Аллельные варианты генов главного комплекса гистосовместимости у детей с сахарным диабетом 1 типа, заболевших в дошкольном возрасте

ВВЕДЕНИЕ

Сахарный диабет 1 типа (СД1) — хроническое, аутоиммунное заболевание, характеризующееся поражением инсулинпродуцирующих клеток поджелудочной железы, что со временем приводит к истощению и развитию потребности в заместительной инсулинотерапии. Несмотря на общие основные черты, клиническая картина СД1 может быть достаточно гетерогенной, особенно ярко это проявляется при манифестации СД1 в различные возрастные периоды. Так, заболевание в более раннем возрасте характеризуется более острой манифестацией и быстрым истощением остаточной секреции инсулина [1]. В то же время во взрослом возрасте аутоиммунный процесс может протекать в гораздо более мягкой форме, что, в частности, привело к выделению латентной формы аутоиммунного сахарного диабета — LADA (latent autoimmune diabetes in adults, LADA) [2]. В связи с этим на сегодняшний день — в зависимости от возраста манифестации СД1, — выделяют так называемые эндотипы СД1, характеризующиеся различной иммунологической и морфологической картиной [3][4].

Наличие данных обстоятельств может указывать на различные этиологические и патогенетические механизмы формирования и развития аутоиммунного процесса, которые модулируются генетическими особенностями каждого индивидуума. Основная генетическая связь с СД1 определяется генами главного комплекса гистосовместимости (HLA, human leukocyte antigen), наиболее значимыми из которых являются DR-DQ локусы [5]. Вариации HLA-генов могут определять различную чувствительность и специфичность клеточного иммунитета к различным аутоантигенам, что, вероятно, и определяет предрасположенность конкретного индивидуума к СД1 и, возможно, клинические особенности течения.

На сегодняшний день установлены возрастные особенности HLA-генов в различных европейских [6] и азиатских популяциях [7], в то же время в российской популяции такие данные отсутствуют.

ЦЕЛЬЮ данного исследования являлось изучение влияния HLA-генов на предрасположенность к СД1 в дошкольном возрасте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Набор пациентов, биохимические, гормональные и иммунологические исследования проводились в детском отделении сахарного диабета ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России. Генетическое исследование и биоинформационная обработка данных проведены в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» МЗ РФ и ООО «НПФ ДНК-Технология».

Время исследования. В исследование включены пациенты, проходившие стационарное обследование с января 2022 по декабрь 2022 гг.

Изучаемые популяции

В исследование были включены 885 детей в возрасте от 1 года до 18 лет с ранее диагностированным СД1, находившихся на интенсифицированной инсулинотерапии.

Анализ в подгруппах

В зависимости от возраста диагностики СД1 участники исследования были разделены на две группы: 1 группа — с манифестацией СД1 <7 лет, 2 группа — с манифестацией СД1 ≥7 лет.

Дизайн исследования

Одноцентровое одномоментное исследование.

Методы

Общеклинические данные включали показатели возраста диагностики СД1, возраст на момент обследования пациентов, индекс массы тела (ИМТ) и его Z-оценка (SDS).

Уровень гликированного гемоглобина (HbA_1c) определялся методом жидкостной ионообменной хроматографии на анализаторе BioRad D10 (BioRad, США). Уровень С-пептида оценивался методом усиленной хемилюминесценции на анализаторе COBAS 6000 фирмы Roche Diagnostics (Швейцария). Референсные значения С-пептида: 1,1–4,4 нг/мл. Уровень С-пептида менее 0,1 нг/мл оценивался как остаточный.

Иммунологическое исследование: количественное определение аутоантител (АТ) к глутаматдекарбоксилазе (GADA) и тирозинфосфатазе (IA-2) — с использованием иммуноферментных наборов Medizym фирмы Medipan MGBH, к транспортеру цинка 8 (ZnT8) — иммуноферментных наборов Zinc Transporter 8 Autoantibody Human ELISA фирмы BioVendor. Результаты считались положительными при значениях ZnT8A>30 мМЕ/мл, IA-2A>30 мМЕ/мл, GADA>30 мМЕ/мл. Данные по GADA АТ были проанализированы у 135, по IA-2 АТ у 228 и по ZnT8 АТ у 130 участников исследования с длительностью СД1 менее 3 лет.

Генетическое исследование HLA

Выделение геномной ДНК проводили из цельной крови с помощью набора ПРОБА-МЧ МАКС (производство ООО «ДНК-Технология ТС» РУ №РЗН 2021/14391). Типирование генов HLA I и II классов проводили с помощью «Набора реагентов для подготовки библиотек фрагментов ДНК генов HLA I и II классов для генотипирования высокопроизводительным секвенированием (NGS) HLA-Эксперт» (производство ООО «ДНК-Технология ТС» РУ №РЗН 2019/9208) и программного обеспечения «HLA-Эксперт», входящего в состав набора.

Для анализа ассоциаций были отобраны ранее описанные в литературе предрасполагающие и протекторные в отношении СД1 DR-DQ гапло- и генотипы, а также не-DR-DQ локусы в пределах HLA-региона: HLA-A, HLA-B, HLA-C. В анализ были включены только аллели с частотой встречаемости не менее 1,0% в общей группе [8]. Анализировались частоты как гаплотипов, так и генотипов по аллелям DR и DQ, обладающие дополнительным риском или защитой по отношению к изолированному гаплотипу.

Статистический анализ

Статистическая обработка проводилась в Python 3.10.2 с использованием открытой библиотеки statsmodels 0.13.2 [9].

Совокупности количественных показателей описывались при помощи значений медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей [Q1; Q3]. Различие между количественными признаками в независимых выборках оценивалось с помощью критерия Манна-Уитни.

Номинативные данные описывались в виде абсолютной (n) и относительной частоты (%). Доверительный интервал (ДИ) для биноминальных пропорций (частот) рассчитывался методом Агрести-Коулла. Для сравнения частот в каждой изучаемой группе использовались таблица кросс-табуляции и статистика χ² с поправкой на непрерывность, когда это необходимо (количество ожидаемых наблюдений в любой из ячеек <5). Корректировка на конфаундеры была выполнена с использованием логистической регрессии. Поправка Бонферрони на множественные сравнения не применялась из-за ее чрезмерно консервативного характера.

Статистически значимыми считались различия при p<0,05.

Этическая экспертиза

Протокол исследования одобрен локальным Комитетом по этике ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России (выписка из протокола №26 от 22.12.2021). Информирование согласие подписывали родители участников исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика участников исследования

Общая и клиническая характеристики участников исследования представлены в табл.1. По сравнению с группой с манифестацией СД1≥7 лет, помимо паспортного возраста, возраста манифестации и длительности СД1, участники в группе с манифестацией СД1 <7 лет имели более низкие показатели уровня С-пептида (0 (0–0,2) против 0,3 (0–0,9) нг/мл), у них реже выявлялись АТ GAD (48% против 67%), IA-2 (52% против 62%), ZnT8 (44% против 71%). Не было значимых различий по соотношению полов, уровню НbА_1с и стандартизированной оценке (SDS) ИМТ.

Распределение HLA генов в зависимости от возраста манифестации

Частоты различных HLA гапло- и генотипов представлены в табл. 2. Среди всех предрасполагающих DR-DQ генотипов в группе с манифестаций СД1 <7 лет отмечалась большая частота генотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01/DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 (27,5% (23,7–31,7) против 21,5% (17,8–25,8)). Данная связь была опосредована большей частотой гаплотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01 в этой группе (55,3% (50,8–59,7) против 46,7% (42,0–51,6)), так как частота гаплотипа DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 между группами не различалась. Значимых различий в частоте протекторного DR-DQ генотипа между группами не было, однако в группе с манифестаций СД1<7 лет реже встречался протекторный гаплотип DRB1*01-DQA1*01-DQB1*05:01 (19,1% (15,8–22,9) против 24,9% (21,0–29,3)).

В отношении генов HLA I класса в группе с манифестацией <7 лет была большая частота предрасполагающего гаплотипа A*24:02 (35,6%(30,9–40,6) против 24,1% (19,5–29,4)), других различий в предрасполагающих и протекторных генах отмечено не было.

Распределение HLA-генов в зависимости от уровня С-пептида

В табл. 3 представлен анализ частот HLA-генов в зависимости от уровня секреции С-пептида, непосредственно и с учетом возраста манифестации и длительности СД1. Различий в частоте предрасполагающих DR-DQ генотипов между группами не было. В то же время у пациентов с уровнем С-пептида <0,1нг/мл после коррекции на возраст манифестации и длительность СД1 частота гаплотипа DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 была выше (65,7% (61,7–69,5) против 60,8% (55,5–65,9)).

Также у пациентов с уровнем С-пептида <0,1 нг/мл реже встречался протекторный генотип DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02/DRB1*15-DQA1*01:03-DQB1*06:03 или DRB1*13-DQA1*01:03-DQB1*06:03 (0,7% (0,2–1,9) против 2,7% (1,3–5,1)), однако после коррекции на возраст манифестации и длительность СД1 данная связь отсутствовала. В то же время отдельно частота протекторного гаплотипа DRB1*15-DQA1*01:03-DQB1*06:03 или DRB1*13-DQA1*01:03-DQB1*06:03 была значимо выше у пациентов с остаточной секрецией С-пептида (3,3% (1,8–5,8) против 1,3% (0,6–2,6)), как с коррекцией на возраст манифестации и длительность СД1 так и без нее.

В отношении HLA I класса у пациентов с уровнем С-пептида <0,1 нг/мл после коррекции на возраст манифестации и длительность СД1 отмечалась большая частота гаплотипа B*18:01 (20,9% (17,3–25,0) против 16,9% (12,5–22,4)).

Ассоциация HLA-генов с аутоантителами

Статистически значимые ассоциации с коррекцией на возраст манифестации и длительность СД1, между HLA-генами и АТ к GAD, IA-2, ZnT8 представлены в табл. 4.

Наличие GADА было связано с большей частотой гаплотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01 (55,0% (44,1–65,4) против 34,5% (23,3–47,8)) независимо от другого DR-DQ аллеля, в том числе после коррекции на возраст манифестации и длительность СД1.

Наличие IA-2А было связано с большей частотой предрасполагающего генотипа DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02, как независимо от другого DR-DQ аллеля (64,9% (56,4–72,5) против 41,2% (32,0–51,2)), так и при исключении других основных предрасполагающих аллелей DR3/4 (28,2% (21,2–36,5) против 16,5% (10,3–25,2)).

Наличие ZnT8 АТ было ассоциировано с большей частотой предрасполагающего гаплотипа DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 (33,3% (23,8–44,4) против 15,4% (7,7–27,8)), независимо от другого DR-DQ аллеля.

Обсуждение

Среди всех генов, ассоциированных с СД1, генетическая связь с HLA является наиболее сильной. При этом генетические характеристики индивидуума могут определять клиническую картину и возраст манифестации заболевания. В нашем исследовании проведена оценка взаимосвязи генов HLA с возрастом манифестации, степенью остаточной секреции инсулина и наличием островковых АТ.

По нашим данным, раннее начало заболевания в дошкольном возрасте связано с наличием генотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01/DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02, который имеет наибольший эффект, предрасполагающий к развитию СД1 [5]. В основном связь этого генотипа с дошкольным возрастом манифестации реализовалась за счет гаплотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01, так как нами не отмечено независимой связи аллеля DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 с возрастом манифестации. В европейской популяции лица с более ранним возрастом манифестации СД1 также имеют более высокую частоту предрасполагающего генотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01/DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02, но и более низкую частоту защитного DRB1*15:01-DQB1*06:02 и DRB1*07:01-DQB1*03:03 гаплотипов, чем у лиц с более старшим возрастом начала заболевания [6]. В азиатской популяции у пациентов с дебютом СД1 во взрослом возрасте была более низкая частота генотипов высокого риска DR3/DR4 и DR3/DR9 [7].

В нашей работе среди протекторных гаплотипов обратная связь с возрастом манифестации СД1 была показана только в отношении гаплотипа DRB1*01-DQA1*01-DQB1*05:01. По данным «Type 1 Diabetes Genetics Consortium (T1DGC)», данный гаплотип имеет умеренный протекторный эффект в отношении развития СД1 в европейской популяции [10].

В отношении генов HLA I класса в нашей работе возраст манифестации в дошкольном возрасте определялся наличием предрасполагающего к СД1 гаплотипа A*24:02. По данным исследований в европейских и азиатских популяциях, гаплотип A*24:02 связан с повышенным риском развития СД1 [11][12]. Кроме того, имеются данные, что A*24:02 связан с ранней и полной деструкцией бета-клеток [13][14] и более ранним началом СД1 [15][16].

Считается, что в более раннем возрасте течение СД1 имеет более «агрессивный» характер, с быстрым прогрессированием болезни с начальных проявлений до клинической стадии и более редким возникновением ремиссии СД1 — «медового месяца» [17]. Основным показателем, определяющим клиническое течение СД1, является остаточная секреция инсулина, определяемая по уровню С-пептида. В связи с этим нами была изучена взаимосвязь HLA-генов с уровнем секреции С-пептида. Учитывая, что уровень секреции зависит от длительности и возраста манифестации СД1 [18], при оценке нами была проведена коррекция на эти факторы. По нашим данным, после учета влияния возраста начала и длительности заболевания отсутствие остаточной секреции С-пептида было связано с наличием предрасполагающих к СД1 гаплотипов DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 и B*18:01. В то же время наличие остаточной секреции С-пептида было связано с наличием протекторного гаплотипа DRB1*15-DQA1*01:03-DQB1*06:03 или DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02. Таким образом, по нашим данным, дошкольный возраст манифестации СД1 и отсутствие остаточной секреции С-пептида связаны с разными HLA-генами. Это может указывать на то, что более ранняя манифестация СД и быстрое прогрессирование болезни в детском возрасте является не только результатом более быстрого снижения остаточной секреции инсулина, но и меньшей изначальной бета-клеточной массой или структурными и функциональными дефектами бета-клетки у детей дошкольного возраста, как предполагалось ранее [19].

После учета влияния возраста манифестации и длительности СД1 мы обнаружили, что DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 был связан с наличием IA-2 и ZnT8 АТ, что согласуется с более ранними выводами [20][21]. Предыдущие исследования показали, что ZnT8A и IA-2A являются индикаторами более выраженного островкового аутоиммунитета и более быстрого прогрессирования заболевания, которое обычно проявляется ближе к клинической стадии СД1 [20][22]. Также в нашем исследовании GAD АТ были связаны с предрасполагающим гаплотипом DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01. Ранее уже было показано, что DR3 связан с GADA.

Значение связи определенных HLA-генов с АТ может определяться различными этиологическими и патогенетическими механизмами формирования аутоиммуного процесса при СД1. При этом, как показано недавними исследованиями, антиген-специфическая иммунотерапия может быть наиболее эффективной при нацеливании на специфический HLA-гаплотип/аллель, связанный с толерантным антигеном [23]. Кроме того, эффективность неспецифической иммунотерапии, вероятно, также определяется наличием определенных HLA-гено-/гаплотипов и островковых АТ с лучшей чувствительностью при наличии HLA-DR4 и отсутствии HLA-DR3, а также отсутствии АТ ZnT8 [24]. Все это указывает на перспективность изучения HLA-аллелей в связи с их эффектами на иммуномодулирующую терапию.

Заключение

На достаточной выборке детей с СД1 в российской популяции нами установлены предрасполагающие и протекторные HLA-гаплотипы I и II класса, связанные с манифестацией СД1 в дошкольном возрасте и резервной функцией бета-клеток. Показана взаимосвязь наличия островковых АТ с предрасполагающими DR3/DR4 гаплотипами, что может определять различные механизмы формирования и течения аутоиммунного процесса.

Изучение характеристик генетического профиля HLA генов в зависимости от возраста манифестации СД1, степени остаточной секреции инсулина и специфических островковых АТ может улучшить понимание гетерогенности заболевания и особенностей его развития в различном возрасте, а также сформировать задел для персонализированной иммуномодулирующей терапии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках исполнения государственного задания № 123021000040-9.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Лаптев Д.Н. — концепция и дизайн исследования, набор материала, написание и редактирование текста, получение, анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных; Еремина И.А. — концепция и дизайн исследования, набор материала, написание и редактирование текста, получение, анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных; Шубина Е.С. — концепция и дизайн исследования, набор материала, написание и редактирование текста, получение, анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных; Янкевич Т.Э. — концепция и дизайн исследования, набор материала, написание и редактирование текста, получение, анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных; Сечко Е.А. — набор материала, редактирование текста; Гончарова Н.А. — концепция и дизайн исследования, набор материала, написание текста, получение, анализ, статистическая
обработка и интерпретация полученных данных; Петеркова В.А. — концепция и дизайн исследования, редактирование текста.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.