Экспрессионные маркеры скелетной мышцы человека, ассоциированные с нарушениями глюкозного метаболизма в базальном состоянии и после приема пищи

ВВЕДЕНИЕ

Ожирение — одна из основных причин развития социально-значимых хронических метаболических заболеваний, таких как метаболический синдром и сахарный диабет 2 типа (СД2). В России численность пациентов с СД2 растет и сегодня составляет около 3% населения [1]. Скелетные мышцы играют ключевую роль в углеводном обмене организма, так как даже в состоянии покоя их вклад в инсулин-зависимое потребление глюкозы составляет более 80% [2]. Это означает, что дисрегуляция инсулин-зависимого захвата глюкозы скелетной мускулатурой нарушает углеводный метаболизм в организме и может приводить к развитию ожирения и СД2.

Инсулинорезистентность скелетных мышц связывают главным образом с нарушением инсулин-зависимой сигнализации, регулирующей транслокацию транспортера глюкозы GLUT4 и постпрандиальный захват глюкозы из кровотока. Однако оказалось, что при ожирении и СД2 в скелетных мышцах в базальном состоянии (натощак) наблюдаются выраженные изменения в фосфорилировании множества сигнальных молекул, не входящих в канонический инсулиновый сигнальный каскад, а также ряда транскрипционных факторов [3], что хорошо согласуется с изменением транскрипционного профиля мышц пациентов [4–6]. Эти изменения могут быть вызваны изменением содержания инсулина, других гормонов и метаболитов в крови в базальном состоянии, а также чувствительности скелетных мышц к ним. Действительно, в ряде исследований были найдены значимые корреляции экспрессии генов в скелетной мышце натощак с уровнем инсулина в крови и некоторыми маркерами метаболических нарушений. Так, исследование транскриптома скелетных мышц людей с различным индексом массы тела выявило 180 значимых корреляций экспрессии генов с индексом инсулинорезистентности (HOMA-IR), включающих в том числе некоторые регуляторы липидного метаболизма и сигнального пути AKT-mTOR, регулирующего синтез и протеолиз белков, экспрессию генов и т.д. [7]. Помимо этого, метаанализ транскриптомных данных показал, что экспрессия гена инсулинового рецептора (INSR) и его субстрата (IRS2) отрицательно коррелируют с уровнем инсулина натощак в скелетной мышце людей с разным уровнем инсулиновой чувствительности [8].

С другой стороны, изменение базальной экспрессии генов скелетной мышцы может регулироваться изменением содержания инсулина и других веществ, вызываемыми регулярными приемами пищи. Действительно, в нескольких исследованиях было показано, что увеличение содержания инсулина в крови во время клэмп-теста (до 100 мЕд/л или ~0,6 нМ) через 3–4 ч изменяет экспрессию нескольких сотен генов в скелетной мышце здоровых людей [9][10]. Кроме этого, уже были найдены значимые ассоциации экспрессии генов в мышечной и жировой ткани с показателями обмена углеводов при стимуляции инсулином (клэмп-тест) [11]. Однако нужно заметить, что у здоровых людей, пациентов с ожирением без или с СД2 прирост инсулина и его абсолютный уровень во время повседневного приема пищи может значительно отличаться от условий клэмп-теста и между собой. Поэтому большой интерес представляют исследования, изучающие изменение показателей метаболизма глюкозы, а также экспрессии генов в скелетной мышце на прием пищи, нормированный на массу тела [12–14].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования — выявить экспрессионные маркеры (гены) скелетной мышцы человека, ассоциированные с нарушениями глюкозного метаболизма в базальном состоянии и после приема пищи, нормированной на массу тела.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Многоцентровое интервенционное проспективное сравнительное исследование.

Место и время проведения исследования

Организация исследования была описана нами ранее [15][16]. Исследования с пациентами проводили в ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ, 04.2022–05.2023 гг., а со здоровыми добровольцами в ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, 03.2022–09.2023 гг.

Изучаемые популяции

Характеристики добровольцев представлены в табл. 1. В исследовании участвовало 8 здоровых добровольцев (Н) (критерии включения: ИМТ<25 кг/м²; отсутствие диагностированного СД2), 8 пациентов с ожирением (Ob) (ИМТ>30 кг/м²; отсутствие диагностированного СД2) и 8 пациентов с ожирением и СД2 (T2D) (ИМТ>30 кг/м²; диагностированный СД2). Пациенты группы T2D находились на сахароснижающей терапии; прием препаратов был приостановлен за 1–2 дня (ингибиторы натрий-глюкозного котранспортера-2, ингибиторы дипептидилпептидазы-4, производные сульфонилмочевины, бигуанид [метформин]) и/или за 7 дней (агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 [семаглутид]) до теста со смешанной пищей.

Описание вмешательства

Все добровольцы прошли анкетирование (опросник SF-12 [17]) для субъективной оценки своих физических возможностей. Пробы венозной крови из v. cephalica брали утром натощак (09:00) и через 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин и 180 мин после приема пищевой смеси Resource 2.0 (Nestle Health Science, Франция, 3 мл или 6 ккал/кг массы тела, соотношение по энергоемкости белков: жиров: углеводов 1: 2,3:2,7 ккал/кг массы тела) (рис. 1А). Игольчатую биопсию брали из срединной части m. vastus lateralis под местной анестезией (2 мл 2% лидокаина), до и через час после приема пищи (вторая биопсия была взята на 10 см проксимальнее первой), как описано ранее [15][16].

Лабораторные методы исследования

Гликированный гемоглобин (HbA_1c) в цельной крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на анализаторе D10 (BioRad, США), уровень глюкозы в сыворотке определяли на автоматическом анализаторе Architect c8000 (Abbott Diagnostics, США); иммуннореактивный инсулин и С-пептид определяли в сыворотке крови на электрохемилюминесцентном анализаторе Cobas 6000 (Roche, Швейцария), как описано ранее [15][16].

Полногеномное секвенирование РНК и биоинформатическую обработку данных проводили как описано ранее [16]. Кратко тотальную РНК выделяли с помощью спин-колонок (набор RNeasy Mini Kit, Qiagen, Германия) и измеряли ее концентрацию (флуориметр Qubit 4 и набор Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Scientific, США). После оценки целостности РНК (RIN>7; капиллярный электрофорез на анализаторе TapeStation 4150 и набор High Sensitivity RNA ScreenTape, Agilent, Германия), цепь-специфичные библиотеки были приготовлены с помощью набора NEBNext Ultra II Directional RNA Library Preparation Kit (New England BioLabs, США) и затем секвенированы (75 нуклеотидов с одного конца, покрытие около 55 млн прочтений на образец) на анализаторе NextSeq 550 (Illumina, США).

Биоинформатические методы и статистический анализ

Прочтения РНК картировали на человеческий геном (первичная сборка GRCh38.p13), используя программу Hisat2 v.2.2.1. Количество уникально картированных прочтений для экзонов каждого гена рассчитывали с помощью пакета Rsubread (среда программирования R). Гены, изменившие экспрессию, определяли с помощью метода DESeq2 с коррекцией на множественное сравнение Бенжамина-Хохберга (p_adj<0,05; среда R), уровень экспрессии с помощью показателя TPM (программа kallisto, v0.46.2).

После удаления низкоэкспрессируемых генов (TPM<1) определяли корреляции между экспрессией белок-кодирующих генов и биохимическими показателями с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмана; для дальнейшего анализа использовали только сильные взаимосвязи: |ρ|>0,7 и р<0,001 (рис. 1Б, 3А).

Для биологической интерпретации корреляций между экспрессией генов в базальном состоянии и биохимическими показателями брали только те гены, экспрессия которых различалась более чем в 1,5 раза между здоровыми добровольцами и пациентами (тест DESeq2, p_adj<0,05) (рис. 1Б, 3Б).

Для биологической интерпретации корреляций между изменениями экспрессии генов после приема пищи и биохимическими показателями использовали только те гены, изменения экспрессии которых в ответ на прием пищи значимо различались более чем в 1,5 раза между здоровыми добровольцами и пациентами (тест Манна-Уитни, p<0,05).

Для оценки различий между выборками для биохимических показателей использовали однофакторный дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с коррекцией на множественное сравнение (тест Данна) при уровне значимости 0,05.

Классы белков определяли, используя базу данных KEGG BRITE.

Этическая экспертиза

Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено Комитетом по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН (№613 от 29 марта 2022 г.) и Локальным этическим комитетом ГНЦ ФГБУ«НМИЦ Эндокринологии» МЗ РФ (№4 от 14 февраля 2022 г.). Письменное информированное согласие было получено от всех добровольцев.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристики групп и тест со смешанной пищей

Пациенты с ожирением (Ob) и пациенты с ожирением и СД2 (T2D) отличались от здоровых (H) повышенным базальным уровнем инсулина и С-пептида, пациенты с ожирением и СД2 имели повышенный уровень глюкозы и HbA_1c (табл. 1). Как было описано нами ранее [15], динамика биохимических показателей отличалась у разных групп после приема пищи. В группах Ob и T2D наблюдался повышенный постпрандиальный уровень и прирост площади под кривой (iAUC) С-пептида и инсулина (рис. 2А и Б). У пациентов, в отличие от контроля, уровень глюкозы ожидаемо был повышен вплоть до второго часа после приема пищи, тогда как iAUC был увеличен только в группе T2D (рис. 2).

Корреляции базальной экспрессии генов с показателями метаболизма глюкозы

В базальном состоянии в группе Ob, T2D и объеденной группе пациентов было найдено 526, 174 и 397 генов, изменивших экспрессию относительно здорового контроля. Однако только для 38 из них были найдены значимые и сильные корреляции (|ρ|>0,7) с базальным уровнем инсулина, С-пептида, глюкозы натощак или HbA_1c. Для того, чтобы выявить потенциальные биологически значимые корреляции, мы выбрали 11 генов, экспрессия которых различалась между здоровым контролем и любой группой пациентов >1,5 раза (рис. 3А, табл. 2, доп. рис.). При анализе зависимости базальной экспрессии с изменением уровня глюкозы в ответ на прием пищи были обнаружены значимые корреляции для четырех генов: положительные для NFIL3 и VGLL2, отрицательные для CADM1 и GPCPD1) (рис. 3А, табл. 2, доп. рис.).

Корреляции постпрандиальных изменений экспрессии генов с показателями метаболизма глюкозы

Значимые корреляции между здоровыми добровольцами и пациентами были обнаружены для 37 генов; среди них только для двух генов было обнаружено выраженное (>1,5 раза) изменение амплитуды постпрандиальной экспрессии — MEOX1 (Mesenchyme Homeobox 1) и TXNDC12 (Thioredoxin Domain Containing 12) (рис. 3Б, доп. рис.).

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании мы изучали ассоциации между биохимическими показателями крови, характеризующими нарушения метаболизма глюкозы, и экспрессией генов в скелетной мышце в базальном состоянии и после приема пищи у здоровых людей, пациентов с ожирением без и с СД2. Важно отметить, что изменение этих показателей изучалось в условиях, близких к физиологическим, а именно после приема смешанной пищи, нормированной на массу тела. В результате работы удалось выявить 17 генов, экспрессия которых была ассоциирована с метаболическими нарушениями и уровнем инсулина, C-пептида или глюкозы (натощак или в ответ на прием пищи) (доп. рис.).

Экспрессионные маркеры, ассоциированные с уровнем инсулина и С-пептида натощак

Инсулин — анаболический гормон, который регулирует множество процессов в скелетных мышцах. При инсулинорезистентности хронически повышенный уровень инсулина и/или его чрезмерный постпрандиальный прирост может приводить к изменению в инсулин-зависимой клеточной сигнализации и экспрессии генов в скелетных мышцах. Мы выявили несколько экспрессионных маркеров скелетной мышцы, которые тесно коррелируют с базальным уровнем или постпрандиальным изменением уровня инсулина. Среди них были обнаружены гены, для которых ранее была показана роль в регуляции глюкозного метаболизма и развитии метаболических нарушений.

Так, по аналогии с нашим исследованием, показавшим, что базальная экспрессия гена адипомиокина FSTL1 положительно коррелирует с уровнем С-пептида и инсулина натощак (рис. 4А), было обнаружено, что уровень FSTL1 в крови людей положительно связан с ожирением и инсулинорезистентностью [18]. На миобластах L6 и первичных миобластах собаки было показано, что FSTL1 регулирует AMPK-зависимый захват глюкозы и экспрессию GLUT4 [19]. Более того, инфузия FSTL1 собакам с индуцированной сердечной недостаточностью положительно повлияла на метаболизм жирных кислот и окисление глюкозы [20]. Эти данные и наши результаты позволяют предположить, что инсулин-индуцированное увеличение экспрессии FSTL1 у пациентов может быть одним из компенсаторных механизмов, направленных на предотвращение нарушений в захвате глюкозы мышцами.

Обнаруженные нами отрицательные корреляции экспрессии гена SMOC1 с уровнем инсулина и С-пептида согласуются с данными о положительной корреляции уровня его белка в плазме с инсулиновой чувствительностью у людей [21]. У мышей внутрибрюшинное введение SMOC1 или увеличение экспрессии его гена в печени улучшило метаболизм глюкозы и чувствительность к инсулину за счет увеличения экспрессии генов-регуляторов глюконеогенеза [21]. У человека взаимосвязь между уровнем SMOC1 в крови и нарушением углеводного метаболизма остается не изученной, однако наше исследование указывает на потенциальную роль изменений экспрессии этого гена в скелетных мышцах в развитии метаболических нарушений.

Гены UBTD1 и MFAP5 имели положительную корреляцию базальной экспрессии с уровнем C-пептида натощак. Это согласуется с другими исследованиями, где они описаны как экспрессионные маркеры, положительно коррелирующие с уровнем глюкозы натощак, скоростью потребления глюкозы (UBTD1) либо степенью ожирения или уровнем инсулина натощак (MFAP5) [11][22].

Экспрессионные маркеры, ассоциированные с уровнем глюкозы натощак

Гипергликемия является ключевой причиной нарушения функционирования различных тканей, органов и систем, в том числе скелетной мускулатуры, в частности показана ее взаимосвязь с появлением диабетической миопатии [23]. Однако молекулярные механизмы негативных эффектов гипергликемии на скелетную мышцу изучены слабо. Мы обнаружили несколько экспрессионных маркеров, взаимосвязанных с постпрандиальным уровнем глюкозы. Так, базальная экспрессия GPCPD1 отрицательно коррелировала с изменением глюкозы в ответ на тест со смешанной пищей (рис. 4Б). Влияние GPCPD1 на развитие инсулинорезистентности у человека не изучено, но показано, что инактивация этого гена в мышцах мышей вызывает накопление глицерофосфохолина, гипергликемию и инсулинорезсистентность, что согласуется данными об увеличении глицерофосфохолина в скелетной мышце пожилых людей и пациентов с СД2 [24].

Роль других генов, экспрессия которых была связана с постпрандиальным изменением глюкозы, в регуляции метаболизма глюкозы в скелетных мышцах не изучена. Однако было показано, что в культуре первичных бета-клеток поджелудочной железы экспрессия гена CADM1 связана с секрецией инсулина и уровнем глюкозы [25], а в культуре первичных гепатоцитов ген NFIL3 регулирует продукцию глюкозы и глюконеогенез [26].

Постпрандиальные изменения экспрессии генов, ассоциированные с уровнем инсулина и C-пептида

Постпрандиальные изменения экспрессии только двух генов (транскрипционный фактор MEOX1 и белок эндоплазматического ретикулума TXNC12) коррелировали с различными показателями метаболизма глюкозы; роль этих генов в регуляции метаболизма глюкозы до сих пор неизвестна. Стоит отметить, что в наш анализ были включены только гены с выраженными различиями (>1,5 раза) в постпрандиальном ответе между пациентами и здоровыми людьми. Тем не менее интересно отметить негативную отрицательную корреляцию изменения экспрессии гена бета-адренорецептора 2 ADRB2 (различие в изменении экспрессии между здоровыми и пациентами в 1,3 раза) с изменениями инсулина и С-пептида (рис. 4В). ADRB2 ранее неоднократно был ассоциирован с инсулинорезистентностью и имеет несколько полиморфизмов, надежно ассоциированных с ожирением [27][28], а его экспрессия положительно коррелирует с потерей жировой массы [29].

ОГРАНИЧЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты нашего исследования получены на малой выборке, поэтому требуются последующие исследования для верификации обнаруженных нами маркеров. Помимо этого, наличие сопутствующих патологий у пациентов, а также прием ими сахароснижающих препаратов (несмотря на их отмену за сутки до исследования) могли повлиять на вариативность полученных данных. В нашем исследовании только двое пациентов принимали исключительно сахароснижающую терапию, остальные дополнительно принимали другие препараты, в основном направленные на терапию артериальной гипертензии и гиперхолестеринемии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе было выявлено 17 экспрессионных маркеров (генов), ассоциированных с показателями, характеризующими нарушения глюкозного метаболизма в базальном состоянии и после приема пищи. Валидность нашего предсказания подтверждается тем, что для 7 из них уже была показана взаимосвязь с метаболическими нарушениями, а гены FSTL1 и SMOC1 рассматривались ранее как потенциальные терапевтические мишени для контроля уровня глюкозы в крови. Другие экспрессионные маркеры, выявленные в нашем исследовании, являются перспективными кандидатами для будущих целевых исследований, направленных на изучение механизмов возникновения инсулинорезистентности, и могут быть рассмотрены как потенциальные терапевтические мишени. Помимо этого, следует отметить, что в нашем исследовании изучался ранний ответ транскриптома на прием смешанной пищи; исследование этого ответа на более поздних этапах (и поиск ассоциаций с нарушениями метаболизма глюкозы) представляется перспективным направлением для дальнейших исследований.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Дополнительный рисунок доступен по адресу https://zenodo.org/records/10998825

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках проекта № 21-75-10146.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Махновский П.А. — биоинформатический и статистический анализ данных и их биологическая интерпретация, написание рукописи статьи и ее редактирование; Курочкина Н.С. — пробоподготовка образцов РНК, РНК-секвенирование, внесение существенных правок в рукопись статьи; Вепхвадзе Т.Ф. — проведение интервенций и их организация, пробоподготовка образцов РНК, внесение существенных правок в рукопись статьи; Томилова А.О. — работа с пациентами, проведение интервенций и их организация, внесение существенных правок в рукопись статьи; Леднев Е.М. — проведение интервенций и их организация, статистический анализ данных, внесение существенных правок в рукопись статьи; Шестакова М.В. — научное руководство исследования, организация и концепция исследования, биологическая интерпретация результатов, внесение существенных правок в рукопись статьи; Попов Д.В. — научное руководство исследования, организация и концепция исследования, биологическая интерпретация результатов, написание рукописи статьи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы благодарят к.м.н. И.А. Скляника (Институт диабета ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России) за помощь в работе с пациентами.