения ангиогенеза и хроническая воспалительная реакция, связанная с началом СД. ДЯС наблюдаются по меньшей мере у 34% пациентов с СД [1]. Одним из ключевых аспектов лечения хронических ран, возникающих при СД, является изучение применения мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Клеточная терапия может способствовать как восстановлению функции поджелудочной железы, так и снижению уровня провоспалительных цитокинов. Это было продемонстрировано на моделях СД первого типа (СД1) у грызунов и показало, что введение МСК позволяет нормализовать уровень глюкозы и увеличивать выработку инсулина благодаря восстановлению островков Лангерганса поджелудочной железы. Источник МСК может быть аутологичным или аллогенным [2]. Клетки из обоих источников исследуют для терапии как без обработки — с минимальными манипуляциями, так и модифицированные генно-инженерными методами. Это особенно важно для стволовых клеток, полученных от пациентов с СД, так как было показано, что такие клетки обладают сниженными жизнеспособностью и пролиферативным потенциалом. За последние годы создано несколько технологий генной терапии на основе транзиторной трансфекции стволовых клеток жировой ткани и показано их преимущество для лечения ДЯС (табл. 1). На данный момент эффективность показана только в доклинических испытаниях на мышиных моделях.

Лечение ДЯС дополнительно осложняется другими факторами риска, такими как невропатия и заболевания периферических артерий. Гипо- и особенно гипергликемия, которая возникает при СД, способствует образованию язв за счет прогрессирования атеросклероза, нарушения работы популяций клеток кожи и периферической нейропатии [3]. Гипергликемия также нарушает белковый синтез, миграцию и пролиферацию кератиноцитов, фибробластов и поддерживает в ДЯС непрекращающийся воспалительный процесс, что может приводить к инфицированию стопы и увеличивает риск ампутации [4].

В настоящий момент для трансплантации МСК пациентам, кроме клеток костного мозга, применяется пул клеток жировой ткани МСК. Жировая ткань состоит из стромальной сосудистой фракции (SVF), которая содержит различные типы клеток и зрелых адипоцитов. До 3% выделенного из жировой ткани клеточного пула занимают МСК [5]. МСК под действием хемокинов и медиаторов воспаления мигрируют к очагу патологического процесса, ускоряя восстановление тканей. Благодаря таким свойствам МСК используются при системной красной волчанке, для восстановления хряща, функций почек и конечностей после ишемии, при заболеваниях легких, болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), инсульте, инфаркте, лечении онкологических заболеваний, а также при апластической или серповидно-клеточной анемии и других заболеваниях [6]. Список зарегистрированных препаратов представлен в табл. 2 [7][8].

МСК, выделенные из жировой ткани пациентов с диабетом, обладают сниженной пролиферацией и способностью к дифференцировке в фибробласты, а также быстрым апоптозом, что приводит к уменьшению терапевтического эффекта при их применении [9]. При хронических воспалительных процессах в организме снижена возможность распознавать и убивать патогенные клетки. Также нарушение иммунной защиты кожи возникает за счет подавления синтеза антимикробных пептидов при диабете [10]. Механизм действия МСК для заживления ДЯС может быть связан как с изменением контактов между клетками в ране, так и с паракринным эффектом [4].

Показано, что МСК обладают иммуномодулирующим действием на клетки кожи мышей с СД1. Используя совместную трансплантацию МСК с островками поджелудочной железы, авторы показали, что МСК способны снижать воспаление и усиливать терапевтический эффект трансплантата островков Лангерганса [11]. В присутствии МСК увеличивается пролиферативная активность дифференцированных фибробластов, повышается экспрессия факторов заживления ран и коллагеновых волокон первого и третьего типа. Использование стволовых клеток жировой ткани приводит не только к ускоренному заживлению, но и подавлению фиброза. Фиброз вызывается чрезмерным отложением компонентов внеклеточного матрикса (ECM — extracellular matrix), фибробластами и миофибробластами. Синтез и деградация матрикса регулируется активностью дермальных фибробластов, которые производят белки ЕСМ, такие как коллаген и их ингибиторы. Показано, что экспрессия на мембране фибробластов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), расположенных по краю раневой поверхности, играет существенную роль в ускорении процесса заживления. Этот фактор воздействует на клетки эндотелия при взаимодействии с рецепторами VEGFR 1, 2 и 3 типов. Он также увеличивает экспрессию фактора роста фибробластов (bFGF), полноразмерного VEGFR 2 и фактора роста тромбоцитов (PDGF), что способствует образованию новых кровеносных сосудов и заживлению ран [12]. Технология, направленная на транзиторное усиление экспрессии VEGF165 в МСК, прошла клинические испытания в России, в 2016 году [ NCT02538705], однако данные по ней пока не представлены. Терапия ГМ-МСК жировой ткани может быть лучшим решением для лечения ДЯС, чем немодифицированными клетками, поскольку эндогенные МСК у пациентов с СД имеют низкую жизнеспособность и нарушенную пролиферацию [9]. При этом если введение МСК связано с повышенным риском нецелевого homing (хоуминга), то при использовании ГМ-МСК при незаживающих кожных поражениях может быть безопасной и перспективной методикой. За последние годы создано несколько технологий генной терапии на основе транзиторной трансфекции стволовых клеток и показано их преимущество для лечения ДЯС (табл. 2). На данный момент эффективность показана только в доклинических испытаниях на мышиных моделях ДЯС. Источник МСК, их количество и качественные характеристики становятся важны для успеха трансплантации при измененном состоянии иммунной системы при диабете. Известно, что с увеличением возраста пациента пролиферативный потенциал мезенхимальных клеток жировой ткани не снижается [13], что делает эти клетки наиболее перспективными для использования. Выделение МСК из жировой ткани — метод с минимальным риском поражения донорского органа. Показано, что популяция МСК костного мозга у пациентов с диабетом критически уменьшается [14], поэтому МСК жировой ткани — основные кандидаты для временных генетических модификаций в целях терапии ДЯС.

К преимуществам аллогенного источника для трансплантации относят возможность выбрать донора (в том числе с оптимальным индексом массы тела (ИМТ), цитокиновым профилем и производством ангиогенных факторов и жизнеспособностью у трансплантата), возможность заранее отбирать и хранить данный материал. Недостатками данного источника клеток являются: потенциальная возможность реакции трансплантата против хозяина (РТПХ), передача латентных вирусов с материалом, необходимость тщательных и дорогостоящих исследований донорского материала.

Цитокиновый профиль, секретируемый МСК жировой ткани, может смещаться в сторону воспалительного фенотипа у пациентов с ожирением, а низкий ИМТ у доноров жировой ткани позволяет выделять клеточные фракции с оптимальной способностью к пролиферации и дифференцировке. Замораживание клеток изменяет экспрессию интерферона-γ (IFN-γ), из-за чего снижается их противовоспалительное терапевтическое действие [15]. Использование клеток, не подвергавшихся заморозке, не всегда возможно в клинической практике.

Очевидным достоинством аутологичного материла является его безопасность, аутологичная ткань для трансплантации не несет в себе многих терапевтических рисков [16]. Однако стволовые клетки могут активировать онкологические процессы из-за миграции в патологическую ткань, изменяя ее воспалительный фенотип — делая ее «невидимой» для иммунной системы и активизируя процессы ангиогенеза — за счет производимых факторов и микро-РНК. Микро-РНК влияют на фенотип стволовых клеток, контролируя профили экспрессии, пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток. Профили микро-РНК для различных типов тканей уникальны, поэтому местоположение жировой ткани, из которой выделяют клетки, влияет на эффективность трансплантации [17]. Выбор места забора донорной ткани, пол пациента, масса тела, возраст донора и контроль микро-РНК-статуса МСК жировой ткани важны для качества и количества получаемых стволовых клеток и играют ключевую роль в безопасности клеточной трансплантации.

ИММУНОМОДУЛИРОВАНИЕ И БЕЗОПАСНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МСК

Иммуномодулирующие и поддерживающие ангиогенез свойства МСК были описаны в ряде работ [10][11][17]. Эти клеточные популяции лишены человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), что дает возможность тестировать для применения в клинической практике разные источники МСК жировой ткани [18]. Тестируются аутологичный (собственные клетки пациента) и аллогенный (клетки донора) источники клеток жировой ткани. Считается, что МСК являются иммунопривилегированными или иммунодефицитными из-за отсутствия или крайне низкой экспрессии генов комплексов гистосовместимости (MHC) I и II типа. Однако повторные введения донорного материала показывают значительную реакцию воспаления сустава на аллогенные МСК, но не аутологичные МСК [17]. Цитокины, в частности IFN-γ и TNFα, определяют иммунный фенотип стволовых клеток, индуцируя пролиферацию и дифференцировку МСК (рис. 1, модифицировано по статье [18]).

Экспрессия белков MHC и иммуногенность аллогенного клеточного продукта изменяется провоспалительным IFN-γ. Интерфероны, в том числе IFN-γ, взаимодействуя с каскадом белков, регулирующих работу промоторов, отвечающих за экспрессию генов МНС-II, активируют связывание транскрипционного фактора IRF9 с регуляторной последовательностью ДНК, называемой элементом регуляторного ответа интерферона (ISRE), запуская экспрессию гена [19].

Интерлейкин-6 (IL-6) и моноцитарный колониестимулирующий фактор (M-CSF), которые продуцируют МСК, играют роль в дифференцировке дендритных клеток (ДК). Высокие уровни IL-6, которые секретируют МСК, способствуют дифференцировке ДК к миелоидному фенотипу. Простагландин второго типа (PGE2) способствует созреванию ДК, блокада синтеза PGE2 в МСК может вызывать снижение активности T-клеток. При ДЯС вырабатываются медиаторы воспаления, что приводит к привлечению Т-клеток и увеличению синтеза факторов воспаления, таких как TNF-α, хемокинов и их рецепторов, например, CC Motif Chemokine Receptor 4 (CCR4) на поверхности клеток в язве [20]. Экспрессия воспалительных хемокинов увеличивается в ответ на активацию TNF-α или IL-1β. В результате МСК мигрируют к месту воспаления, что осуществляется за счет градиента хемокинов SDF-1 и CX3CL, которые взаимодействуют напрямую с рецепторами CXCR4 или CX3CR1 на их мембране [21]. CXCR4 располагается поверхности клеток только у 3,9% МСК жировой ткани, при этом большая часть его содержится внутри клеток. Рецептор CXCR4, вероятно, перемещается на поверхность после стимуляции хемокинами, что способствует миграции МСК. Повышенная экспрессия рецептора CXCR4 определяет направление миграции МСК не только к ДЯС, но и к опухоли [22], помогая ее инвазии в строму. Блокировка ключевых факторов миграции, например, интегрина β1, и трансплантация непосредственно в патологический очаг, возможно, будет делать терапию более безопасной. Было показано снижение количества МСК в миокарде при блокаде интегрина β1, клетки вводились в кровоток. Интегрин α4/β1 может создавать прикрепление стволовых клеток к местам миграции и обеспечивать взаимодействие с клетками эндотелия сосудов и клеточным матриксом через рецептор VCAM-1, который связывается с интегринами α4β1, β1, α4β7 и фибронектином [23]. МСК взаимодействуют с клетками эндотелия благодаря интегринам α4, β1, VCAM-1, P-селектину и секреции цитокинов. Интегрины β1 и β2 играют важную роль в межклеточном взаимодействии клеток и адгезии с компонентами внеклеточного матрикса [24]. Одним из решений, помогающих избежать осложнений МСК-терапии, является локальное использование этих клеток вблизи места повреждения. Поскольку для восстановления кожного покрова основная масса трансплантированных клеток не должна попадать в кровоток, чтобы избежать нецелевой их миграции. Возможно, временная блокировка интегринов — перспективное средство для контроля локализации терапевтических МСК.

Повышенные титры некоторых гормонов — эстрогена, прогестерона, лептина — способствуют малигнизации тканей и запуску провоспалительных реакций [25]. Так, МСК, которые были получены из подкожной жировой ткани брюшной полости пациентов с ожирением, усиливали канцерогенез после совместного культивирования с лептином. Профиль экспрессии генов стволовых клеток демонстрировал изменения, вызванные ожирением. Блокирование сигналов эстрогена с помощью лептин-нейтрализующего антитела уменьшало негативное влияние клеток жировой ткани, полученных от пациентов с ожирением, которое вызывает значительные изменения в фенотипе клеточного трансплантата, усиливая канцерогенез через эстрогензависимые пути ER+/PR+ [25]. Кроме того, стволовые клетки способны подавлять рост трансформированных клеток, останавливая клеточный цикл, также ингибируя пролиферацию и блокируя путь PI3K/AKT [26]. МСК, трансплантированные в модели мыши с гепатоцеллюлярной карциномой, раком поджелудочной железы, раком простаты и меланомы подавляли рост опухоли [27]. Учитывая эти противоречивые данные, при трансплантации необходим контроль миграции и изменения фенотипа введенных МСК на уровне цитокинов, гормонов и микро-РНК.

ГМ-МСК ТЕСТИРУЮТСЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

Одной из первых работ, в которой использовали ГМ-МСК, было подавление ксенотрансплантата меланомы человека у мыши. Клетки с повышенной экспрессией интерферона-β (IFN-β) вводили в приживленную опухоль, что приводило к снижению скорости ее роста, а также двукратному повышению выживаемости мышей по сравнению с контрольной группой после проведения таких инъекций [28]. В мышиной модели ксенографта также продемонстрировано, что добавление низких доз цитостатика цисплатина к IFN-β-модифицированным МСК значительно усиливает эффективность противоопухолевой терапии [29].

На сегодняшний день выделен ряд генов, относящихся к опухолевым супрессорам, чьи генетические модификации исследуются для терапии ГМ-МСК. Одним из многообещающих терапевтических агентов является индуцирующий апоптоз цитокин — рецептор фактора некроза опухоли (TRAIL), который обнаружен на поверхности злокачественных клеток. В ГМ-МСК с повышенным синтезом TNF-α в сочетании с лучевым воздействием значительно возрастает уровень экспрессии TRAIL. Противоопухолевая эффективность подобных модифицированных клеток была описана для различных видов опухолей. Кроме того, показано, что модификации IFN-γ у ГМ-МСК уровень экспрессии TRAIL увеличен [30].

Для применения таких клеток необходимо проводить тестирование патологических тканей на наличие экспрессии Х-сцепленного ингибитора белка апоптоза (XIAP). Некоторые опухоли могут проявлять устойчивость к высоким уровням TRAIL, что связано с увеличенной экспрессией XIAP, способного снижать активность каспаз 3 и 9. Анти-апоптотические свойства XIAP регулируются другим активатором каспазы, получаемым из митохондрий (Smac), который предотвращает физическое взаимодействие между XIAP и каспазами, тем самым блокируя ингибирование апоптоза [31].

В качестве противоопухолевых агентов, кроме IFN-β и TRAIL, также рассматриваются интерлейкины IL-2, IL-12 и IL-21, так как они играют важную роль в регуляции воспалительных и иммунных реакций. IL-12-модифицированные ГМ-МСК способствуют снижению степени метастазирования и индуцируют апоптоз опухолевых клеток у мышей с гепатоцеллюлярной карциномой, раком легких и меланомой, активируя при этом цитотоксические Т-лимфоциты и NК-клетки [32]. Доказано, что введение ГМ-МСК, полученных из околоплодных вод и экспрессирующих IL-2, приводило к индукции апоптоза в клетках рака яичников у мышей. Кодируемый геном PTEN белок — фосфатаза и гомолог тензина PTEN (phosphatase and tensin homolog) — представляет собой один из основных опухолевых супрессоров у человека. Показано, что стволовые клетки суперэкспрессирующие белок PTEN могут трансформироваться в клетки глиобластомы in vivo [33].

Транспорт белка с помощью стволовых клеток к местам повреждения и их противоопухолевые свойства описаны для таких белков, как IFN-α, IFN-γ, CX3CL1, апоптин, PEGF и микро-РНК - miR124 и miR145. Модификация стволовых клеток для одновременной экспрессии нескольких терапевтических белков может повысить их противоопухолевый потенциал. Было показано, что TRAIL и модифицированные тимидинкиназой вируса простого герпеса (HSV-TK) МСК значительно снижают скорость роста опухоли и увеличивают выживаемость мышей со злокачественной глиобластомой [34].

РАЗРАБАТЫВАЕМЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МОДИФИКАЦИЙ АУТОЛОГИЧНЫХ МСК ЖИРОВОЙ ТКАНИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ДЯС

Генные модификации клеток могут быть постоянные и временные. Для каждого типа модификаций критерии безопасности продукта на основе ГМ-МСК отличаются. Стабильно измененные клетки должны быть получены из моноклона, т.е. быть потомством одной модифицированной клетки, так как в таком случае, после генного анализа линии, будет известно, куда встроились инженерные конструкции и сколько их, насколько генетически стабильна линия, не становится ли клетка патогенной из-за инсерционного мутагенеза. При таком типе модификаций сохранить тонкие биохимические настройки клеток сложно, так как и быстрое проникновение рекомбинантной ДНК с повреждением клеточной стенки электропорацией, и длительные процессы культивирования, и встройки в геном будут способствовать проявлению воспалительного фенотипа клеток. Транзиторная (временная) модификация ДНК возможна при использовании генных каркасов, аденоассоциированных вирусов, фагоцитозу фрагментов ДНК/РНК. Такое изменение сохраняется в клетке несколько дней — пока рекомбинантные нуклеиновые кислоты не уничтожатся клеточными нуклеазами, при этом инженерная кассета не встраивается в геном. Не создавая стабильных изменений, следовательно, избегая инсерционного мутагенеза, такая технология основана на защитных механизмах самих иммунных клеток, не меняет их биологических свойств на постоянной основе. Элиминация чужеродного генетического материала происходит на 3–5 сутки после поглощения.

Предложено несколько методов генетической модификации аутологичных МСК жировой ткани при лечении ДЯС на основе временной экспрессии ряда генов. Транзиторная сверхэкспрессия для восстановления терапевтического потенциала — увеличения пролиферации и жизнеспособности трансплантируемых клеток одного из генов — SDF-1α и MALAT1 [36], c-Jun [35], IL-7 [37], а также некоторых микро-РНК [38].

Ген С-Jun представляет собой основной элемент фактора транскрипции AP-1, который участвует в регуляции дифференцировки, миграции, пролиферации и апоптоза клеток, а также в звеньях воспалительных процессов и онкогенезе. Этот фактор также связан с метаболизмом EGF, что подчеркивает его важную роль в процессе заживления кожных ран. Клетки с повышенной экспрессией c-Jun демонстрируют более активную пролиферацию и продукцию факторов роста, что стимулирует заживление ран у крыс с диабетом по сравнению с контролем [35].

Действие гена SDF-1α для восстановления регенеративного потенциала МСК показало [38], что клетки несут конструкцию с повышенной экспрессией гена SDF-1α, активированного этим геном. SDF-1α действует как хемокин, рекрутируя клетки в месте раны и стимулируя ангиогенез [38]. Этот ген улучшает жизнеспособность МСК. Показано, что скаффолд, применяемый в ране в виде генного каркаса, активированного геном SDF-1α, усиливает ангиогенез, что способствует ускоренному заживлению раны.

Экспрессия VEGF — избыточная экспрессия MALAT1 — также оказывает сильное влияние на количество белка VEGF в клетке. MALAT1 производит полноразмерную некодирующую РНК, конкурентно ингибирует miR-205, которая при отсутствии механизмов подавления связывается с 3’ участком РНК гена VEGF и блокирует синтез белка. Оказалось, что трансплантация МСК, транзиторно экспрессирующих MALAT1, оказывает влияние не только на ускоренное заживление ран, но и стимулируют выживаемость бета-клеток поджелудочной железы у мышей [39].

Цитокин IL-7 выполняет значимую роль в процессах заживления ран, выступая в качестве фактора выживания для определенных видов клеток. В случае временного повышения экспрессии гена IL-7 в стволовых клетках усиливается экспрессия основных ангиогенных факторов, таких как: VEGF, фактор роста гепатоцитов [HGF], рецептора VEGF 1 и 2 типов. Было экспериментально подтверждено ускоренное заживление ДЯС при такой модификации [40].

Некоторые малые РНК, например, miR-205, miR-206, miR-130a-3p, являются прямыми регуляторами трансляции белка VEGF [39]. Снижение экспрессии miR-205 увеличивает количество белка VEGF, производимого стволовыми клетками, что облегчает лечение ДЯС. Внутриклеточная модуляция этих микро-РНК в МСК способствует репарации кожи и снижает проонкогенный риск.

Процессы ангиогенеза являются мишенью для малых РНК, таких как miR-205-5p, miR-23a-3p и miR-130a-3p, которые нацелены на большинство генов, связанных с этим. VEGF может усиленно экспрессироваться благодаря транзиторно увеличенной дозе гена регуляторной РНК в стволовой клетке. Такая регуляция VEGF может быть более безопасной, чем конститутивная сверхэкспрессия генов ангиогенеза, которая часто происходит в малигнизированных тканях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Заживление ДЯС при состояниях с измененным иммунным статусом (в т.ч. из-за изменения концентрации глюкозы в крови) в сочетании с хроническим воспалительным процессом, как при СД, — длительный процесс, который может закончиться ампутацией пораженной конечности или смертью из-за сепсиса. Рецидивы воспаления, вторичные инфекции в открытой ране, заживающей в течение нескольких месяцев, делают даже небольшие повреждения серьезным испытанием для иммунной системы организма.

Новые клеточные технологии помогают контролировать заживление ран, успешно разрабатываются для терапии хронических язв, возникающих зачастую при диабете. К таким клеточным технологиям относятся: увеличение жизнеспособности стволовых клеток за счет использования генного каркаса эпидермального фактора роста или SDF-1α, временной повышенной экспрессии генов Neurotrophin-3, c-Jun и IL-7, экспрессия гена MALAT1 для снижения активности микроРНК-205-5p. Такое свойство трансплантируемых клеток, как миграция к местам воспаления в организме, делает их незаменимым инструментом для переноса различных терапевтических агентов к местам патологического процесса. Для того чтобы использовать такие технологии в клинической практике, они должны быть максимально безопасны. Однако показано, что терапия стволовыми клетками имеет и побочные эффекты, которые могут усугубить хронические воспалительные процессы, часто возникающие как последствие диабета. Эти технологии находятся в процессе разработки и требуют валидации и оценки клинической эффективности перед применением. Следовательно, если введение МСК сопровождается временными генными модификациями, которые способны контролировать миграцию, жизнеспособность и паракринный эффект трансплантата, то это, несомненно, сделает клеточную терапию ДЯС более эффективной и безопасной.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Cтатья подготовлена на основании результатов, полученных в ходе реализации Соглашения о предоставлении гранта в форме субсидий из федерального бюджета на осуществление государственной поддержки создания и развития научных центров мирового уровня, выполняющих исследования и разработки по приоритетам научно-технологического развития от 20 апреля 2022 года № 075-15-2022-310.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов. Абакушина Е.В. — разработка концепции научной работы, анализ научной работы, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания; Воробьева И.Г. — написание статьи, подбор литературы по теме статьи; Степанова И.А. — анализ научной литературы; составление черновика рукописи; Румянцев С.А. — обработка результатов, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.