Влияние глибенкламида на функциональную активность К_АТФ-каналов церебральных артерий у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом

Для стойкого снижения уровня глюкозы в крови больных сахарным диабетом 2 типа (СД2) широко применяют производные сульфомочевины, в том числе глибенкламид [1][2]. Механизм действия глибенкламида заключается в следующем. АТФ-чувствительные калиевые каналы (K_ATP-каналы) β-клеток поджелудочной железы — это гетерооктамеры, состоящие из четырех субъединиц Kir6.2 и четырех субъединиц SUR1. Посредством сульфомочевинной и бензамидной групп глибенкламид связывается с рецептором SUR1 и дезактивирует К_АТФ-канал. Ингибирование К_АТФ-каналов приводит к деполяризации клеточной мембраны, входу Ca²⁺ в β-клетки через открывшиеся кальциевые каналы и высвобождению Ca²⁺ из внутриклеточных депо в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях. Повышение концентрации Ca²⁺ в цитозоле β-клеток активирует выход инсулина в кровь. Однако глибенкламид является блокатором К_АТФ-каналов в клетках всего организма, в том числе и в сердечно-сосудистой системе. При СД2 высок риск развития ишемических и лакунарных инсультов головного мозга и церебральной ангиопатии. Основной причиной ухудшения кровообращения при метаболическом синдроме (МС) и СД2 считается эндотелиальная дисфункция — дисбаланс в выработке вазодилататоров/вазоконстрикторов, активация процессов тромбообразования и воспаления [3]. Ранее показано, что при развитии МС и СД2 в стенках церебральных сосудов может откладываться β-амилоидный белок, вызывая повреждение эндотелиальных клеток и, как следствие, уменьшение выработки NO и снижение чувствительности артерий к ацетилхолину [4]. К эндотелиальной дисфункции также приводят инсулинорезистентность (ИР) и хроническая гипергликемия. Инсулин в высокой концентрации вызывает пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток, пролиферацию фибробластов, активацию системы свертывания крови, снижение активности фибринолиза [5]. При хронической гипергликемии глюкоза вступает во взаимодействие с белками и липидами крови с образованием продуктов гликирования [6]. Связывание конечных продуктов гликирования с базальной мембраной сосудистой стенки приводит к ее утолщению, снижению эластичности, развитию воспалительной реакции и повреждению эндотелиальных клеток [7][8]. Но патологические изменения реактивности церебральных сосудов могут происходить и из-за сбоя в работе ионных каналов эндотелиальных и гладкомышечных клеток (ГМК) [9][10]. Посредством К_АТФ-каналов в значительной мере регулируется сосудистый тонус [11]. В литературе данных о влиянии СД2 на функционирование К_АТФ-каналов мозговых артерий представлено мало, и эти данные очень противоречивы. Одни авторы утверждают, что К_АТФ-каналы не участвуют в формировании сосудистого тонуса при СД2 [9], другие — что блокирование К_АТФ-каналов негативно сказывается на постинсультном состоянии нейронов у больных СД2 [10]. Вопрос о влиянии глибенкламида на мозговую циркуляцию у больных СД2 в настоящее время остается открытым.

ЦЕЛЬ

Оценить влияние глибенкламида на реактивность церебральных артерий у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом (СТЗ-СД).

В рамках представленного исследования были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1. Изучить изменение функционального состояния К_АТФ-каналов пиальных артерий при СТЗ-СД. 2. Оценить влияние глибенкламида на участие К_АТФ-каналов в формировании базального тонуса и эндотелий-зависимой дилатации пиальных артерий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на животных из ЦКП «Биоколлекция ИФ РАН для исследования интегративных механизмов деятельности нервной и висцеральных систем» (Санкт-Петербург). Исследования проводили в соответствии с этическими стандартами, утвержденными правовыми актами РФ, принципами Базельской декларации и требованиями Комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (протокол №04/12 от 12.04.2022 г.). Крыс содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище по 6 особей в клетках Т4 в условиях искусственного освещения (цикл: 12 часов свет/12 часов темнота).

Дизайн

В экспериментальной работе были использованы линейные крысы — самцы Sprague Dawley, возраст которых в начале работы составлял 3 месяца, вес 400–420 г, 54 особи. Изначально были сформированы 2 пула животных: контрольные животные (содержались на стандартном комбикорме для лабораторных животных (Тосненский комбикормовый завод. Россия)) (Группа 1, 18 особей) и крысы, которые в течение двух месяцев получали высокожировую диету (ВЖД). ВЖД включала стандартный комбикорм (370 г/кг) и добавки в виде жира свиного (313 г/кг), казеина (253 г/кг), витаминно-минеральной смеси (61 г/кг): 58% жира, 25% белка, 17% углеводов [12][13]. Перед использованием все компоненты корма тщательно перемалывались, и из смеси формировались гранулы, подобные стандартному комбикорму. Через 2 месяца крысам, у которых моделировали СТЗ-СД (Группа 3, 18 особей), был введен внутрибрюшинно панкреотоксичный препарат стрептозотоцин в концентрации 35 мг/кг (Sigma-Aldrich, USA). Часть животных, находящихся на ВЖД, без введения стрептозотоцина являлась второй контрольной группой (Группа 2, 18 особей). Еще 1 месяц животные из групп 2 и 3 получали ВЖД. Графики изменения веса крыс из экспериментальных групп и уровня глюкозы в крови представлены на рис. 1.

Затем животные из всех экспериментальных групп были протестированы на толерантность к глюкозе с помощью глюкозо-толерантного теста (ГТТ) и на инсулинорезистентность с помощью инсулин-толерантного теста (ИТТ) (по 6 особей из каждой группы) [14] (рис. 2).

ГТТ проводили после 16-часового голодания при свободном доступе к воде. В начале эксперимента измеряли уровень глюкозы в крови из хвостовой вены с помощью глюкометра Акку-Чек Актив («Рош Диабетс Кеа ГМбХ», Германия). Затем внутрибрюшинно вводили углеводную нагрузку из расчета 2 г глюкозы на килограмм веса. Далее измерения уровня глюкозы в крови проводили через 30, 60 и 120 мин. ИТТ проводили после 4-часового голодания крыс. После фонового измерения уровня глюкозы в крови животным подкожно вводили инсулин (ООО «Завод Медсинтез», Россия) в дозе 0,75 Ед/кг. Уровень глюкозы в крови измеряли через 15, 30, 60 и 120 мин.

После эвтаназии у животных тщательно изымали висцеральный жир и определяли его вес. Висцеральная жировая ткань у грызунов включает в себя мезентериальную (располагается по ходу кишечника), забрюшинную (располагается за почками) и эпидидимальную (располагается вдоль семенников) жировую ткань [15].

Удельный вес висцерального жира в группах 1, 2 и 3 составлял 2,1±0,3%, 4,5±0,5% (*p≤0,05 относительно группы 1) и 6,1±0,3% (***p≤0,0001 относительно группы 1) соответственно.

Эксперименты проводились на наркотизированных (золетил (Virbac, Франция) (20 мг/кг) внутрибрюшинно) животных; для эвтаназии использовали повышенную дозу наркоза.

Метод прижизненного микроскопирования

Для проведения прижизненного исследования реакций пиальных артерий в теменной области черепа животного на площади примерно 1 см² удаляли кость и твердую мозговую оболочку. Во время эксперимента поверхность мозга непрерывно орошали раствором Кребса-Хенселейта (pH 7,4, температура 38 °C) и контролировали среднее АД [16]. Прямое измерение среднего АД производили через канюлю в бедренной артерии. Среднее АД составляло 125±2 мм рт.ст., 131±3 мм рт.ст. и 135±5 мм рт.ст у животных из 1, 2 и 3 групп соответственно. Температуру тела крысы поддерживали на уровне 38 ^оC. Экспериментальная установка состояла из стереоскопического микроскопа MC-2ZOOM («Микромед», Россия), цветной камеры — видеоокуляра для микроскопа DCM-510 (Scopetek, Китай) и персонального компьютера. Диаметры сосудов измеряли на статических изображениях, используя программу «Photo M», разработанную для цитофотометрии (автор А. Черниговский, http://www.t_lambda.chat.ru). У каждой крысы измерения проводились не менее чем на 50 артериях, которые были разбиты на группы: 60–80 мкм, 40–60 мкм, 20–40 мкм, менее 20 мкм. Исходным значением считали диаметр сосуда без воздействия (орошение раствором Кребса-Хенселейта: в мМ: NaCl 120,4; KCl 5,9; NaHCО3 15,5; MgCl2 1,2; CaCl2 2,5; NaH2PO4 1,2; глюкоза 11,5; pH 7,4), аэрированного карбогеном). В качестве вазореактивных препаратов использовали раствор ацетилхолина (AСh) (10^-7М/л, 8 мин) (Sigma-Aldrich, USA) в растворе Кребса-Хенселейта. После 20-минутной отмывки поверхности мозга раствором Кребса-Хенселейта и повторной фиксации диаметров при этом воздействии на поверхность мозга наносили раствор блокатора К_АТФ-каналов глибенкламида (Glybenclamide, Sigma-Aldrich, 10 мкМ, 10 мин) в диметилсульфоксиде (DMSO, Sigma–Aldrich, США) (GB) или раствор активатора К_АТФ-каналов пинацидила (Pinacidil monohydrate, Sigma–Aldrich, 200 мкМ, в растворе DMSO, 5 мин) (PI). Концентрация растворителя DMSO составляла 0,1% и не влияла на реактивность исследуемых сосудов [16]. На последнем этапе эксперимента на поверхность мозга наносили раствор AСh в глибенкламиде или пинацидиле. В статистическую обработку были отобраны сосуды, у которых изменение диаметра превышало 5% от исходного [16].

Статистический анализ данных

Математический анализ данных проведен с помощью статистических программ Microsoft Excel 2003 и InStat 3.02 («GraphPad Software Inc.», США). Данные представлены в виде среднего арифметического значения и его ошибки. Сравнение двух групп при нормальном распределении (проверка с помощью критерия Колмогорова-Смирнова) проводили с использованием непарного t-теста. Достоверным уровнем отличий считали вероятность не менее 95% (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты микроциркуляторного исследования показали, что под воздействием блокатора К_АТФ-каналов глибенкламида (GB) у крыс из группы СТЗ-СД число сузившихся пиальных артерий уменьшилось в 1,3–1,9 раза относительно контрольных животных (Группа 1). При этом с контрольной группой крыс, находящихся на ВЖД (Группа 2), статистически значимой разницы по числу констрикций не выявлено (рис. 3А), кроме мельчайших артерий диаметром менее 20 мкм.

На рис. 4 на примере крупных (диаметром 40–60 мкм) и мелких (диаметром менее 20 мкм) пиальных артерий представлено влияние глибенкламида на эндотелий-зависимую дилатацию. У контрольных животных из группы 1 при применении ACh на фоне действия GB (ACh + GB) число расширившихся артерий уменьшилось в 2,2–3,5 раза по сравнению с воздействием чистого ACh. У животных из группы 2 (ВЖД) не выявлено значимой разницы в числе дилатаций на ACh и ACh + GB (данные не показаны). В группе СТЗ-СД GB также не влиял на ACh-опосредованную дилатацию пиальных артерий.

На рис. 5 представлено сравнение числа расширившихся пиальных артерий на воздействие пинацидила (PI) и пинацидила на фоне ацетилхолина (PI+ACh).

Результаты показали, что в контрольной группе 1 применение AСh на фоне действия PI привело к увеличению числа расширившихся артерий по сравнению с чистым PI (рис. 5). В контрольной группе 2 (ВЖД) не выявили статистически значимой разницы по числу дилатаций при воздействии на поверхность мозга растворами AСh, PI и PI+AСh (данные не показаны). В группе СТЗ-СД число сузившихся артерий под воздействием GB в 1,3–1,5 раза меньше, чем расширившихся под воздействием PI (кроме мельчайших артерий диаметром менее 20 мкм) (рис. 3А и 5). AСh-опосредованная дилатация на фоне действия PI не выявлена (рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

К_АТФ-каналы являются определяющим звеном в поддержании тонуса церебральных артерий посредством регуляции внутриклеточной концентрации Са²⁺ [10][11]. Результаты нашей работы показали, что после формирования у крыс СТЗ-СД под воздействием глибенкламида сузилось 20–40% пиальных артерий, что в 1,3–1,9 раза меньше, чем у крыс из контрольной группы 1 (рис. 3А). С контрольной группой 2 (ВЖД) разницы в реакции на GB не выявлено, за исключением артерий с исходным диаметром менее 20 мкм. Воздействие GB может быть снижено из-за дезактивации K_ATP-каналов мозговых артерий или понижения их плотности в сосудистой стенке. Блокирование K_ATP-каналов при СД2 может происходить по нескольким причинам. Гипергликемия приводит к повышению концентрации глюкозы в цитозоле эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Это, в свою очередь, вызывает повышение уровня АТФ, которая присоединяется к Kir6.1 единице и тем самым закрывает K_ATP-канал [17]. Но мы видим уменьшение числа констрикций пиальных артерий на воздействие GB и в группе животных, которые потребляли только высокожировой корм без введения им стрептозотоцина. Следовательно, можно предположить, что доминирующую роль в блокировании K_ATP-каналов пиальных артерий играет не уровень глюкозы в крови, а окислительный стресс. Как при ВЖД, так и при СД2, увеличивается количество субстратов окисления (глюкозы и липидов) и уменьшается образование и понижается активность антиоксидантных систем, таких как глутатион, супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионовая пероксидаза [18]. В результате реакции между супероксид анионом и оксидом азота образуется пероксинитрит (ONOO⁻) [19], который, с одной стороны, активирует К_АТФ-каналы и кальций-чувствительные калиевые каналы большой проводимости. Далее происходит гиперполяризация клеточной мембраны, расслабление ГМК и увеличение диаметра артерий. С другой стороны, ONOO⁻ вступает в реакцию с сульфгидрильными группами в составе молекул К_АТФ-каналов, тем самым понижая их функциональную активность [20], что приводит к констрикторной реакции артериальных сосудов. Вероятно, плотность К_АТФ-каналов в сосудистой стенке церебральных артерий при развитии СТЗ-СД уменьшается, но функционирующие К_АТФ-каналы есть и они принимают участие в поддержании базального тонуса мозговых сосудов. По нашим данным, у животных из группы СТЗ-СД глибенкламид блокировал меньшее число К_АТФ-каналов, чем активировал PI (в 1,5–1,3 раза, за исключением артерий диаметром менее 20 мкм) (рис. 3А, рис. 5). Следовательно, помимо функционирующих, имеются заблокированные, но не поврежденные К_АТФ-каналы, которые потенциально могут быть активированы и задействованы в регуляции сосудистой реактивности.

Открытие К_АТФ-каналов ГМК с выходом ионов К⁺ из клетки — одно из составляющих в формировании эндотелий зависимой дилататорной реакции пиальных артерий. У контрольных животных GB блокировал AСh-зависимую дилатацию на 45–71% в зависимости от диаметра артерий (рис. 4). На фоне действия активатора К_АТФ-каналов пинацидила число дилатаций на AСh было статистически значимо выше, чем на чистый PI (рис. 5). Следовательно, расслабление ГМК может происходить за счет активации других сигнальных путей, например посредством Са²⁺ — активируемых калиевых каналов, потенциал-зависимых калиевых каналов и т.д. [21]. У контрольных крыс, находящихся на ВЖД, не было выявлено статистически значимой разницы по числу дилатаций пиальных артерий на воздействие чистого AСh и AСh на фоне блокады К_АТФ-каналов (рис. 4) или между PI и PI+ AСh (рис. 5). Вероятно, у животных на ВЖД для поддержания базального сосудистого тонуса задействованы все функционирующие К_АТФ-каналы. В формировании эндотелий-зависимой дилатации церебральных артерий эти каналы у данной группы животных практически не принимают участия. В литературе представлены данные, что при употреблении больших количеств калорийной пищи в сосудистой стенке мозговых сосудов откладывается β-амилоидный пептид и развивается β-амилоидная ангиопатия [22][23]. β-амилоид нарушает функционирование митохондрий, вызывает деградацию клеточных мембран, нарушает транспорт ионов [24]. В более поздних работах было установлено, что β-амилоидная ангиопатия затрагивает и К_АТФ-каналы [25], понижая их функциональную активность, хотя данный механизм до конца не изучен [26].

Применение глибенкламида не повлияло на AСh-опосредованное расширение пиальных артерий у крыс из группы СТЗ-СД (рис. 4). Можно предположить, что К_АТФ-каналы практически не принимают участия в формировании эндотелий-зависимой дилатации церебральных артерий и в этом процессе задействованы другие сигнальные пути [21]. Однако, в отличие от контрольной группы 1, число дилатаций пиальных артерий на PI +AСh примерно такое же, как на PI, т.е. расширение сосудов идет преимущественно за счет открывания К_АТФ-каналов. Налицо явное противоречие. Тут следует вспомнить, что СД2 приводит к эндотелиальной дисфункции и уменьшению выработки NO посредством каскада L-аргинина/еNOS/NO. При СТЗ-СД NO производится в основном за счет iNOS [27], т.е. имеет место не эндотелий-зависимая дилатация. Изучение механизмов реактивности церебральных сосудов при СТЗ-СД является следующей задачей авторского коллектива.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У крыс со СТЗ-СД К_АТФ-каналы принимают участие в формировании базального тонуса пиальных артерий, но вклад этих каналов снижен в среднем в 1,5 раза по сравнению со здоровыми крысами.

Применение глибенкламида при СТЗ-СД не влияет на эндотелий-зависимую дилатацию церебральных артерий.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования — госбюджет. Работа выполнена при поддержке Госпрограммы 47 ГП «Научно-технологическое развитие Российской Федерации» (2019–2030 гг.), тема 0134-2019-0001.

Конфликта интересов относительно публикации этой статьи не существует.

Участие авторов. Соколова И.Б. — концепция и дизайн исследования, сбор данных, обработка данных, написание и редактирование статьи; Лобов Г.И. — концепция исследования, редактирование и финальное утверждение рукописи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.