Диагностика артифициальной гипогликемии вследствие приема пероральных сахароснижающих препаратов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием

АКТУАЛЬНОСТЬ

Синдром Мюнхгаузена (СМ) — это собирательный термин, объединяющий артифициальные заболевания («артифициальный» — artificial — искусственный, рукотворный, ненастоящий). При СМ человек умышленно производит или симулирует физические/психические признаки и симптомы определенной патологии с целью признания окружающими его больным без каких-либо внешних стимулов для подобного поведения [1].

Артифициальный гипогликемический синдром или артифициальная гипогликемия (АрГ) является одним из самых известных «искусственных заболеваний» [2] и представляет собой преднамеренное применение препаратов инсулина или пероральных сахароснижающих препаратов (ПССП) с целью снижения уровня глюкозы крови [3]. Данное состояние описано как у лиц без нарушений углеводного обмена, так и у пациентов с сахарным диабетом (СД) [2][4][5]; нередко встречается у работников в сфере здравоохранения [4], а также у пациентов, родственники которых страдают СД. Часто имеют место коморбидные психиатрические заболевания и социально-психологические проблемы [4][6][7][8]. Для артифициальных патологий характерны неадекватные изменения симптомов и течения заболевания, в том числе во время лечения, многократные госпитализации и наблюдение у различных специалистов. Нередко наступает необъяснимая длительная «ремиссия» эпизодов гипогликемии с последующим их возобновлением [9]. Важно отметить, что больные с СМ могут предоставить подделанные результаты лабораторных исследований или иную медицинскую документацию [6].

Как правило, пациенты с АрГ отрицают экзогенное введение сахароснижающих препаратов, не признают данный факт и после предоставления им «доказательств» (например, результатов лабораторных анализов) [2]. Своевременная диагностика СМ — это в первую очередь возможность обсудить с пациентом ситуацию, рассказать о вероятности необратимого повреждения здоровья, а также летального исхода. Кроме того, при установлении факта «искусственного заболевания» нет необходимости в проведении разнообразных диагностических мероприятий с целью поиска причин снижения гликемии, которые зачастую включают в себя инвазивные и дорогостоящие, в том числе оперативные вмешательства. При ведении таких больных требуется мультидисциплинарный подход с обязательным участием психиатра [3][6][7][8].

Диагностика АрГ сложна, так как лабораторные признаки схожи с другими заболеваниями, ассоциированными с недиабетической гипогликемией (НДГ), например, с инсулиномой. Только при абсолютном круглосуточном наблюдении за пациентом и исключении использования личных вещей удавалось подтвердить АрГ. Но такие мероприятия должны проводиться при согласии пациента, которое он обычно не дает, а также при наличии возможностей стационара обеспечить круглосуточный пост. В итоге до недавнего времени пациенты с АрГ в России в большинстве случаев оставались с неуточненным диагнозом. При этом, по данным зарубежной литературы, описаны случаи успешного выявления преднамеренного приема ПССП с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) [10].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Учитывая актуальность проблемы, целью настоящего исследования является оптимизация диагностики АрГ вследствие приема ПССП с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ, 2017–2022 гг.

Изучаемая популяция

Пациенты, проходившие обследование в ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ.

Критериями включения для всех групп являлись: мужской или женский пол; возраст — 18 лет и старше. Критериев исключения не было.

Дизайн исследования

Одноцентровое, экспериментальное.

Методы

Работа состояла из двух этапов, на каждом из которых формировались пары групп пациентов.

Этап 1: разработка метода ВЭЖХ-МС/МС для обнаружения иПССП в крови в группе пациентов с СД 2 типа (СД2), которые получали исследуемые ПССП (иПССП), и в группе условно здоровых пациентов.

Порядок выполнения исследования представлен на рисунке 1.

Время забора крови через 1 час после приема иПССП у пациентов группы 1 было выбрано с учетом времени, при котором любой лекарственный препарат, принятый внутрь, уже начал всасываться в ЖКТ и поступать в кровоток [11][12][13][14][15][16]. Минимальное количество препарата достаточно для его определения методом ВЭЖХ-МС/МС с учетом его высокой чувствительности — порядка 10 пг/мл по каждому компоненту, что позволяет выявить следы препарата даже спустя неделю после приема.

Этап 2: валидация метода детектирования иПССП с помощью ВЭЖХ-МС/МС в группе пациентов с гиперинсулинемической НДГ.

Порядок выполнения исследования на этапе 2 представлен на рисунке 2.

Лабораторные исследования

Биохимические и гормональные исследования проводились в клинико-диагностической лаборатории ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России. Забор крови производился в вакуумные пробирки с инертным гелем. Полученные пробы центрифугировались не позднее чем через 15 мин после забора с использованием центрифуги Eppendorf 5810R при температуре 4 °С на скорости 3000 оборотов в минуту в течение 15 минут и затем поступали в работу. Исследование инсулина, С-пептида осуществлялось методом усиленной хемилюминесценции на анализаторе COBAS 6000 (Roche Diagnostics, Швейцария). Биохимическое исследование крови выполнялось на анализаторе Architect plus C 4000 (Abbott Diagnostics, США).

Выявление иПССП (глибенкламида, гликвидона, гликлазида, глимепирида, глипизида, натеглинида и репаглинида) в образце крови пациента осуществлялось методом ВЭЖХ-МС/МС. Для этого использовали жидкостный хроматограф Agilent 1290 Infinity II (Agilent Technologies, Германия), оснащенный четырехканальным насосом, автосемплером и термостатом колонок, и гибридный трехквадрупольный масс-спектрометр AB Sciex QTrap 5500 (AB Sciex, Сингапур), способный работать в режиме линейной ионной ловушки.

Образцы сыворотки крови готовили методом жидкостной экстракции с высаливанием (SALLE). Для этого к 200 мкл сыворотки добавляли 400 мкл ацетонитрила, перемешивали смесь в шейкере в течение 10 мин., а затем центрифугировали 1 мин. при 14 800 об/мин при 5 ºС. К полученному раствору добавляли 200 мкл 5М ацетата аммония (Fluka, >99%, Нидерланды), перемешивали 3 мин. в шейкере и центрифугировали 2 мин. при 14 800 об/мин и 5 ºС. После этого отбирали 50 мкл верхнего органического слоя, помещали в 96-луночный планшет, добавляли 50 мкл деионизированной воды и перемешивали пипетированием. В таком виде раствор использовали для хромато-масс-спектрометрического анализа.

Хроматографическое разделения компонентов проводили на колонке Accucore PFP 2,1х50 мм, 2,6 мкм диаметр частиц (Thermo Scientific, США). В качестве элюентов были применены ацетонитрил (Honeywell, for LC-MS, Германия) и деионизированная вода (MilliQ Advantage A10, Millipore, Германия). Разделение проводили в градиентном режиме с градиентом органической фазы от 5 до 60% с 1 по 6 мин., с изократическим участком с 6 по 7 мин. на 60% ацетонитрила и возврат на исходные 5% с 7 по 8 мин. с последующим уравновешиванием колонки до 11 мин. Поток элюента составлял 0,4 мл/мин., температура колонки — 20 ºС, объем ввода образца — 20 мкл.

Масс-спектрометрическое детектирование проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM), совмещенного с информационно-зависимым мониторингом (IDA), который был реализован на линейной ионной ловушке. Для ионизации использовали источник химической ионизации при атмосферном давлении (APCI) в режиме положительных ионов. MRM-переходы подбирали для каждого компонента индивидуально путем ввода стандартного образца в хроматографическом потоке непосредственно в источник ионизации и последовательного варьирования параметров фрагментации. Для каждого компонента регистрировали по два MRM-перехода.

Критериями идентичности субстанции из образца пациента с субстанцией в образце контроля считается совпадение времен удерживания в пределах 0,2 мин., соотношение площадей под хроматографическими пиками по двум MRM-переходам для определяемой субстанции, а также совпадение спектров фрагментных ионов для компонента образца и контроля.

Управление анализом, сбор и обработку данных проводили с использованием программного пакета Analyst 1.6.3 (AB Sciex, Канада).

Статистический анализ

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью стандартных методов статистического анализа с использованием программного обеспечения: STATISTICA v. 13 (TIBCO Inc., США). Для количественных признаков указаны медиана и интерквартильный интервал, а также в некоторых случаях минимальное и максимальное значения. С целью сравнения количественных данных двух независимых выборок применялся критерий Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости при проверке статистических гипотез был принят равным 0,05. Для коррекции проблемы множественных сравнений применялась поправка Бонферрони. После применения поправки значения Р в диапазоне между рассчитанным и 0,05 интерпретировались как статистическая тенденция.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ (протокол №1 от 27.01.2016 г.). Все пациенты подписали информированное согласие для участия в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Этап 1. В группы 1 и 2 включено по 7 последовательных пациентов. Возраст пациентов группы 1 составил 59 [ 54; 67] лет, группы 2 — 45 [ 41; 51] лет. В каждую группу включено по 4 женщины и 3 мужчины.

При исследовании образцов крови пациентов группы 1 методом ВЭЖХ-МС/МС в 100% случаев подтвержден прием препарата, который получал больной: n=1-глибенкламид, n=1-гликвидон, n=1-гликлазид, n=1-глимепирид, n=1-глипизид, n=1-натеглинид и n=1-репаглинид. При исследовании образцов крови группы 2 методом ВЭЖХ-МС/МС иПССП не выявлены.

Этап 2. Забор крови на фоне манифестной гипогликемии выполнен 116 пациентам, из них у 38 выявлена гипоинсулинемическая гипогликемия, и эти пациенты были исключены из дальнейшего исследования. У оставшихся 78 пациентов было выполнено визуализирующее обследование с целью поиска инсулин-продуцирующей опухоли: компьютерная томография (КТ) с контрастным усилением и/или МРТ — магнитно-резонансная томография (МРТ) и/или ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости. У 11 пациентов диагностирована гипогликемия неясного генеза (группа 3), а у 67 пациентов — инсулинома (группа 4).

Возраст пациентов группы 3 составил 43 [ 35; 56] года, группы 4 — 51 [ 34; 62] год. В группу 3 включено 9 женщин и 2 мужчин, в группу 4 — 52 женщины и 15 мужчин.

Ложноположительный результат не получен ни у одного пациента из группы 4. Метод идентифицировал иПССП (глибенкламид и гликлазид) в образцах крови 5 из 11 пациентов группы 3 (подгруппа 3а). Хроматограммы двух из таких пациентов представлены на рисунках 3 и 4.

Таким образом, у пациентов групп 1 (n=7) и 3а (n=5) в крови обнаружены препараты иПССП, у пациентов групп 2 (n=7), 4 (n=67) и 3б (n=6) — не обнаружены. Для расчета операционных характеристик метода ВЭЖХ-МС/МС в выявлении иПССП составлена таблица кросс-табуляции частот в объединенных группах: пациенты с СД2, получающие иПССП, и пациенты с НДГ, у которых инсулинома исключена стандартными методами (n=12); пациенты с уточненными причинами НДГ и здоровые (n=80) (таблица 1). Чувствительность метода составила 100%, 95% ДИ (74%; 100%), специфичность — 100%, 95% ДИ (95%; 100%).

С целью выявления дополнительных серологических маркеров АрГ вследствие приема иПССП, которые помогли бы дифференцировать это состояние от лабораторных показателей при инсулиноме, проведен сравнительный анализ показателей инсулина, глюкозы и С-пептида на фоне манифестной гипогликемии в группе 3а (n=5) и в объединенной группе пациентов с инсулиномой (группа 2, n=67) и другими причинами неартифициальной гиперинсулинемической НДГ (группа 3б; n=6). Уровень инсулина в группе 3а был статистически значимо ниже, чем в группе 2+3б, в то время как уровни глюкозы и С-пептида не различались (таблица 2).

При анализе уровня инсулина на фоне манифестной гипогликемии в группе 3а обращало на себя внимание значительное повышение гормона у пациентов №2 и №3 по сравнению с другими больными (табл. 3). Предположено, что на уровень инсулина может влиять наличие инсулинорезистентности у пациента. Для уточнения этой гипотезы у всех больных группы 3а был рассчитан показатель HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) после ночного голодания на фоне нормогликемии, который не превышал показатели нормы 2,7 (табл. 3).

Значительное повышение инсулина (как и С-пептида) у пациента №2 было обусловлено терминальной стадией хронической болезни почек вследствие замедленной элиминации гормонов (особенно С-пептида) [18]. В связи с этим проведен сравнительный анализ показателей С-пептида на фоне манифестной гипогликемии в группе 3а с исключением пациента №2 и объединенной группы 2+3б. Уровень С-пептида в группе 3а (1,82 [1,18; 2,73]) оказался ниже, чем в группе 2+3б (р=0,015, U-тест).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты этапа 1 продемонстрировали возможность применения метода ВЭЖХ-МС/МС в детекции и идентификации субстанций ПССП в клинической практике. При валидации метода в группе пациентов с гиперинсулинемической гипогликемией в рамках этапа 2 нами, как и другими авторами [19][20][21][22], подтверждена высокая диагностическая точность ВЭЖХ-МС/МС в выявлении субстанций ПССП, в том числе при АрГ. Таким образом, метод может быть применен для диагностики преднамеренного приема данной группы лекарственных средств и дифференциальной диагностики с другими причинами гиперинсулинемического варианта НДГ. Однако с учетом относительно редкой встречаемости АрГ среди пациентов без СД (до 3,5%) [23], низкой доступности ВЭЖХ-МС/МС в России (преимущественно в специализированных центрах), рутинное выполнение исследования у всех пациентов с подозрением на НДГ, как предлагается зарубежными экспертами [10], нецелесообразно. Поэтому, по нашему мнению, детекция субстанций ПССП у пациентов с гиперинсулинемической гипогликемией рациональна только при отрицательных результатах стандартных методов визуализации инсулиномы (КТ с контрастным усилением, МРТ, УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства).

Отсутствие возможности выполнения данного исследования во всех эндокринологических стационарах определяет необходимость поиска других, более доступных маркеров АрГ. Несмотря на то, что в нашем исследовании показано, что при АрГ, в отличие других причин гиперинсулинемической гипогликемии, уровень инсулина значимо ниже (8,99 [ 6,05; 16,20]), с учетом небольшого числа пациентов с АрГ эти данные необходимо интерпретировать с осторожностью, требуется дальнейшее накопление материала и проведение исследования на большей группе больных.

Важно отметить, что более низкие показатели инсулина зафиксированы не у всех больных с АрГ. Помимо пациента №2, у которого значительное повышение показателей инсулина и С-пептида (21,39 мкЕд/мл и 23,91нг/мл соответственно) обусловлено терминальной стадией хронической болезни почек, сравнительно высокий уровень инсулина также отмечен у пациента №3 (16,2 мкЕд/мл). Наша версия о возможном влиянии инсулинорезистентности на более высокий показатель инсулина, после подсчета индекса НОМА у всех больных с АрГ, была отклонена — инсулинорезистентность не выявлена ни у одного пациента группы 3а. По нашему мнению, разный уровень инсулина, наиболее вероятно, обусловлен дозой принимаемого препарата или различной чувствительностью к ПССП. В отличие от других авторов [22], мы не проводили количественную оценку содержания субстанций ПССП в крови пациентов, так как это не являлось целью нашего исследования, но может быть полезно, например, для оптимизации тактики ведения при купировании гипогликемии.

Вместе с тем в отношении уровня С-пептида после исключения пациента №2 выявлена статистически значимая разница в группах пациентов с АрГ и другими причинами гиперинсулинемической НДГ (Me уровня С-пептида в группе пациентов с АрГ составила 1,82 [ 1,18; 2,73]). Таким образом, С-пептид в перспективе также может рассматриваться как дополнительный показатель при дифференциальной диагностике данных состояний.

Необходимо подчеркнуть, что нами проводилось определение только 7 субстанций, в отличие от других исследователей [19, 21, 22], которые анализировали наличие в сыворотке крови пациентов большего числа ПССП. Выбор ограниченного числа субстанций обусловлен их доступностью в РФ. По мере появления новых зарегистрированных ПССП следует рассмотреть вопрос об их включении в разработанную нами панель иПССП. Также перспективно исследовать другие ПССП (метформин, дапаглифлозин, вилдаглиптин, лираглутид и пр.), которые мы не включили в испытания из-за их маловыраженного влияния на возможность вызвать манифестную гипогликемию. Но не исключается, что такого эффекта можно достичь, например, при приеме чрезмерно высоких доз данных лекарственных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метод ВЭЖХ-МС/МС обладает высокими диагностическими чувствительностью и специфичностью в обнаружении и идентификации иПССП (глибенкламид, гликвидон, гликлазид, глимепирид, глипизид, натеглинид и репаглинид) в образцах крови пациентов, получающих данные лекарственные препараты. В настоящее время, в силу малой доступности метода, данное исследование целесообразно применять у пациентов с гиперинсулинемической гипогликемией при отрицательных результатах методов визуализации инсулиномы первого ряда.

Требуется проведение дальнейших исследований на расширенной группе больных с АрГ для подтверждения полученных нами данных о возможности использования показателей инсулина и С-пептида на фоне манифестной гипогликемии в качестве дополнительных маркеров данного состояния.

Перспективным направлением дальнейших исследований также является изучение вопроса о включении в разработанную панель иПССП новых сахароснижающих препаратов по мере их регистрации и появления на российском фармацевтическом рынке, а также доступных в настоящее время лекарственных препаратов, не относящихся к группам производных сульфонилмочевины или глинидов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075 — 15 — 2022 — 310 от 20.04.2022).

Участие авторов: Юкина М.Ю. — разработка концепции исследования; проведение обследования участникам исследования; сбор материала; участие в проведении лабораторного обследования; получение, анализ и интерпретация результатов; написание статьи; Трошина Е.А. и Мельниченко Г.А. — согласование концепции исследования; внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи; Нуралиева Н.Ф. — участие в сборе материала; подготовка статьи к публикации; Иоутси В.А. — проведение лабораторного обследования участников исследования; Реброва О.Ю. — внесение существенной (важной) правки в анализ и интерпретацию результатов; Мокрышева Н.Г. — одобрение финальной версии рукописи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.