МикроРНК как мишени и биомаркеры фиброза миокарда у больных сахарным диабетом 1 типа

ВВЕДЕНИЕ

Фиброз миокарда является ключевым звеном в патогенезе многих сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и возникает в результате повышенной активности миофибробластов и избыточного отложения внеклеточного матрикса. Ремоделирование миокарда приводит к снижению эластических свойств и ухудшению сократимости миокарда с развитием диастолической и систолической дисфункции, способствует развитию нарушений ритма сердца, ухудшению коронарного кровотока, возникновению сердечной недостаточности и повышает риск внезапной сердечной смерти [1][2].

При сахарном диабете (СД) гипергликемия, окислительный стресс, повышенная продукция провоспалительных цитокинов, факторов роста и конечных продуктов гликирования, нейрогуморальная активация и активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы влияют на процесс формирования не только диффузного фиброза в миокарде, но и периваскулярного фиброза [3]. Это приводит к снижению ангиогенеза, нарушению микроциркуляции в сердце, снижению коронарного резерва и толерантности к физической нагрузке, ухудшая качество жизни пациентов. На ранних стадиях отсутствуют специфические клинические симптомы фиброза миокарда, что не позволяет своевременно его диагностировать, но в конечном итоге возникает очаговый фиброз с повреждением, некрозом/апоптозом кардиомиоцитов и снижением систолической функции сердца [4].

В связи с прогрессирующим ростом распространенности СД структурно-функциональные нарушения сердца являются одной из основных причин сердечной недостаточности и смертности от ССЗ у данной категории больных [5][6]. Однако механизмы развития ремоделирования миокарда при СД остаются до конца не изученными, а современные методы лечения ограничены [7], поэтому крайне важно изучать новые молекулярные мишени и терапевтические стратегии.

Основными методами выявления фиброза миокарда являются магнитно-резонансная томография (МРТ) сердца с контрастным усилением (КУ) и биопсия миокарда, но они являются дорогостоящими и сопряжены с риском возникновения осложнений. В настоящее время активно ведется поиск биохимических маркеров фиброза миокарда для ранней диагностики и улучшения сердечно-сосудистого прогноза [8].

О причастности микроРНК как модификаторов развития различных патологических состояний в организме человека стало известно чуть менее 20 лет назад. Являясь участниками генома, они выполняют ряд ключевых функций в рождении и дифференцировке клеток, регулируя экспрессию генов, полный клеточный цикл и апоптоз. Это позволило создать в онкологии целое направление, связанное с изучением микроРНК: от понимания канцерогенеза до изучения онкосупрессивных свойств данных частиц. В настоящее время активно развивается таргетная терапия опухолевых процессов с участием микроРНК. Позже такое же направление появилось и в кардиологии, в основном в липидологии [9].

МикроРНК представляют собой отдельный класс молекул РНК, играющих ключевую роль в постранскрипционной регуляции экспрессии генов. В последние годы появились работы о возможном влиянии микроРНК на ухудшение сердечно-сосудистого прогноза у пациентов с СД. Они участвуют в разных биологических процессах, лежащих в основе развития ССЗ. В основном рассматриваются заболевания, ассоциированные с атеросклерозом [10]. Но практически нет исследований, посвященных участию микроРНК в развитии патологии миокарда у молодых пациентов с СД 1 типа (СД1). Между тем известно, что именно кардиоваскулярные заболевания определяют прогноз в этой популяции пациентов.

МикроРНК определяются в различных биологических жидкостях, что делает их важным звеном в применении как в качестве диагностики и прогнозирования заболеваний, так и эффективности его лечения. В этой связи важно изучение потенциальных механизмов участия микроРНК в патогенезе ССЗ у пациентов с СД. Появляющиеся данные указывают на то, что микроРНК способствуют фиброзу, изменяя экспрессию генов, ответственных за пролиферацию, ангиогенез и формирование внеклеточного матрикса [11].

В ряде исследований показано, что miR-21a-5p играет важную роль в патогенезе ССЗ, включая пролиферацию и апоптоз гладкомышечных клеток сосудов, рост и гибель сердечных клеток, а также функции сердечных фибробластов [12]. Выполняя ключевую роль в формировании фиброза миокарда, miR-21a-5p может являться потенциальной терапевтической мишенью для лечения ремоделирования сердца при гипертрофической кардиомиопатии и сердечной недостаточности [13].

С другой стороны, в некоторых исследованиях показана кардиопротекторная роль MiR-126-5p за счет усиления ангиогенеза, улучшения функции эндотелия, повышения толерантности к физической нагрузке и качества жизни после программы кардиореабилитации [14].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить уровень экспрессии отдельных микроРНК, участвующих в процессах ремоделирования миокарда у молодых пациентов с СД1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения

Исследование проведено на базе ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии имени академика И.И. Дедова» Минздрава России с декабря 2021 по 2024 гг.

Способ формирования выборки

В исследовании был использован произвольный способ формирования выборки.

Критерии соответствия

В исследование включено 110 участников без ССЗ с разделением на 2 группы: 80 пациентов с СД1 (основная группа) и 30 человек без СД1 (группа сравнения).

Критерии включения в исследование: возраст от 18 до 40 лет включительно; индекс массы тела (ИМТ) — от 18,5 до 29,9 кг/м²; диагноз «СД1» был установлен в соответствии с клиническими рекомендациями по СД1 от 2019 г., длительность СД — от 1 года до 14 лет, без тяжелых осложнений СД.

Критерии исключения: наличие сенсомоторной или автономной диабетической нейропатии; снижение расчетной скорости клубочковой фильтрации менее 60 мл/мин/1,73 м²; наличие синдрома диабетической стопы; диабетическая ретинопатия препролиферативной и пролиферативной стадий; артериальная гипертензия любой степени; ишемическая болезнь сердца и/или хроническая сердечная недостаточность (ХСН); нарушения ритма сердца и другие ССЗ; транзиторная ишемическая атака или инсульт.

Лабораторные и инструментальные методы исследования

Всем участникам исследования (n=110) проводились: консультация эндокринолога и кардиолога, ЭКГ, эхокардиографии (Эхо-КГ), эргоспирометрия, МРТ сердца с Т1-картированием, забор крови на общий анализ крови, биохимический, тиреотропный гормон.

Оценка уровня экспрессии циркулирующих микроРНК (miR-126-5p и miR-21-5p) проводилась с применением методики — QRealTime-PCR с синтезом собственных праймеров stem-loop, оценка амплификации интеркалирующим агентом SYBR Green. Для определения количества кДНК использовали относительную стандартную кривую, построенную с использованием разведений образцов с известной концентрацией. В качестве положительного контроля использовали синтетическую кДНК для миРНК-126-5р (126-5p сDNA) и миРНК-21-5р (21-5p сDNA) («Евроген»). Специфичность ПЦР-продуктов определяли с помощью кривой плавления. Результаты уровня экспрессии микроРНК нормализовывались относительно значения Ct, среднего для каждого образца, по формуле dCt = 2 (Ct микроРНК — Ct norm). В связи с отсутствием общепринятых референтных значений для уровней циркулирующих miR-126-5p и miR-21-5p, в нашем исследовании за референтные значения были приняты показатели в группе сравнения miR-126-5p: 0,0142–0,0288; miR-21-5p: 0,1643–0,7176. МРТ сердца проведена на томографе GE SIGNA Pioneer 3.0 T (с введением гадолиния (Гадовист — Bayer, Германия) 0,2 мл/кг. Оценка миокардиального фиброза проводилась по методике MOLLY (Modified LookLocker inversion recovery) со съемкой левого желудочка (ЛЖ) по короткой оси на трех срезах до контраста и на 15 минуте после контраста. Учитывая отсутствие единых референсных значений показателя Т1-картирования после КУ (Т1+КУ) и снижение показателя Т1+КУ при наличии диффузного фиброза миокарда, в нашем исследовании за референсное значение этого показателя был принят нижний показатель Т1+КУ в группе сравнения, который был равен 412. Также наличие диффузного фиброза миокарда проводилась в постконтрастном периоде посредством визуальной оценки. Биоимпедансометрия проведена на аппарате InBody 770.

Статистический анализ

Анализ полученных данных проведен с помощью программ IBM SPSS Statistics 27 (2020 г.), Microsoft Excel 2019. Различия значений частот в подгруппах оценивали с помощью критерия χ² (точного решения Фишера) и критерия Манна–Уитни. Параметры имеют следующие обозначения: Me [ Q1; Q3] — медиана, 25 и 75 перцентили; n — объем анализируемой подгруппы; r — коэффициент линейной корреляции; р — достигнутый уровень статистической значимости. Критическое значение уровня статистической значимости принимали равным 5%, или р<0,05.

Этическая экспертиза

Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом при ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии», протокол №24 от 24.11.2021 г. Пациенты подписали форму информированного согласия для участия в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Группа пациентов с СД1 и группа сравнения без СД1 были сопоставимы по возрасту, полу, индексу массы тела, процентному содержанию мышечной и жировой ткани. Пациенты с СД1 не различались между собой по уровню физической активности, выраженности осложнений СД. Описательная характеристика участников исследования представлена в таблице 1.

Всем пациентам с СД1 и участникам из группы сравнения проведен забор образцов сыворотки для определения уровня экспрессии кардиоспецифических микроРНК. Экспрессия циркулирующего miR-126-5p была получена во всех образцах (n=131), экспрессия miR-21-5p определялась в 44 образцах, в 87 образцах экспрессия miR-21-5p не выявлена. У пациентов СД1 выявлена статистическая тенденция к более низкими уровнями экспрессии кардиопротекторной miR-126-5p в сравнении со сверстниками без СД1, что может являться одним из звеньев эпигенетического влияния miR-126-5p на поражение сердечно-сосудистой системы при СД1. Полученные результаты оценки экспрессии миРНК приведены в таблице 2.

В обеих группах проведена сравнительная оценка уровня NT-proBNP (табл. 3) как маркера сердечной недостаточности. Пациентов с уровнем NT-proBNP от 125 пг/мл и более выявлено не было, и данный показатель не различался в обеих группах.

Всем пациентам и участникам группы сравнения проведено инструментальное исследование сердечно-сосудистой системы.

По данным Эхо-КГ (табл. 4) группы были сопоставимы по уровню фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ), данных за наличие диастолической дисфункции в обеих группах не получено. В группе пациентов с СД1 обращает на себя внимание увеличение индекса массы миокарда ЛЖ (ИММЛЖ), задней стенки ЛЖ (ЗСЛЖ), относительной толщина стенки (ОТС) в сравнении со сверстниками без СД1.

При оценке состояния сердечно-сосудистой системы посредством МРТ-сердца с Т1-картированием (табл. 5) среди обеих групп диффузный фиброз миокарда (по данным МРТ-сердца с КУ, посредством визуальной оценки) выявлен у 7 пациентов с СД1, что составило 8,7% из основной группы. Учитывая отсутствие единых референтных границ показателя Т1+КУ, в нашем исследовании за референтное значение был принят нижний показатель Т1+КУ в группе сравнения, который был равен 409. Среди группы пациентов с СД1 выявлено 5 (6,2%) пациентов с Т1+КУ менее 412. При этом у 5 пациентов с уровнем Т1+КУ менее 412 не определялось диффузное накопление (посредством визуальной оценки) контрастного препарата в миокарде ЛЖ при отсроченном контрастировании.

Впоследствии проанализирована диагностическая значимость показателей структурного состояния сердца по данным Эхо-КГ (толщина межжелудочковой перегородки (МЖП), ОТС) в отношении развития диффузного фиброза миокарда. Результаты ROC-анализа приведены в таблице 6. Построена ROC-кривая (рис. 1).

Согласно индексу Юдена, были выбраны пороговые точки параметров Эхо-КГ: толщина МЖП от 0,85 см и ОТС от 0,41 см.

Матрица кросс-табуляции для отрезной точки приведена в таблице 7.

В соответствии с полученными данными среди параметров Эхо-КГ, диагностически значимым в отношении развития диффузного фиброза миокарда по результатам ROC-анализа является увеличение ОТС от 0,41 см (p=0,011). Толщина МЖП от 0,85 может считаться статистической тенденцией, так как р<0,05, но более 0,0125.

Для стратификации по группам риска развития ССЗ среди пациентов с СД1, проведено разделение на группы по достижению пороговой точки — при ОТС от 0,41 см и более — группа высокого риска и ОТС<0,41 см — группа умеренного риска. В результате к группе высокого риска отнесен — 18 пациент (17,8%), к группе умеренного риска — 83 пациента (82,2%) (рис. 2).

Обращает на себя внимание, что из 18 пациентов, которые относились к группе высоко риска развития ССЗ, 5 пациентов имели диффузный фиброз миокарда, что составляет 27,8% среди пациентов группы высокого риска развития ССЗ. При этом среди пациентов с СД1 умеренной группы риска диффузный фиброз миокарда выявлен у 3 пациентов (3,6%).

Оценка функционального состояния кардиореспираторной системы проводилась с помощью эргоспирометрии. У пациентов с СД1 выявлены более низкие показатели VO2max (мл/мин/кг), METS и более быстрое достижение анаэробного порога (АП) в сравнении со здоровыми сверстниками. При этом снижение показателей эффективности работы кардиореспираторной системы (КРС) в группе пациентов с СД1 не сопровождалось снижением толерантности к физической нагрузке. Последняя оставалась такой же высокой как у здоровых сверстников без СД. Полученные результаты приведены в таблице 8.

ОБСУЖДЕНИЕ

В проведенном исследовании изучен уровень экспрессии отдельных микроРНК, участвующих в процессах ремоделирования миокарда у молодых пациентов с СД1. Группа пациентов с СД1 была сопоставима с группой сверстников без СД по возрасту, полу, ИМТ, композиционному составу тела (процентному содержанию жировой и мышечной ткани), показателям общеклинического, биохимического анализов крови и функции щитовидной железы. Участники обеих групп не имели ССЗ и не наблюдались у кардиолога.

Все пациенты с СД1 не имели тяжелых осложнений СД, медиана HbA_1c составила 7,8% [ 6,9; 9,1].

По данным ЭхоКГ, у пациентов с СД1 выявлено увеличение толщины ЗСЛЖ и ОТС (р<0,001 и р<0,001 соответственно), а также статистическая тенденция к повышенным значениям ИММЛЖ и МЖП (р=0,003 и р=0,009 соответственно). У сверстников без СД1 эти изменения выявлены не были. Структурные изменения являются ранним признаком ремоделирования миокарда и предшествуют нарушению функции сердца. Со временем гипертрофия часто сопровождается гибелью кардиомиоцитов, что приводит к интерстициальному и периваскулярному фиброзу и неблагоприятным сердечно-сосудистым событиям, включая сердечную недостаточность, нарушения ритма сердца и внезапную сердечную смерть [15].

Фиброз является следствием нарушенной регуляции профиброгенных и противофиброгенных механизмов в условиях хронической гипергликемии, повышенного образования конечных продуктов гликирования, активных форм кислорода, митохондриальной дисфункции и окислительного стресса [16][17][18].

Золотым стандартом диагностики фиброза миокарда является эндомиокардиальная биопсия, однако в связи с риском осложнений и возможными ошибками при взятии образцов она не может применяться в повседневной клинической практике. В настоящее время с этой целью используют альтернативные неинвазивные методы, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ) сердца с Т1-картированием и определение циркулирующих биомаркеров.

В нашем исследовании, по данным МРТ-сердца с Т1-картированием среди обеих групп, диффузный фиброз миокарда (по данным МРТ-сердца с КУ, посредством визуальной оценки) выявлен у 7 пациентов с СД1, что составило 8,7% из основной группы. В группе контроля признаков фиброза миокарда не выявлено.

В соответствии с полученными данными среди параметров Эхо-КГ, диагностически значимым в отношении развития диффузного фиброза миокарда является увеличение ОТС от 0,41 см (p=0,011). Обращает на себя внимание, что из 18 пациентов с СД1, которые относились к группе высокого риска развития ССЗ (при ОТС от 0,41 см и более), 5 пациентов имели диффузный фиброз миокарда, что составляет 27,8% среди пациентов группы высокого риска развития ССЗ. При этом среди пациентов с СД1 умеренной группы риска диффузный фиброз миокарда выявлен у 3 пациентов (3,6%).

В последние годы активно ведутся исследования по изучению роли микроРНК в патогенезе различных заболеваний, в том числе в области кардиологии.

Высокие уровни экспрессии miR-21-5p являются маркером развития диффузного фиброза миокарда у пациентов гипертрофической кардиомиопатией (по данным МРТ-сердца с T1-картированием) [19]. В нашей работе при оценке уровня экспрессии циркулирующей miR-21-5p, несмотря на соблюдения правил хранения образцов, методов анализа, из 131 образца плазмы (101 образец пациентов с СД и 30 группы сравнения) экспрессия циркулирующей miR-21-5p выявлена всего в 44 случаев (43,5%), что также снижает диагностическую значимость данного маркера у пациентов с СД1. Однако уровень miR-21-5p хоть и не достиг статистической значимости, был выше у пациентов с СД1, чем в группе контроля (р=0,533).

По данным большинства исследований, miR-126-5р специфически и в первую очередь экспрессируется сосудистым эндотелием. Было показано, что уровни miR-126 ниже у пациентов с повреждением или дисфункцией эндотелия [20][21], в то время как более высокая экспрессия miR-126-5р положительно влияет на процесс восстановления поврежденного эндотелия [20][21][22], поддерживая эндотелиальный гомеостаз и сохраняя неоваскуляризацию [23].

В настоящее время все больше исследований поддерживают теорию о том, что физиологические условия, факторы окружающей среды, образ жизни оказывают влияние на экспрессию микроРНК [24][25][26]. Физические упражнения могут по-разному влиять на экспрессию ключевых молекулярных маркеров, включая скелетные мышцы и циркулирующие микроРНК, участвующие в регуляции клеточных и метаболических путей у здоровых людей и у пациентов, страдающих неинфекционными заболеваниями (НИЗ). В данной ситуации эпигенетические факторы становятся потенциальными терапевтическими биомаркерами в прогнозе и лечении НИЗ, а важные эпигенетические факторы, микроРНК, играют решающую роль в регуляции пролиферации и гибели клеток. В исследовании, проведенном Dong Jin с соавт., у пациентов с сердечной недостаточностью с сохранной ФВ ЛЖ после 12 недель кардиореабилитации уровень miR-126-5р значительно увеличился по сравнению с исходным уровнем, также отмечено улучшение функциональных показателей сердца, толерантности к физической нагрузке и качества жизни пациентов [27].

В нашей работе у молодых пациентов СД1 выявлена статистическая тенденция к более низким уровням экспрессии кардиопротекторной miR-126-5p в сравнении со сверстниками без СД1, что может являться одним из звеньев эпигенетического влияния miR-126-5p на поражение сердечно-сосудистой системы при СД1.

Для выявления практических аспектов применения оценки экспрессии miR-126-5p (валидация поражения или оценка тяжести поражения сердечно-сосудистой системы и эффективность терапии) в клинической практике необходимы продолжить исследования в этом направлении.

В обеих группах пациентов с уровнем NT-proBNP от 125 пг/мл и более [28] выявлено не было, и данный показатель не различался в обеих группах (р=0,370). В то же время при проведении спироэргометрии обращало на себя внимание более низкие показатели VO2max (р=0,001), METS (р<0,001) и более быстрое достижение АП (р=0,018) у пациентов с СД1 в сравнении со здоровыми сверстниками. При этом снижение показателей эффективности работы кардиореспираторной системы в группе пациентов с СД1 не сопровождалось снижением толерантности к физической нагрузке. Последняя оставалась такой же высокой как у здоровых сверстников без СД.

Ограничения исследования

Ограничения данного исследования выражены в недостаточности объема выборки (в исследование было включено относительно небольшое число пациентов), полученные данные не могут быть экстраполированы на популяцию пациентов с СД1 в целом. Для получения более полных результатов с достаточной статистической мощностью необходим больший размер выборки. Исследованные выборки являются смещенными, поскольку набор пациентов с СД1 без ССЗ проводился только в условиях ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России.

Другим ограничением является оценка экспрессии микроРНК. Для оценки был использован метод количественной ПЦР в режиме реального времени, но данный метод не является ни быстрым, ни экономически выгодным. Интеграция использования микроРНК в клинической практике потребует разработки быстрых и недорогих методов. В настоящее время требуются исследования в более широких масштабах, чтобы лучше оценить потенциал миРНК в качестве эпигенетически маркеров или терапевтических мишеней.

Необходимо учитывать эти ограничения в дальнейших исследованиях, включающих большие выборки пациентов, для усовершенствования персонифицированного алгоритма обследования молодых пациентов с СД1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенной работы выявлены ранние, доклинические нарушения геометрии сердца у молодых пациентов с СД1. Показано, что метод МРТ сердца с отсроченным контрастированием является существенно более чувствительным по сравнению с Эхо-КГ в отношении выявления диффузного фиброза миокарда, патологического процесса, определяющего неблагоприятный сердечно-сосудистый прогноз. В проведенной работе в 8,7% случаев диффузный фиброз миокарда был выявлен у пациентов с СД1 с помощью МРТ сердца. У здоровых сверстников данных изменений в миокарде не было. Группа больных СД1 с диффузным фиброзом миокарда характеризовалась более выраженными начальными структурными изменения миокарда (по данным Эхо-КГ).

При наличии начальных признаков ремоделирования миокарда у больных с СД1, целесообразно проведение МРТ сердца для исключения формирования диффузного фиброза.

У пациентов с СД1 наблюдается более низкие уровни кардиопротективного микроРНК — miR-126-5p.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Госзадание «Дисфункция миокарда и формирование сердечной недостаточности в исходе морфологических, молекулярно-генетических и биохимических нарушений в сердечной мышце у пациентов с эндокринопатией» НИР №123021000043-0 (IDC#22237).

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Венгржиновская О.И. — получение, анализ данных, интерпретация результатов; написание статьи; Бондаренко И.З. — разработка концепции и дизайна исследования; внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи; Шацкая О.А. — существенный вклад в концепцию исследования; внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи; Лобкова А.А. — существенный вклад в получение, анализ данных и интерпретацию результатов; написание статьи; Тарбаева Н.В. — существенный вклад в дизайн исследования; внесение в рукопись важной правки; Корнелюк А.Ю. — существенный вклад в получение, анализ данных; написание статьи; существенный вклад в концепцию исследования; внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи; Калашников В.Ю., Шестакова М.В., Мокрышева Н.Г. — существенный вклад в концепцию исследования; внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи.

Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.