Роль дислипопротеинемий в изменении липидной фазы мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа

Особенности нарушений липидного обмена при сахарном диабете (СД) 1 и 2 типа в настоящее время освещены в достаточной мере [1, 2, 3]. Однако механизмы развития дислипопротеинемий (ДЛП) при сахарном диабете пока остаются неясными. Ранее нами было показано, что у здоровых людей в экстремальных условиях высоких широт в крови повышается содержание ЛПНП и ЛПОНП, что сопровождается развитием резистентности к инсулину и появлением глюкозурии. Экспериментальные исследования показали, что отмеченные нарушения углеводного обмена связаны с контринсулярным эффектом аполипопротеина В и апоВ-содержащих липопротеинов [4, 5]. Содержание ЛПВП в крови при СД снижается, что также рассматривается как дополнительный фактор риска сосудистых осложнений [4].

Патогенетическая роль дислипопротеинемий при СД выходит за рамки нарушений обмена липидов. Известно, что липопротеины крови принимают активное участие в обмене липидных компонентов (холестерина, фосфолипидов) клеточных мембран [6], что, в первую очередь касается мембран эритроцитов. Нарушения этого обмена могут привести к серьезным изменениям структуры мембран и их физико-химических свойств. Наиболее важным из них является увеличение вязкости мембран эритроцитов, что затрудняет перемещение их по капиллярному руслу и создает предпосылки для развития гипоксии.

Целью предпринятого нами исследования был анализ особенностей структурных изменений эритроцитарных мембран в зависимости от типов ДЛП, осложняющих развитие СД1 и 2.

Материалы и методы исследования

Обследованы 70 пациентов с СД1 и 2, из них 27 больных СД1 (15 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 19 до 55 лет (средний возраст 49,5±1,3 лет) и 43 больных СД2 (10 мужчин и 33 женщины) в возрасте от 39 до 60 лет (средний возраст 32,8±2,5 лет). В исследование не включались больные с острыми осложнениями СД (кетоацидоз, комы, острые стадии макроангиопатий), с хронической почечной недостаточностью и с обострением сопутствующей патологии. Критерием включения являлось отсутствие компенсации углеводного обмена на фоне инсулинотерапии у пациентов СД1 и на фоне приема таблетированных сахароснижающих препаратов у пациентов с СД2. Состояние углеводного обмена оценивали по содержанию глюкозы в капиллярной крови натощак и после приема пищи, уровню гликированного гемоглобина (HbA1c). Во время обследования больные находились на стационарном лечении в специализированном отделении. Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту без нарушений углеводного обмена. Материалом исследования явилась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром натощак. Для получения эритроцитарной массы кровь стабилизировали гепарином (25 Ед/мл).

Определение фракционного состава липопротеинов сыворотки крови было проведено с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния [7, 8]. Данный метод основан на разработанной единой модели строения липопротеинов всех фракций и субфракций в результате обобщения экспериментальных исследований и данных литературы о компонентном составе и размерах этих надмолекулярных комплексов. Малоугловое рентгеновское рассеяние позволяет определить концентрации холестерина, триацил­глицеридов и фосфолипидов плазменных липопротеинов в одном образце. Нами учитывались концентрации липопротеинов 6 основных подклассов: ЛПВП3, ЛПВП2, ЛПНП2-3, ЛПОНП2, ЛПОНП1 и величина таких интегральных показателей как общий холестерин и общие триацилглицериды. Также были рассчитаны отношение содержания общих фосфолипидов к общему холестерину и индекс атерогенности ((ОХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП, где ОХС – общий холестерин, а ХС ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности). При этом больные с нарушенным липидным обменом были распределены по типу ДЛП по классификации, предложенной D. Fredrickson: IIa тип ДЛП регистрировали, если в сыворотке крови содержание ХС ЛПНП превышало 175 мг/дл при нормальной концентрации триацилглицеридов (ТГ), IIб тип – если было повышено содержание ХС ЛПНП и ТГ (свыше 175 мг/дл – для лиц моложе 40 лет и свыше 210 мг/дл – для пациентов 40 лет и старше), IV тип – если содержание ХС ЛПНП было в пределах нормы, а концентрация ТГ – повышена [6].

Мембраны эритроцитов выделяли путем гипоосмотического гемолиза [9]. В полученной взвеси мембран микробиуретовым методом определяли содержание белка. Оценку структурных свойств липидной фазы мембран эритроцитов проводили с использованием измерения собственной флуоресценции теней эритроцитов и определения спектральных характеристик взаимодействия мембран с флуоресцентным зондом пирен на спектрофлуориметре «Hitachi-MPF-4» (Япония). Микровязкостные свойства мембран в области анулярных и общих липидов оценивали по степени эксимеризации пирена, вычисляя отношение интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров (J470/J370) при длине волны возбуждающего света (λв) 285 и 340 нм соответственно. Полярность окружения молекул пирена оценивали по соотношению J370/J390 при λв=340 нм [10]. Рассчитывали показатель миграции энергии с триптофановых остатков на пирен по формуле, предложенной Ю.А. Владимировым и Г.Е. Добрецовым [11].

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использованием методов непараметрического статистического анализа. Для проверки гипотезы о значимости различий закономерностей распределения исследованных признаков для отдельных групп обследованных был применен критерий Манна-Уитни (U-тест) для несвязанных выборок. Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров использовали вычисление коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Распределение общей группы больных по категориям было осуществлено с помощью кластерного анализа методом К-средних.

Результаты и их обсуждение

Показано, что липопротеиновый спектр сыворотки крови у больных СД1 характеризовался снижением содержания и изменением субфракционного состава ЛПВП: концентрация последних уменьшалась, главным образом, за счет снижения образования ЛПВП2; содержание ЛПВП3 менялось незначительно (табл. 1). Следствием сниженного образования антиатерогенных фракций липопротеинов у больных СД1 явился высокий индекс атерогенности. У данной категории пациентов в сыворотке крови также было обнаружено увеличение концентрации общего холестерина. Пациенты с СД2 характеризовались более выраженными и разнообразными изменениями спектра и компонентного состава ЛП крови по сравнению с таковыми у больных СД1. Так, наряду с аналогичным изменением содержания ЛПВП, было зарегистрировано увеличение концентрации ЛПОНП, а также более значительное повышение содержания в сыворотке крови общего холестерина и три­ацилглицеридов (см. табл. 1). Известно, что развитие гиперхолестеринемии при СД связано с нарушением гормональной регуляции углеводно-жирового обмена в целом. При этом инсулярная недостаточность усиливается продукцией контринсулярных гормонов, таких как кортизол и адреналин [12]. Гипертриглицеридемия сопряжена с повышением содержания ЛПОНП [3]. У пациентов, страдающих СД2, в сыворотке крови было обнаружено увеличение концентрации подфракций ЛПОНП. Так, содержание ЛПОНП1 в сыворотке крови у больных СД2 превышало соответствующий показатель у здоровых доноров в 1,8 раз (р<0,01), а содержание ЛПОНП2 – в 2,2 раза (р<0,001) (см. табл. 1).

Вероятно, это связано с повышением образования ЛПОНП в печени, которое происходит благодаря активному поступлению в нее жирных кислот, а также отсутствию ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП [3, 6]. Кроме того, обсуждается возможность увеличения синтеза жирных кислот в печени de novo [13, 14]. Катаболизм ЛПОНП при СД2 также нарушен вследствие снижения активности липопротеинлипазы в адипоцитах, что может сопровождаться недостаточным образованием ЛПНП [15]. Однако это не приводит к снижению в крови содержания ЛПНП, так как еще больше подавляется их утилизация. В результате продолжительность циркуляции в кровотоке ЛПНП существенно повышается.

Характерным для больных СД является уменьшение содержания подфракции ЛПВП2 в сыворотке крови (см. табл. 1). Усиление катаболизма ЛПВП многие исследователи связывают с повышением активности белка, переносящего эфиры холестерина, наблюдаемом при увеличении содержания ЛПОНП [3]. Благодаря белку, переносящему эфиры холестерина, осуществляется взаимообмен его и ТГ между ЛПОНП2 и ЛПВП2. При этом формируются частицы, богатые ТГ и чувствительные к печеночной липазе, что способствует их дальнейшей утилизации.

Анализируя изменения липидного спектра сыворотки крови у больных СД в соответствии с классификацией D. Fredrickson [16], нами было отмечено частое развитие у обследованных пациентов ДЛП IIб типа (29,4% у больных СД1 и 40,6% – у больных СД2). ДЛП IIа типа встречались соответственно у 22,2% больных СД1 и у 40,6% больных СД2. У последних выявлен также IV тип ДЛП (12,5% больных СД2).

Известно, что метаболические изменения, возникающие у больных СД при гипергликемии и дислипопротеинемии, создают условия для нарушения энергетического обмена и активации свободно-радикального окисления [17]. В этих условиях запускаются универсальные механизмы дезорганизации плазматических мембран, которые являются причиной нарушения их физико-химических свойств [18]. Нами было высказано предположение, что при дислипопротеинемиях важным механизмом нарушения композиции эритроцитарных мембран является изменение содержания плазменных липопротеинов и нарушение их взаимодействия с плазматическими мембранами клеток крови. Следствием этого может являться как недостаток акцепции мембранных липидов ЛПВП, так и избыточное поступление в мембрану холестерина и окисленных продуктов из ЛПНП и ЛПОНП [19], что должно приводить к изменению физико-химических свойств мембраны. Для проверки этого предположения нами была проведена оценка микровязкостных свойств теней эритроцитов у больных СД с дислипопротеинемиями с использованием флуоресцентного зонда пирен. При обследовании больных СД1 было установлено достоверно значимое снижение величин соотношения интенсивностей флуоресценции эксимерных и мономерных молекул пирена (J470/J370), регистрируемых при длине волны возбуждающего света 340 нм (на 25% по сравнению с нормой), что говорит об увеличении микровязкости липидной фазы мембран. При оценке структуры мембран эритроцитов у больных СД1 в области белок-липидных контактов (анулярная зона) также было выявлено возрастание микровязкости, на что указывало снижение на 23% по сравнению с нормой степени эксимеризации пирена при λв=285 нм (табл. 2). Эти изменения эритроцитарных мембран мы объясняем, прежде всего, развитием ДЛП.

Участие липопротеинов в обмене липидными компонентами с эритроцитарными мембранами подтверждается данными корреляционного анализа. Так, у больных СД1 отмечалась положительная корреляция между коэффициентом полярности окружения зонда пирен и содержанием подфракции ЛПОНП1 (r=0,79, р<0,01). Была также обнаружена прямая корреляционная связь между содержанием ЛПВП и коэффициентом эксимеризации пирена при λв=340 нм (r=0,73, р<0,05), что говорит о снижении вязкости мембран под влиянием ЛПВП.

Весьма интересные результаты были получены при оценке микровязкости липидной фазы мембран эритроцитов у пациентов с СД2, отличавшихся существенными нарушениями липидного спектра сыворотки крови. У них средние значения параметров флуоресценции зонда пирен при взаимодействии с мембранами эритроцитов статистически не отличались от соответствующих показателей в группе здоровых доноров (см. табл. 2). Однако анализ полученных нами данных методом К-средних позволил выявить среди пациентов с СД2 группы с разнонаправленными изменениями текучести мембран эритроцитов. Классификация данных проводилась с учетом коэффициента эксимеризации зонда пирен при λв=340 нм и λв=285 нм, а также коэффициента полярности J370/J390. В первый кластер были объединены 36% пациентов со сниженными величинами коэффициентов J470/J370 при λв=340 нм (средние значения составили 0,220±0,025 усл. ед.) и λв=285 нм (средние значения – 0,182±0,014 усл. ед.), а также уменьшенными значениями коэффициента полярности окружения зонда пирен (средние значения – 0,914±0,027 усл. ед.). Это указывает на увеличение вязкости мембран и их гидрофобности. У пациентов этого кластера было отмечено менее выраженное повышение индекса атерогенности по сравнению с больными других групп (значения составили 4,38±0,38). Особенностью данного кластера пациентов явилось высокое содержание в крови ТГ и ЛПОНП: 273,73±20,39 и 237,49±24,25 мг/дл соответственно. ЛПОНП в составе триацилтриглицеридов содержат большое количество насыщенных жирных кислот, что, вероятно, может обеспечивать дезорганизацию структуры мембран эритроцитов в связи с уплотнением липидной фазы, о чем говорит снижение коэффициента полярности окружения зонда пирен J370/J390 (средние значения – 0,914±0,027 усл. ед.).

Наряду с этим была выделена группа больных СД2, у которых мембраны эритроцитов характеризовались повышенной текучестью и высокой полярностью гидрофобного слоя (средние значения J470/J370 при λв=340 нм составили 0,548±0,057 усл. ед., при λв=285 нм – 0,574±0,040 усл.ед., J370/J390 – 0,955±0,007 усл. ед., p<0,05). Данный кластер включал 25% больных СД2 с наибольшими значениями индекса атерогенности (8,73±1,51) и наименьшим содержанием ЛПВП (243,03±35,84 мг/дл). Вероятно, гидрофильные продукты ПОЛ, накапливаясь в мембранах в больших количествах при недостаточном содержании в плазме ЛПВП, вызывают разупорядоченность липидного бислоя и увеличение подвижности полипептидных цепей интегральных белков в мембране [20].

У пациентов следующего кластера, в который вошли 39% обследованных пациентов с СД2, средние величины коэффициента J470/J370 составили при λв=340 нм 0,434±0,018 усл. ед. и при λв=285 нм – 0,348±0,016 усл. ед. Выраженность нарушений липидного обмена у этих больных также носила промежуточный характер по сравнению с метаболическими изменениями пациентов других кластеров: содержание ЛПВП и значение индекса атерогенности составили 299,85±34,23 мг/дл и 6,54±0,70 соответственно, концентрация ТГ – 202,51±13,26 мг/дл, содержание ЛПОНП – 160,09±22,79 мг/дл.

Таким образом, отмеченные нами изменения липопротеинового спектра и разнообразие структурных нарушений мембран эритроцитов у больных СД1 и СД2 достаточно хорошо согласуются. Они свидетельствуют о том, что у больных СД1 дислипопротеинемии приводят к повышению микровязкости эритроцитарных мембран. У больных СД2 аналогичные изменения имеются лишь в группе лиц с высоким содержанием ТГ и ЛПОНП. В группе лиц с высоким содержанием холестерина (ЛПНП) и низким содержанием ЛПВП в сыворотке крови эритроцитарные мембраны характеризуются низкой микровязкостью.

Выводы

1. Изменения структуры мембран эритроцитов у больных СД1 и 2, осложняющихся дислипопротеинемией, характеризуются повышением микровязкости липидной фазы, а также нарушением межмолекулярных липид-липидных и белок-липидных взаимодействий.

2. Повышение микровязкости мембран эритроцитов, нарушения липид-липидных и белок-липидных взаимодействий связаны с увеличением содержания липопротеинов низкой и очень низкой плотности, а также снижением концентрации липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови у пациентов с сахарным диабетом, сопровождающимся дислипопротеинемиями.

3. Нарушения липопротеинового спектра и степень дезорганизации мембран эритроцитов при СД2 более значимы, чем при СД1.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-1051.2003.4, НШ-4153.2006.7.