Выполнить предварительную оценку безопасности и эффективности геннотерапевтической конструкции, представляющей собой сверхскрученную форму плазмиды pl-VEGF165, кодирующей эндотелиальный сосудистый фактор роста (VEGF) в составе комплексного лечения пациентов с нейроишемической формой СДС в формате пилотного исследования.

Дизайн исследования

Исследование было спланировано как интервенционное двухцентровое проспективное неконтролируемое неослепленное. Дизайн представлен на рис. 1.

Рис. 1. Дизайн пилотного клинического исследования (схема): ЛПИ – лодыжечно-плечевой индекс; ТКНК – транскутанное напряжение кислорода; НДС – нейропатический дисфункциональный счет; НСС – нейропатический симптоматический счет; НЯ – нежелательные явления; СНЯ – серьезные нежелательные явления.

Критерии соответствия

Пилотное клиническое исследование проводилось с участием больных с нейроишемической формой СДС (n=35).

Критерии включения:

Критерии невключения:

Условия проведения

Набор пациентов осуществлялся в Московской области на базе Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской области «Видновская районная клиническая больница» и в Рязани на базе Рязанского медицинского университета. Набор пациентов в клиническое исследование происходил из числа больных, которые находились на стационарном лечении в условиях клиник этих учреждений.

Продолжительность исследования

Продолжительность исследования составила 6 мес с контрольными сроками обследования: при включении в исследование, 14, 30, 90 и 180 сут (см. рис. 1). В промежутках между визитами в исследовательский центр все пациенты находились на амбулаторном лечении у эндокринолога и хирурга по месту жительства; периодичность осмотров определялась индивидуально в зависимости от особенностей течения.

Описание медицинского вмешательства

Препарат сохранялся в виде лиофилизата, который разводился в 5 мл воды для инъекций непосредственно перед применением. Раствор вводился внутримышечно, в мышцы голени, двукратно, по 1,2 мг с интервалом 14 дней (суммарная доза 2,4 мг), в ходе 4–5 инъекций (согласно инструкции по применению). Пациенты получали стандартную комплексную терапию в соответствии с «Алгоритмами специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом» по ведению нейроишемической формы СДС, включавшую применение разгрузки конечности в виде разгрузочного полубашмака или индивидуальной разгрузочной повязки, местного лечения, контроля гликемии и т.д. [8]. Применение цилостазола и простагландинов было исключено не менее чем за 3 мес до включения в исследование.

Основной исход исследования

Выполнить предварительную оценку безопасности и эффективности pl-VEGF165 в составе комплексного лечения пациентов с нейроишемической формой СДС в формате пилотного исследования.

Методы регистрации исходов

В качестве первичного критерия эффективности была использована площадь язвенного дефекта, оцениваемая путем планиметрии (см2), вторичного – ТКНК, ЛПИ. Для оценки влияния ангиогенной терапии на выраженность диабетической нейропатии (ДН) в динамике были использованы стандартная шкала нейропатического симптоматического счета (НСС), нейропатический дисфункциональный счет (НДС), а также Мичиганский опросник для скрининга нейропатии. Стадия язвенного дефекта определялась по классификации Вагнера; согласно ей, при 1 стадии отмечается развитие поверхностной язвы (подкожные структуры не вовлечены); при 2 стадии – распространение язвы на глубоколежащие ткани без вовлечения костных структур. Выполнялась оценка количества летальных исходов и ампутаций за весь период наблюдения. Во время скрининга пациентам выполнялись ЭКГ, клинический и биохимический анализы крови, исследование свертывающей системы крови, анализ мочи с целью выявления сопутствующих и фоновых заболеваний.

Этическая экспертиза

Все пациенты перед включением в исследование были информированы о целях и задачах исследования, потенциальной пользе от участия и возможных рисках. Основанием для проведения пилотного клинического исследования явились разрешения локального этического комитета Рязанского медицинского государственного университета (№2 от 02.10.2014) и Видновской районной клинической больницы (№13 от 06.10.2014). Международный идентификатор на ClinicalGovTrial: NCT02538705.

Статистический анализ

Проведение статистического анализа было выполнено с использованием программы IBM SPSS Statistics 23.0.0.0. Для описания качественных данных рассчитывали абсолютные (n) и относительные значения (%). Анализ соответствия вида распределения признака в каждой группе закону нормального распределения проводился с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для выявления различий между измерениями показателей площади язвенного дефекта, ЛПИ, ТКНК, НСС, НДС, Мичиганского опросника нейропатии в разное время с учетом небольшой величины выборок применили критерий Уилкоксона, оценивающий медианную разность двух выборок, с уровнем значимости 0,05. Результаты были представлены с указанием медианы, первого и третьего квартилей, а также абсолютной величины достигнутого уровня значимости (р). Показатели возраста, продолжительности СД, существования язвенного дефекта и гликированного гемоглобина соответствовали нормальному распределению, их значения указаны в виде М±m.

Исходные характеристики пациентов пилотного исследования

У большей части пациентов был длительный анамнез СД – в среднем 11,9 года (табл. 1). Продолжительность существования язвенного дефекта до включения в исследование составила 3,4 мес, что свидетельствует о хроническом течении раневого процесса и резистентности к проведению комплексного лечения. По глубине поражения преобладала 2 стадия по Вагнеру, которая определялась у 66% больных. При этом медиана площади раневого дефекта составила 3,6 [1,0; 7,5] см2 (рис. 2).

Рис. 2. Динамика площади язвенного дефекта (см2): * – различие между показателем и предыдущим значением статистически значимо (p<0,01).

Таблица 1. Исходные показатели пациентов

Примечания: СД – сахарный диабет; ЛПИ – лодыжечно-плечевой индекс; ТКНК – транскутанное напряжение кислорода; НДС – нейропатический дисфункциональный счет; НСС – нейропатический симптоматический счет.

Оценка безопасности

Осложнений, связанных с применением pl-VEGF165, зарегистрировано не было. Развитие опухолей, нарушения зрения и иные патологические состояния, которые могли бы косвенно свидетельствовать об осложнениях ангиогенной терапии, не были выявлены на всех сроках обследования. Трем пациентам была выполнена ампутация нижней конечности на уровне бедра в связи с прогрессированием ишемии (n=2) и развитием анаэробной инфекции (n=1); двум – в пределах стопы. К концу наблюдения у 4 из 5 пациентов раны зажили первичным натяжением, у одного пациента определялось сохранение раневого дефекта. Таким образом, сохранность целевой конечности к концу 6 мес наблюдения составила 84% (табл. 2).

Таблица 2. Распределение серьезных нежелательных явлений в клинической группе пилотного исследования.

Оценка эффективности

Применение pl-VEGF165 в составе комбинированного лечения позволило добиться полного закрытия ран у 66% пациентов (n=23), несмотря на длительное предшествующее существование язвенного дефекта на фоне проведения стандартного комплексного лечения. При этом заживление большей части из них (n=15) наблюдалось на сроке 3 мес. Напротив, отсутствие положительного эффекта к этому времени являлось неблагоприятным прогностическим фактором – как правило, у этой категории больных открытая рана сохранялась и к концу исследования или была выполнена ампутация (табл. 3).

Таблица 3. Динамика заживления язвенного дефекта, n (%)

К концу 1-го месяца после введения первой дозы pl-VEGF165 у 68% пациентов (n=24) отмечалось уменьшение площади менее чем на 30%, при этом среднее значение снизилось с 3,6 [1,0; 7,05] см2 до 3,35 [1,0; 6,1] см2 (p=0,006). В течение следующих 2 мес у большей части больных отмечалась положительная динамика репаративной регенерации тканей в области язвы, что привело к полному заживлению ран у 42% больных (n=15). Медиана площади язвенного дефекта к концу 3 мес сократилась с 3,6 [1,0; 7,05] см2 до 1,05 [0,0; 4,1] (p=0,001), к концу исследования – до 0,0 [0,0; 2,0] см2. Средняя скорость заживления на протяжении всего исследования составила 2,1 мм2/сут. При этом скорость заживления в течение первых 30 сут была 0,9 мм2/сут, с последующим увеличением до 3,4 мм2/сут с 30 до 90 сут. Начиная с 90-х суток было отмечено снижение скорости заживления до 1,7 мм2/сут. Учитывая продолжительное время существования раны до включения в исследование, такая тенденция сокращения площади и эпителизации свидетельствует об изменении условий репаративной регенерации тканей (см. рис. 2).

ЛПИ к концу исследования возрос на 19%, с 0,96 [0,82; 1,08] до 1,16 [0,85; 1,24] (p=0,062), что, по-видимому, объясняется изменением периферического сосудистого сопротивления на фоне проводимого лечения. Несмотря на наличие небольшой положительной динамики показателя на фоне лечения, различия значений не достигли статистической достоверности. У 3 пациентов, несмотря на наличие ишемического компонента вследствие поражения дистального кровеносного русла, данный показатель изначально был выше 1,0, что может быть связано с выраженным кальцинозом сосудистой стенки. На фоне применения терапевтического ангиогенеза определялось улучшение перфузии тканей стопы, что выражалось в возрастании напряжения кислорода с 35,0 [29,5; 40,5] до 40,5 [36,0; 46,5] мм рт.ст. (p=0,005), при этом наибольший прирост наблюдался в течение первых 3 мес.

На фоне применения ангиогенной терапии через 6 мес отмечалось умеренное, но значимое снижение выраженности клинических признаков ДН – показатели НСС и НДС снизились соответственно с 6,5 [5,75; 8,0] до 6,0 [5,25; 7,0] (p=0,001) и с 9,0 [8,0; 13,5] до 8,0 [7,0; 12,7] (p=0,004). Объективно пациенты отмечали снижение выраженности судорог и чувства онемения. В отдельных случаях было отмечено появление температурной чувствительности через неделю после второй инъекции pl-VEGF165 и частичное восстановление болевой чувствительности (табл. 4).

Таблица 4. Результаты оценки вторичных критериев эффективности в пилотном исследовании

Примечания: ЛПИ – лодыжечно-плечевой индекс; ТКНК – транскутанное напряжение кислорода; НДС – нейропатический дисфункциональный счет; НСС – нейропатический симптоматический счет.

Мировой опыт применения ангиогенных препаратов у больных СДС насчитывает лишь несколько исследований, поэтому основной задачей настоящей работы была оценка безопасности генноопосредованной индукции ангиогенеза у пациентов с СД. Впервые этот подход был реализован в ходе 1–2 фазы клинических исследований Ad-5PDGF-B (GAM501) у 15 пациентов с хроническими язвами при нейропатической форме СДС, которым геннотерапевтическая конструкция на основе вируса наносилась на язвенный дефект в составе коллагенового геля. Это не сопровождалось развитием нежелательных реакций, но при этом полного закрытия на фоне комбинированного лечения удалось добиться у 12 из 15 пациентов [9, 10]. В другом исследовании применение плазмиды с геном HGF (VM202) у пациентов с критической ишемией нижних конечностей обеспечило достоверное увеличение частоты заживления дефектов кожных покровов стопы и не сопровождалось развитием осложнений. При этом исследование показало, что применение индукции ангиогенеза было наиболее эффективно у пациентов с СД, которые составили 60% участников [11]. Отечественные исследования с участием больных хронической ишемией нижних конечностей показали, что у пациентов с фоновым СД локальная индукция ангиогенеза в нижних конечностях не сопровождается развитием нежелательных явлений [12]. Таким образом, результаты настоящего пилотного исследования подтверждают ранее накопленные доказательства безопасности ангиогенной терапии у пациентов с СД.

Площадь язвенного дефекта была выбрана как основной критерий эффективности потому, что в обычной клинической практике уменьшение размера язвы и/или ее полное закрытие часто определяет, достигнут ли успех лечения пациента с СДС или нет [13]. Однако использование этого показателя ассоциировано с применением жестких критериев включения, определяющих, пациенты с какими именно язвенными дефектами могут быть включены в исследование, так как скорость и исход репаративной регенерации зависят от большого количества факторов. Например, результаты исследования с участием 261 больного СДС показал, что среднее время заживления язвенного дефекта составляет 49 дней, однако наличие раневой инфекции или остеомиелита сопровождается увеличением сроков заживления в среднем до 83 и 115 дней. В то же время у пациентов с преобладанием ишемического компонента среднее время заживления составило 58 дней, а при его отсутствии – 46 [14]. Ввиду этого включение в настоящее пилотное исследование пациентов с неглубокими язвенными дефектами 1–2 стадии по Вагнеру было обусловлено стремлением нивелировать многочисленные факторы, которые влияют на процесс репаративной регенерации, и достичь, таким образом, максимальной объективности при оценке влияния генноопосредованной индукции ангиогенеза на сроки заживления язвенного дефекта.

Результаты настоящего исследования показали, что наибольшая скорость сокращения язвенного дефекта наблюдалась в интервале между 30 и 90 сут – то есть через месяц после введения pl-VEGFA, что может быть обусловлено отсроченным действием генной индукции ангиогенеза. Напротив, снижение средней скорости заживления в интервале времени между 90 и 180 сут, а также отсутствие заживления к концу 3-го месяца лечения может являться проявлением ограниченного срока действия препарата вследствие разрушения плазмидной конструкции и, как следствие, ограниченного периода экспрессии целевого белка – VEGF. В то же время отдельные исследования выделяют прогностические факторы заживления язвенного дефекта, которые могут быть ассоциированы с исходными условиями репаративной регенерации. Например, уменьшение площади язвенного дефекта на 50% к концу 4-й недели является прогностическим критерием заживления раны через 12 нед. Напротив, отсутствие заживления к этому сроку сопровождается достоверным увеличением частоты ампутации [15]. Таким образом, уже к концу 3-го месяца после введения pl-VEGFA можно выделить категорию пациентов, у которых применение ангиогенной индукции может оказаться неэффективным ввиду не только ограниченного периода экспрессии целевого белка, но и исходных изменений сосудистой стенки, нарушений репаративной регенерации, которые настолько выражены, что не могут быть скорректированы при помощи генной индукции ангиогенеза. Однако эта гипотеза, безусловно, требует подтверждения на более крупных группах пациентов.

Показатель ЛПИ широко применяется в повседневной практике как экспресс-метод диагностики заболеваний периферических артерий у пациентов с облитерирующим атеросклерозом. В отдельных работах показано, что этот показатель может быть также использован как прогностический фактор заживления язвенного дефекта у больных СДС. Так, метаанализ 11 клинических исследований показал, что ЛПИ менее 0,5 достоверно чаще ассоциирован с вероятностью резистентного течения раневого процесса и ампутации нижней конечности [16]. Несмотря на небольшое увеличение показателя на фоне генноопосредованной индукции ангиогенеза, различия не достигли статистической достоверности, что может быть обусловлено малым объемом выборки в данном исследовании. По-видимому, в рамках данной работы применение ЛПИ как критерия эффективности оказалось малоинформативным ввиду исходно высокого значения показателя ЛПИ из-за выраженного кальциноза артерий. Вследствие этого интерпретация увеличения среднего показателя ЛПИ затруднена – ответ на вопрос, является ли это следствием применения ангиогенной терапии или нет, требует проведения более крупных исследований.

В отдельных работах было показано, что применение генной терапии способно обеспечить снижение выраженности проявлений ДН. В первом плацебо-контролируемом исследовании с участием больных СД было показано, что введение плазмиды с геном VEGF в проекции седалищного, малоберцового и большеберцового нервов обеспечивает значимое улучшение показателя шкалы SS и не приводит к развитию нежелательных явлений [17]. Активным компонентом препарата VM202 является плазмида с генами двух изоформ HGF. В ходе 1-й фазы клинического исследования с участием 12 пациентов с болевой формой ДН была доказана безопасность и хорошая переносимость ангиогенной терапии с использованием дозировок 4 мг, 8 мг и 16 мг [18]. Во 2-й фазе двойного слепого плацебо-контролируемого клинического исследования с участием 100 пациентов с болевой формой ДН использовались дозировки 16 мг и 32 мг. Препарат вводился двукратно с интервалом 2 нед в процессе 16 и 32 инъекций соответственно. В качестве первичного критерия эффективности использовался среднесуточный показатель шкалы боли относительно базального уровня, вторичных – показатель визуальной аналоговой шкалы, качества жизни, а также интраэпидермальная плотность нервных волокон по данным щипковой биопсии на уровне бедра и голени с интервалом в 6 мес. Применение генного препарата не сопровождалось увеличением частоты развития нежелательных явлений, при этом по первичному критерию было достигнуто статистически значимое различие [19]. Результаты настоящего исследования показали, что на фоне применения генноопосредованной индукции ангиогенеза наблюдалось снижение выраженности проявлений ДН, что выражалось в улучшении показателей шкал НСС и НДС. Как известно, субъективные части шкал могут улучшаться вследствие купирования воспаления и уменьшения отека тканей.

В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что генная индукция ангиогенеза pl-VEGF165 может быть использована в составе комплексного лечения пациентов с СДС, в том числе при невозможности выполнения реваскуляризации и нарушении репаративной регенерации язвенного дефекта – введение препарата было безопасно и не сопровождалось развитием нежелательных явлений. Результаты показали, что pl-VEGFA воздействует как на ишемический, так и нейропатический компонент заболевания. Это позволяет рассматривать его как средство патогенетической терапии, которое обладает многокомпонентным эффектом в отношении данной нозологии. Однако для трансляции полученных данных на общую популяцию пациентов с СДС необходимо проведение крупных рандомизированных исследований.

Ограничения исследования

Ограничением данного исследования является открытый дизайн, что увеличивает вероятность появления систематической ошибки в интерпретации симптомов и признаков в ведении пациентов, возникающей, когда лечение пациента заранее известно. Выбор подобного дизайна обусловлен тем, что генноиндуцированный ангиогенез ранее никогда не применялся у данной категории пациентов, ввиду чего основной целью работы была предварительная оценка безопасности и эффективности на небольшом количестве пациентов. Также ограничением исследования является то, что запланированные методы инструментальной оценки некоторым пациентам применялись не на всех сроках обследования, что было обусловлено техническими сложностями (отсутствие комплектующих, специалистов и т.д.).

Результаты показали, что применение генноопосредованной индукции ангиогенеза pl-VEGF165 у пациентов с СДС не сопровождалось развитием осложнений, связанных с индукцией ангиогенеза. На фоне применения pl-VEGF165 у большей части пациентов удалось достичь заживления язвенных дефектов, несмотря на отсутствие технической возможности выполнения реваскуляризирующей операции вследствие характера поражения дистального кровеносного русла. Это сопровождалось улучшением перфузии мягких тканей стопы по данным ТКНК и снижением выраженности нейропатического компонента. Таким образом, генноопосредованная индукция ангиогенеза у пациентов с СДС может являться одним из компонентов комплексного лечения этой категории пациентов. Дальнейшее подтверждение эффективности этого подхода требует проведения рандомизированных сравнительных исследований на больших группах пациентов.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке компании-разработчика ПАО «Институт стволовых клеток человека».

Конфликт интересов. А.А. Исаев – акционер компании-разработчика ПАО «Институт стволовых клеток человека»; Р.В. Деев и И.Л. Плакса – сотрудники ПАО «Институт стволовых клеток человека».

Участие авторов. Плакса И.Л. – проведение мониторинга клинического исследования; Мжаванадзе Н.Д. – набор пациентов и сбор данных; Сучков И.А. – разработка дизайна исследования; Калинин Р.Е. – анализ данных, полученных в ходе исследования; Бакунов М.Ю. – набор пациентов в клиническое исследования и анализ данных; Кривихин В.Т. – разработка дизайна исследования; Матвеев С.А. – консультирование на этапе разработки дизайна протокола клинического исследования; Исаев А.А. – координация проекта; Деев Р.В. – координация проекта. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.