Течение сахарного диабета (СД) типа MODY2, обусловленного гетерозиготными мутациями в гене глюкокиназы (GCK), долгие годы может оставаться бессимптомным. Глюкокиназа (гексокиназа IV, глюкозо-6-фосфотрансфераза) – фермент, принадлежащий к семейству гексокиназ, который катализирует первую реакцию гликолитического метаболического пути – фосфорилирование глюкозы в глюкозо-6-фосфат в гепатоцитах и β-клетках поджелудочной железы (ПЖ). Глюкокиназа играет важную роль в регуляции секреции инсулина, являясь связующим звеном между уровнем гликемии и началом секреции инсулина [1]. Вследствие мутаций в GCK нарушается способность глюкокиназы фосфорилировать глюкозу и, как результат, увеличивается минимальная концентрация глюкозы, необходимая для стимуляции выброса инсулина, но секреторный ответ инсулина на стимуляцию глюкозой всегда сохранен.

Во время беременности по мере созревания плаценты нарастает инсулинорезистентность, в связи с чем гипергликемия у пациентов с GCK-MODY2 часто выявляется при пренатальном скрининге I или III триместров. Диагностика случаев GCK-MODY2 в структуре гестационного сахарного диабета (ГСД) необычайно важна, так как это определяет тактику ведения пациентов во время беременности и в послеродовом периоде [2].

В последние годы молекулярно-генетический анализ, в том числе и при моногенных формах СД, становится все более рутинным, особенно после внедрения технологии секвенирования следующего поколения (NGS). С одной стороны, это значительно упрощает возможности диагностики, с другой – все возрастающий объем данных делает затруднительной оценку патогенности выявляемых изменений нуклеотидной последовательности, так как наряду с известными мутациями, с доказанной связью с наследственной патологией, нередко детектируются изменения, достоверно оценить вклад которых в ту или иную патологию сразу невозможно. Американским обществом медицинской генетики (American College of Medical Genetics, ACMG) [3] и российским обществом генетиков [4] предложены системы оценки патогенности нуклеотидных вариантов, в соответствии с которыми последние ранжированы на 5 категорий: доброкачественные, вероятно доброкачественные, варианты с неопределенной значимостью, вероятно патогенные и патогенные. К первым двум категориям (т.е. клинически незначимым изменениям) в соответствии с используемыми критериями относятся и так называемые «синонимичные» мутации, при которых замена одного нуклеотида на другой в кодирующей части гена теоретически не должна приводить к изменению аминокислотной последовательности белка.

В представленной работе приводится описание клинического случая ГСД, ассоциированного с синонимичным вариантом в гене GCK, патогенность которого была подтверждена функциональными исследованиями in vitro.

Беременная Л., 22 лет. Впервые повышение гликемии в биохимическом анализе крови до 6,7 ммоль/л было выявлено в возрасте 8 лет, в связи с чем проведен оральный глюкозотолерантный тест (ОГТТ), по результатам которого диагностировано нарушение толерантности к глюкозе. В 13 лет при очередном обследовании НbА1с – 6,0%, по данным ОГТТ, гликемия натощак 5,6 ммоль/л, на 120 минуте – 11,2 ммоль/л. Установлен диагноз «Сахарный диабет». Маркеры аутоиммунного сахарного диабета (антитела (АТ) к островковым клеткам (islet cell antibodies, ICA), тирозинфосфатазе (cytoplasmic islet cell antibody, IA-2A), глутаматдекарбоксилазе (glutamic acid decarboxylase antibodies, GADA)) – отрицательные. Далее пациентка придерживалась диеты с ограничением легкоусвояемых углеводов. Дальнейшее обследование в 16 лет, когда при уровне глюкозы венозной плазмы натощак 7,0 ммоль/л С-пептид – 140 пмоль/л (референсные значения 100–1010), инсулин – 31 пмоль/л (референсные значения 15–180).

На сроке беременности 6–7 нед (первый пренатальный скрининг) выявлено повышение уровня глюкозы в биохимическом анализе крови – 6,1 ммоль/л, диагностирован ГСД, рекомендовано соблюдение диеты с исключением легкоусвояемых углеводов. На этом фоне показатели гликемии натощак – до 5,5 ммоль/л, через 1 ч после еды – до 7,5 ммоль/л. После 22-й недели беременности отмечалось периодическое повышение показателей гликемии натощак до 5,6 ммоль/л, обусловленное нарушением диеты. На сроке беременности 29 нед: гликемия натощак 6,1–6,4 ммоль/л, через 1 ч после еды максимально до 8,0 ммоль/л при адекватном режиме питания. Общая прибавка массы тела за 29 нед – 17 кг (вес до беременности 63 кг, ИМТ = 21,8 кг/м2). По данным УЗИ плода на сроке 29 нед 3 дня выявлена тенденция к крупному плоду: окружность груди (ОГ) – 289 мм, окружность живота (ОЖ) – 276 мм, предполагаемая масса плода (ПМП) – 1873 г (>90 перцентилей). Проведено непрерывное мониторирование гликемии системой iPro2, по данным которого подтверждено повышение гликемии натощак и постпрандиально (рис. 1). С 30-й недели беременности инициирована инсулинотерапия в базис-болюсном режиме: инсулин пролонгированного действия детемир 16 ЕД (0,2 Ед/кг) в 22.00 с последующим постепенным увеличением дозы до 24 Ед в связи с повышенными показателями гликемии утром натощак, инсулин ультракороткого действия аспарт по 4 Ед перед завтраком, обедом и ужином за 15 минут до еды (0,43 Ед/кг). На фоне инсулинотерапии и диеты к 33-й неделе беременности достигнуты целевые показатели гликемии: натощак – до 5,1 ммоль/л, через 1 ч после еды – до 7,0 ммоль/л (рис. 2). Дальнейшей коррекции доз инсулина не требовалось.

Рис. 1. Суточное мониторирование гликемии пациентки Л. до назначения инсулинотерапии.

Рис. 2. Суточное мониторирование гликемии пациентки Л. после назначения инсулинотерапии.

Родоразрешение на 39 нед через естественные родовые пути. При рождении вес ребенка (девочка) – 3280 г (-0,02 SD), рост – 51 см (+0,91 SD). В возрасте 3 мес при измерении сахара крови у ребенка зафиксирована гипергликемия 6,2 ммоль/л (голодный промежуток 3 ч).

Семейный анамнез (рис. 3).

Рис. 3. Родословная семьи пациентки Л.: СД - сахарный диабет.

Дед по линии отца, 55 лет, инфаркт миокарда (I.2). Гипергликемия до 8,0 ммоль/л впервые зафиксирована при обследовании по поводу перенесенного инфаркта в возрасте 45 лет. На фоне приема пероральных сахароснижающих препаратов (ПССП), без соблюдения диеты показатели гликемии в течение дня – до 9,0 ммоль/л.

Отец пробанда, 49 лет (II.2). В возрасте 16 лет выявлена гипергликемия. При ОГТТ гликемия натощак 7,2 ммоль/л, на 120-й минуте – 10,4 ммоль/л. Диету не соблюдал. В возрасте 25 лет повторно обследован: уровень аутоантител отрицательный, С-пептид 0,2 пмоль/л (0,36–1,7), аглюкозурия. Далее наблюдался эндокринологом с диагнозом «СД 2 типа». Гликемия в течение дня на фоне обычного режима питания достигала 16,0 ммоль/л, НbА1с – 7,8%.

Дядя пробанда, 43 года (II.3). Повышение гликемии натощак до 7,2 ммоль/л выявлено в 34 года. К эндокринологу не обращался, дополнительного обследования не проходил.

Двоюродный брат, 11 лет (III.3). В возрасте 1 года 9 мес проведено обследование в связи с полиурией: в биохимическом анализе крови повышение гликемии натощак 6,5 ммоль/л, после еды – 9,9 ммоль/л, НbА1с – 6,6%, аглюкозурия. При уровне гликемии 6,7 ммоль/л (период голодания 6,5 ч) С-пептид – 0,03 нмоль/л (0,1–1,01), инсулин – 8,0 пмоль/л (10–120), АТ ICA, IAA, GADA – отрицательные. Гликемия, по данным непрерывного суточного мониторирования уровня гликемии (Continuous Glucose Monitoring System, CGMS), достигала 10 ммоль/л, в связи с чем в возрасте 2 лет 1 мес был назначен продленный инсулин (гларгин) в дозе 2 Ед/сут – 0,12 Ед/кг. В возрасте 2 лет 9 мес к терапии добавлен короткий инсулин (актрапид) в связи с постпрандиальной гликемией до 14,9 ммоль/л.

Отсутствие аутоиммунных маркеров СД 1 типа, данные семейного анамнеза (см. рис. 3) позволили предположить наличие у пациентки моногенной формы СД. При проведении молекулярно-генетического исследования методом NGS (методика описана ранее [5]) выявлен редкий гетерозиготный вариант в кодоне V222 гена GCK (NM_000162: c.666C>G p.V222V; ExAC MAF, 0.0001). Аналогичный вариант был подтвержден при проведении секвенирования по Сэнгеру у родственников пробанда, имеющих нарушения углеводного обмена (см. рис. 3).

Согласно существующим рекомендациям [3, 4], данный синонимичный вариант следовало классифицировать как «вероятно доброкачественный», что ставило под сомнение его связь с выявленными нарушениями углеводного обмена. Между тем в предыдущем исследовании в эксперименте in vitro с использованием технологии «минигена» было показано, что трансверсия c.666C>G в экзоне 6 гена GCK может быть причиной нарушения процесса сплайсинга (исследование проведено в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, под руководством д.б.н., г.н.с. Рубцова П.М., описано ранее [6]). Данная нуклеотидная замена приводит к появлению нового донорного сайта сплайсинга и образованию измененной мРНК с делецией 16 пар нуклеотидов (рис. 4). Таким образом, дополнительные экспериментальные данные позволили переклассифицировать вариант с.666C>G р.V222V с «вероятно доброкачественного» в «патогенный» [3, 4].

Рис. 4. Хроматограммы с результатами секвенирования продуктов сплайсинга, полученных in vitro с использованием технологии «минигена» [5]. WT – фрагмент последовательности транскрипта дикого типа; c663_678del – фрагмент транскрипта с делецией 16 пар нуклеотидов как результат синонимичного варианта c.666C>G.

По оценкам некоторых авторов, патогенный эффект не менее чем 15% диагностируемых мутаций обусловлен полными или частичными нарушениями механизма сплайсинга, а не только аминокислотными заменами в затронутых кодонах [7, 8], при этом доля внутриэкзонных патогенных вариантов, согласно биоинформатическим исследованиям, может достигать 25% [9, 10]. О существовании таких механизмов следует помнить при интерпретации данных молекулярно-генетических исследований. Как демонстрирует представленный нами клинический пример, именно синонимичная мутация, первоначально интерпретированная как «вероятно доброкачественная» нуклеотидная замена, была причиной снижения функции глюкокиназы и нарушения углеводного обмена у пациентки с ГСД и ее прямых родственников. Подтверждение функциональной значимости выявленной в гене GCK синонимичной замены позволит избежать назначения медикаментозной терапии и достичь целевых показателей гликемии на фоне диетотерапии в послеродовом периоде, а также обеспечить персонализированный подход к сахароснижающей терапии при планировании последующих беременностей нашей пациентки.

В настоящем сообщении подчеркивается важность тщательной клинической оценки всех случаев моногенных форм СД, проанализированных методом NGS. В случае характерных фенотипических проявлений и отягощенной в нескольких поколениях наследственности показано проведение дополнительных функциональных методов исследования для оценки патогенности вариантов, первично классифицированных как «возможно доброкачественные».

Источник финансирования. Исследование частично выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10408). Результаты изучения сплайсинга in vitro получены в рамках Программы фундаментальных исследований государственных академий наук на 2013–2020 годы (тема № 01201363822).

Согласие пациентов. Пациентка добровольно подписала информированное согласие на публикацию персональной медицинской информации в обезличенной форме в журнале «Сахарный диабет».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Н.А. Зубкова, Н.А. Макрецкая, А.Н. Тюльпаков – концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, написание текста; Л.И. Ибрагимова, Е.В. Васильев – сбор материала, анализ полученных данных; А.Н. Тюльпаков, Н.А. Макрецкая, Е.В. Васильев, П.М. Рубцов – проведение молекулярно-генетического исследования. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.