Оксидативный стресс и система протеолиза при сахарном диабете 2 типа

Сахарный диабет 2 типа (СД2) — хроническое заболевание, характеризующееся нарушением углеводного обмена с развитием гипергликемии, спровоцированное инсулинорезистентностью, а также секреторной дисфункцией β-клеток поджелудочной железы. По данным Регистра пациентов с сахарным диабетом, за 2017 г. в России зарегистрировано 4,5 млн человек, из них 94% имеют СД2 [1].

Патофизиологические механизмы, лежащие в основе сосудистых дисфункций при диабете, включают дисбаланс ингибиторного звена, повышенную выработку активных форм кислорода и протромботических факторов, что создает провоспалительный/тромботический потенциал для атеросклеротического поражения сосудов и развития сердечно-сосудистых осложнений [2][3].

Окислительный стресс — это стремительное усиление окислительных процессов в организме при ограниченном функционировании антиоксидантной системы. Избыточная продукция гидроперекисей угнетает транспорт электронов по дыхательной цепи митохондрий и β-окисление жирных кислот.

Супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) является главным антиоксидантным ферментом «первой линии защиты» клеток и тканей, который нейтрализует супероксидный анион — радикал кислорода с помощью реакции дисмутации. Известно, что СОД способствует эпителиально-мезенхимному переходу раковых клеток поджелудочной железы посредством активации пути H2O2/ERK/NF-κB, повышению инвазивной и миграционной активности рака поджелудочной железы [4].

Еще одним ферментом первого звена внутриклеточной защиты от активных форм кислорода является каталаза (КФ 1.11.1.6). Каталаза осуществляет гетеролитическое расщепление О–О-связи в перекиси водорода. Увеличение уровня маркеров окислительного стресса было обнаружено при раке поджелудочной железы и хронических панкреатитах. Образование активных форм кислорода, повреждающих липиды и белки, является общепризнанным фактом при развитии многих заболеваний [5][6].

В условиях окислительного стресса возрастает концентрация битирозина — одного из маркеров окислительной модификации белков. Под действием активных форм кислорода образовавшиеся фенокси-радикалы димеризуются с образованием битирозинов, что приводит к образованию белковых сшивок.

Активность эластазо- и трипсиноподобных протеиназ регулируется α₁-протеиназным ингибитором (α₁-ПИ). α₁-ПИ относят к белкам «острой фазы», данная функция подтверждается резким увеличением активности ингибитора при неспецифической реакции воспаления, что направлено на торможение избыточного протеолиза. Данный ингибитор обладает широким спектром действия и обеспечивает 90–92% общей антипротеазной активности плазмы крови. α₁-ПИ угнетает активность трипсина, эластазы, химотрипсина и других сериновых ферментов, инактивирует окислительные свойства нейтрофилов, тем самым проявляя свою противовоспалительную и иммуномодулирующую функции [7–10]. В активном центре α₁-ПИ находится метионин, окисление которого под действием активных форм кислорода приводит к инактивации ингибитора. Однако окисленный α₁-ПИ способен напрямую взаимодействовать с клетками, высвобождая хемокины IL-8 и MCP-1, которые, в свою очередь, привлекают макрофаги и нейтрофилы, потенцируя реакции воспаления [11]. Таким образом, повреждение активного центра в молекуле α₁-ПИ в процессе оксидативного стресса приводит к неконтролируемому росту активности протеолитических ферментов.

Сериновые протеиназы синтезируются в ацинарных клетках поджелудочной железы — трипсин (КФ 3.4.21.4), химотрипсины А и В (КФ 3.4.21.1), ­химотрипсин С (КФ 3.4.21.2). Сравнительно недавно для трипсина открыты и внутриклеточные эффекты: стимулирование пролиферации и дифференцировки клеток, ангиогенеза, неопластической трансформации клеток [12]. Эти эффекты опосредуются специфическими протеиназо-активируемыми рецепторами (PARs). Увеличение активности трипсиноподобных протеиназ выявлено при заболеваниях желудочно-кишечного тракта: панкреатите, панкреонекрозе, гастритах, колитах, гепатитах [13].

Панкреатическая экзокринная недостаточность — частое явление при диабете 1 и 2 типа, проявляется межацинарным фиброзом от слабого до выраженного, скудным воспалительным инфильтратом, изменением протоков поджелудочной железы и гиалинизацией артерий [14].

Маркером воспаления является нейтрофильная эластаза (КФ 3.4.21.37), активность которой возрастает в очаге повреждения ткани. Значение эластазы в воспалении связано с гидролизом поврежденных структур: эластина, протеогликанов, адгезивных белков соединительной ткани. В поджелудочной железе присутствует панкреатическая эластаза (КФ 3.4.21.36), гликопротеин с молекулярной массой, равной 28 000 Да, активируемый трипсином [15].

Активация трипсином рецепторов, активируемых протеиназами-2 (PAR2), при СД2 приводит к микрососудистым осложнениям, таким как диабетическая нефропатия, гломерулосклероз и др. Активация рецепторов, активируемых протеиназами-1 (PAR1), стимулирует ангиогенез при пролиферативной диабетической ретинопатии [16].

Дефицит ингибиторов протеиназ в плазме крови больных СД2 может сопровождаться более тяжелым течением заболевания с поражением большего количества β-клеток поджелудочной железы [7].

Таким образом, роль и механизм повреждения α₁-протеиназного ингибитора, а в дальнейшем рост активности протеолитических ферментов в комплексе с показателями оксидативного стресса недостаточно изучены при СД2.

Цель

Изучить процессы оксидативного стресса и активность системы «протеиназы-ингибиторы» при СД2.

Материалы и методы

Проведено исследование плазмы крови пациентов с СД2 и контрольной группы (практически здоровые лица). У всех обследуемых в плазме крови спектрофотометрическим методом определялась активность эластазо-, трипсиноподобных протеиназ, содержание α₁-протеиназного ингибитора, активность СОД, каталазы, содержание ТБК-активных продуктов и битирозина.

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое одномоментное выборочное исследование с участием пациентов с СД2 и контрольной группы (практически здоровые лица) (рис. 1).

Критерии соответствия

Критерии включения в группу больных СД2: диагноз СД2, который был впервые поставлен в возрасте 30 лет или старше.

Условия проведения

Набор пациентов проводился в условиях стационара на базе факультетских и госпитальных клиник ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск. Определение изучаемых показателей производилось на кафедре биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск.

Продолжительность исследования

Взятие материала для исследования производилось при поступлении в клиники одномоментно. Контрольную группу (практически здоровые лица) составили лица, проходившие диспансеризацию без диагноза СД2.

Описание медицинского вмешательства

Производилось взятие крови из локтевой вены с дальнейшим получением плазмы крови при помощи центрифугирования. Пациентами было подписано информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Основной исход исследования

Данный вид инвазивного медицинского вмешательства является безопасным и является экономически приемлемым, т.к. взятие крови производится по показаниям госпитализации пациента, а также входит в обязательную процедуру прохождения плановой диспансеризации с дальнейшим определением биохимических показателей согласно половозрастной категории пациента.

Анализ в подгруппах

Группа пациентов с диагнозом СД2: средний возраст: мужчины — 48±5 лет (n=12), женщины — 52±6 лет (n=20).

Контрольная группа (практически здоровые лица): средний возраст: мужчины — 35±2 года (n=15), женщины — 34±1 год (n=15).

Методы регистрации исходов

В работе были использованы спектрофотометрические методы определения активности протеиназ по гидролизу синтетических субстратов.

Активность трипсиноподобных протеиназ определяли по гидролизу N-бензоил-L-аргинин-этилового эфира (БАЭЭ) по увеличению оптической плотности при 253 нм. Активность трипсиноподобных протеиназ выражали в нмоль гидролизованного БАЭЭ в 1 мин на 1 мл биологической жидкости. Активность эластазоподобных протеиназ измеряли по скорости гидролиза ρ-нитрофенилового эфира N-бутилоксикарбонил-L-аланина (БАНЭ) при 347,5 нм и рассчитывали в нмоль гидролизованного БАНЭ в 1 мин на 1 мл биологического материала. Активность α₁-протеиназного ингибитора определяли по торможению БАЭЭ-эстеразной активности трипсина и выражали в условных ингибиторных единицах на 1 мл плазмы крови (ИЕ/мл). 1 ИЕ соответствует торможению ­гидролиза 1 мкмоль БАЭЭ [8].

Измерение содержания ТБК-активных продуктов проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой при длине волны 540 нм в мкмоль/мл [5]. Активность СОД оценивали по торможению реакции окисления раствора адреналина с рН=10,2 при 480 нм. За единицу активности СОД принимали количество фермента, вызывающего 50% торможение окисления адреналина. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли по торможению распада перекиси водорода, по образованию окрашенного комплекса с молибдатом аммония при 410 нм и рассчитывали мкмоль/мин×г белка [5]. Концентрацию битирозина измеряли по интенсивности флюоресценции (в условных единицах — усл. ед.) при длине волны 415 нм, длина волны возбуждения — 325 нм. Измерялась флюоресценция на спектрофлуориметре «Флюорат 02-АБЛФ-Т», Россия. Регистрация оптической плотности исследуемых показателей производилась на спектрофотометре «СФ-2000», Россия.

Статистический анализ

Для оценки полученных данных, их сравнения и выявления статистически значимых различий между группами были использованы электронные таблицы Excel 2016 и пакет прикладных программ STATISTICA 23.0. Проверка на нормальность распределения производилась с помощью критерия Шапиро–Уилка. Далее проводилось сравнение с контрольной группой при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Корреляционный анализ проводили с применением ранговой корреляции Спирмена.

Этическая экспертиза

Проведение исследования было одобрено ЛЭК Сибирского государственного медицинского университета (протокол №6 от 19.04.2020). Все испытуемые, включенные в исследование, подписывали информированное согласие.

Результаты

Объекты (участники) исследования

Клинико-анамнестическая характеристика исследуемых групп представлена в табл. 1. Более 30% обследованных пациентов с СД2 имели гипертоническую болезнь, ишемическую болезнь сердца, хроническую сердечную недостаточность, ретинопатию (табл. 1).

Основные результаты исследования

Активность трипсиноподобных протеиназ при СД2 возросла в 2,3 раза (р<0,05). Активность эластазоподобных протеиназ увеличилась в 1,2 раза. Активность α₁-протеиназного ингибитора снизилась на 23% по отношению к контрольной группе (табл. 2).

Активность СОД у пациентов с СД2 увеличилась в 8,2 раза, каталазы — в 6,4 раза. Содержание ТБК-активных продуктов в плазме крови возросло в 2,34 раза, а битирозина — в 7 раз по отношению к контрольной группе (табл. 3). Следует отметить, что среди двух универсальных реакций организма, к которым относятся активация ПОЛ и окислительная модификация белков, преимуществом с более выраженным изменением характеризуется окислительная модификация белков по сравнению с содержанием ТБК-активных продуктов.

Между активностью эластазо- и трипсиноподобных протеиназ выявлена прямая корреляционная зависимость (табл. 4). Отслеживается положительная корреляция между активностью эластазоподобных протеиназ и ­показателем окислительной модификации белков (содержание битирозина). Наблюдается обратная зависимость α₁-ПИ от активности эластазоподобных протеиназ, а также прямая зависимость от активности трипсиноподобных протеиназ. Следует отметить, что между активностью ингибитора и содержанием битирозина выявлена отрицательная корреляция (рис. 2), что подтверждает инактивацию активного центра α₁-протеиназного ингибитора в условиях окислительного стресса. При этом у практически здоровых лиц подобная корреляция отсутствовала.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Таким образом, со стороны системы протеолиза наблюдается увеличение активности протеолитических ферментов (эластазо- и трипсиноподобные протеиназы), чего нельзя сказать об α₁-протеиназном ингибиторе, активность которого снижается. Активность оксидативного стресса при СД2 многократно возрастает, что подтверждается увеличением содержания ТБК-активных продуктов на фоне возрастания активности антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза) и битирозина. Обнаружена положительная корреляция между показателями окислительного стресса. Максимальная сила связи наблюдается между активностью каталазы и концентрацией ТБК-активных продуктов.

Обсуждение основного результата исследования

В результате активации окислительного стресса происходят накопление его продуктов (ТБК-активные продукты) и продуктов окислительной модификации белков (битирозин), активация антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД) по механизму автономной регуляции, а именно регуляция активности фермента уровнем субстрата или продуктом реакции [15]. Под действием активных форм кислорода происходит повреждение активного центра α₁-ПИ, данный механизм подтверждается увеличением уровня окисленных модифицированных белков (битирозина). Обоснованием этого является наличие обратной зависимости активности α₁-ПИ от содержания битирозина — продукта окислительной модификации белков. Дефицит α₁-ПИ приводит к более выраженной активации протеолиза при СД. Коэффициент корреляции между эластазо- и трипсиноподобными протеиназами и α₁-ПИ показывает значительно высокую отрицательную связь, это свидетельствует о нарушении контроля протеолиза. Дефицит α₁-ПИ в плазме крови больных СД2 может сопровождаться более тяжелым течением заболевания с поражением большего количества β-клеток поджелудочной железы чрезмерной активацией протеолитических ферментов [7–9][17].

Заключение

Таким образом, активация протеолиза и окислительный стресс являются универсальными реакциями при СД2. Запускающим звеном активации протеолиза являются свободные радикалы, которые образуются в процессе оксидативного стресса и оказывают цитолизирующее действие на клетки, окисление активного центра ингибитора протеиназ. Снижение активности α₁-ПИ сопровождается дисбалансом в системе «протеиназы-ингибиторы» и неконтролируемым ростом активности ферментов протеолиза, что может иметь существенное значение для развития осложнений СД2.