Целью настоящего исследования явилась оценка влияния контролируемого перехода от гипергликемии к эугликемии и затем к гипогликемии на индуцированную агрегацию тромбоцитов, активность физиологических антикоагулянтов и фактора Виллебранда (фВб) у пациентов с СД1 без макро- и микрососудистых осложнений.

Обследовано 11 пациентов с СД1: 6 мужчин и 5 женщин в возрасте 23,7±5,6 лет с продолжительностью заболевания 11,7±2,3 года без микро- и макрососудистых осложнений (табл. 1). Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Таблица 1. Клиническая характеристика больных

Из исследования исключались пациенты, у которых имелись указания:

Гликированный гемоглобин (HbA1с) определялся в капиллярной крови методом высокоэффективной жидкостной катионной хроматографии на анализаторе «Dia Stat» фирмы «Bio-Rad» (Германия). Уровень экскреции альбумина с мочой – методом иммунотурбидиметрии на биохимическом анализаторе «НITACHI 912» (Roche) с использованием диагностических наборов Tina-Quant A ALBUMIN.

Протокол исследования включал контролируемый переход от гипергликемии к эугликемии и затем к гипогликемии с взятием крови в конце каждого этапа гликемии. В зависимости от варианта инсулинотерапии больные были разделены на 2 подгруппы: 1) пациенты, находившиеся на интенсифицированной инсулинотерапии в базис-болюсном режиме путем повторных ежедневных подкожных инъекций при помощи индивидуальных ручек-шприцов и 2) пациенты, находившиеся на постоянном подкожном введении инсулина ультракороткого действия с помощью инсулиновой помпы. В первой подгруппе гипергликемия достигалась посредством уменьшения дозы продленного инсулина перед сном. Во второй подгруппе гипергликемия достигалась путем снижения базальной скорости введения инсулина на 50% за 4 ч до проведения процедуры.

Гиперинсулинемический гипогликемический клэмп проводился пациентам, пришедшим натощак (8–12 ч без приема пищи). Исследование начиналось в 9.00. Контролируемая гликемия достигалась при помощи одномоментного введения генно-инженерного человеческого инсулина короткого действия с гиперинсулинемической скоростью (1 мЕд/кг/мин; часть пациентов требовали коррекции гипергликемии, ввиду чего дополнительно болюсно внутривенно вводился инсулин короткого действия (ИКД) 3–8Ед)) и 20% раствор глюкозы. Контроль гликемии осуществлялся каждые 5 мин на этапе эугликемии и каждые 3–5 мин во время гипогликемии, с оценкой клинического состояния пациентов, в том числе переносимости гипогликемии.

Для оценки уровня глюкозы кровь бралась из локтевой вены в микрокювету анализатора глюкозы HemoCue 201+. Первое взятие крови проводилось на фоне исходной гипергликемии (15,0±2,9 ммоль/л). Далее в течение 70–100 мин достигалась эугликемия (глюкоза 4,3±0,3 ммоль/л), которая продолжалась 20–25 мин, в конце которой проводился забор крови (2-е взятие крови). Затем в течение 20–30 мин достигалась гипогликемия (глюкоза 2,4±0,2 ммоль/л), которая в зависимости от ее переносимости продолжалась 20–30 мин, после чего также проводилось взятие крови (3-е взятие крови).

Анализ гемостаза включал исследование индуцированной агрегации тромбоцитов, активности протеинов С и S, концентрации антитромбина III и фВб.

Для исследования агрегации тромбоцитов забор крови проводился в вакуумные пробирки. В качестве антикоагулянта использовался гирудин в концентрации 15 мкг/мл фирмы Verum Diagnostica GmbH, Германия. Образцы исследовались в течение 15–20 мин после взятия крови. Агрегация тромбоцитов определялась методом импедансной агрегометрии в цельной крови in vitro на 5-канальном полуавтоматическом импедансном агрегометре Multiplate (Verum Diagnostica GmbH, Германия) с использованием реактивов фирмы Dynabyte GmbH, Германия. Исследовалась агрегация тромбоцитов на коллаген (COLtest), тромбин (TRAPtest), аденозиндифосфат – АДФ (ADFtest), ристоцетин (RISTOtest) и арахидоновую кислоту (ASPItest). При анализе агрегации рассчитывалась площадь под агрегационной кривой (рис. 1) как показатель, наиболее полно отражающий тромбоцитарную активность.

Рис. 1. Агрегационная кривая с использованием системы Multiplate. Примечания: AU – агрегация; AUC – площадь под кривой.

Антикоагулянты и фВб определялись методом иммуноферментного анализа с измерением оптической плотности на анализаторе Multilabel Counter (Victor-2) фирмы PerkinElmer, США. Расчет концентрации проводился с помощью программного обеспечения MultiCalc. Забор крови осуществлялся в вакуумные пробирки с 3,8% р-ром цитрата натрия в качестве антикоагулянта. Кровь центрифугировалась при 2500 g в течение 15 мин, и образцы плазмы хранились при температуре -20ºС в течение 2 мес.

Работа выполнена в 2017 г.

Локальный комитет по этике Первого МГМУ им И.М. Сеченова одобрил исследование. Выписка из протокола № 04-15 заседания локального комитета по этике от 15.04.2015.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программы SPSS 22.0 for Windows. Описательные статистические данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала (Me [Q1;Q3]). Для сравнения результатов трех и более связанных групп по количественному признаку использовался непараметрический дисперсионный анализ (критерий Фридмана) с дальнейшим парным сравнением групп при помощи непараметрического теста Вилкоксона (W-кр). Критический уровень значимости (p) для проверки статистических гипотез при сравнении статистических показателей принимался менее 0,05.

Агрегация с коллагеном (COLtest) приводит к активации фосфолипазы С с последующей секрецией тромбоцитарных гранул и синтезом тромбоксана А2. Исходно на фоне гипергликемии агрегация тромбоцитов на коллаген составила 36.6% [21.5; 69.2], что было достоверно (р=0,028) ниже нормы (N=46–117). В конце периода эугликемии достоверных изменений в агрегации тромбоцитов на коллаген по сравнению с гипергликемией не отмечалось (р=0,48, табл. 2). В конце периода гипогликемии агрегация на коллаген достоверно повышалась по сравнению с эугликемией (р=0,005) и по сравнению с гипергликемией (р=0,005) и достигала нормативных показателей (табл. 2).

Таблица 2. Индуцированная агрегация тромбоцитов (%)

Примечания: Агрегация на коллаген: р1–3=0,005*; р2–3=0,005*; р1–2=0,475; Агрегация на тромбин: р1–3=0,047**; р2–3=0,007**; р1–2=0,169; Агрегация на АДФ: р2–3=0,028***; р1–2=0,126; р1–3=0,139; Агрегация на арахидоновую кислоту: р1–3=0,017****;р2–3=0,168; р1–2 =0,284; Агрегация на ристоцетин: р1–3=0,042****; р2–3=0,628; р1–2=0,241

Агрегация с тромбином (TRAPtest) отражает потенциальную способность тромбоцитов к агрегации. В качестве индуктора агрегации выступает белок TRAP-6, активирующий рецептор тромбина PAR-1. Агрегация на тромбин в состоянии гипергликемии составила 110.5% [82.2; 139.0] и не отличалась от нормативных показателей лаборатории (N=84–128). При анализе агрегации на фоне эугликемии достоверных отличий по сравнению с гипергликемией не отмечено (р=0,17, см. табл. 2). В конце периода гипогликемии отмечалось повышение агрегации тромбоцитов по сравнению с эугликемией (р=0,027) и с гипергликемией (р=0,021).

Действие АДФ (ADFtest) в качестве индуктора агрегации опосредуется через связывание с рецепторами P2Y12 тромбоцитов. Исходно на фоне гипергликемии агрегация тромбоцитов на АДФ составила 60.5% [44.7; 91.7], что было в пределах нижней ¼ нормативных показателей лаборатории (N=57–113). На этапе эугликемии агрегация достоверно не изменялась по сравнению с гипергликемией (см. табл. 2). После достижения гипогликемии наблюдалось повышение агрегации по сравнению с эугликемией (р=0,015) и с гипергликемией (р=0,028, см. табл. 2), в то же время отличий от нормативных показателей не было достигнуто.

Агрегация с арахидоновой кислотой (ASPItest) сопровождается активацией фосфолипазы С и последующим образованием вторичных посредников, мобилизацией внутриклеточного Са2+ и высвобождением эндогенной арахидоновой кислоты. Агрегация тромбоцитов на арахидоновую кислоту в состоянии гипергликемии составила 68.0% [48.5; 94.0], что было достоверно ниже (р=0,031) нормативных показателей лаборатории (N=71–115). В конце эугликемического периода достоверных отличий по сравнению с гипергликемией не отмечено (р=0,24, см. табл. 2). В конце периода гипогликемии агрегация тромбоцитов повышалась по сравнению с эугликемией (р=0,028) и с гипергликемией (р=0,037) (см. табл. 2).

Агрегация с ристоцетином (RISTOtest) вызывает vWF- и GpIb-зависимую агрегацию тромбоцитов. На фоне гипергликемии показатели агрегации на ристоцетин составили 24,0% [11,5;50,0] и были достоверно ниже (р=0,0029) нормативных значений (N=98–180). В конце периода эугликемии достоверных отличий от гипергликемии не отмечалось. При достижении гипогликемии различия с гипергликемией становились достоверными (см. табл. 2), однако показатели агрегации на ристоцетин, тем не менее, оставались значительно ниже нормы.

Протеин S – это витамин К-зависимый гликопротеин с массой 70 кДа, который в основном синтезируется гепатоцитами, а также эндотелиальными клетками, клетками Лейдига в семенниках и мегакариоцитами. Функционально активным является свободный протеин S, который выступает как кофактор при активации протеина С [23]. Кроме этого, свободный протеин S самостоятельно проявляет антикоагулянтную активность, замедляя активацию Х фактора [23]. На фоне гипергликемии активность свободного протеина S составила 76.3% [61.0; 84.5], что было в границах нижней ¼ нормативных показателей (N=60–150). В конце периода эугликемии активность свободного протеина S не менялась по сравнению с гипергликемией (табл. 3). В конце гипогликемии активность свободного протеина S достоверно повышалась по сравнению с эугликемией (р=0,046) и гипергликемией (р=0,046, табл. 3), выходя за верхние границы нормы.

Таблица 3. Уровень физиологических антикоагулянтов и фактора Виллебранда

Примечания: протеин S: р1–3=0,046#; р2–3=0,046#; антитромбин–III: р1–3=0,049*; р2–3=0,047#

Протеин С играет важную роль в процессе активации белков в каскаде свертывания крови. Его активированная форма в связи с протеином S гидролизует связанные с фосфолипидами факторы Vа и VIIIа [24]. Исходно на фоне гипергликемии активность протеина С составила 101.2% [82.8;117.4] и не отличалась от нормативных показателей (N=70–130). В конце периода эугликемии и затем гипогликемии активность протеина С не менялась по сравнению с исходным состоянием (см. табл. 3) и оставалась в пределах нормативных значений.

Антитромбин III (AT-III) – физиологический антикоагулянт, ингибитор всех сериновых протеаз (тромбин, факторы IХа, Ха, ХIIа, калликреин, плазмин, урокиназа), вовлеченных в процесс свертывания крови [25]. Исходно концентрация АТ-III составила 493.3 мкг/л [291.6;705.3] и превышала верхние границы нормы на 70,3% (N – до 290 мкг/л, р=0,0021). В конце эугликемии и затем гипогликемии отмечалось снижение концентрации антитромбина III на 18–20% по сравнению с гипергликемией (см. табл. 3), которое, однако, было по-прежнему выше нормативных показателей.

Фактор Виллебранда является несущим белком для фактора VIII, образуя с ним комплексы и предотвращая его от преждевременного протеолитического расщепления [26]. Исходно концентрация фВб составила 0.56 ед/мл [0.21; 0.90] ед/мл, что было в пределах нижней границы нормативных показателей (N=0,5–1,5 ед/мл). При достижении эугликемии и затем гипогликемии его активность не менялась по сравнению с исходным состоянием (см. табл. 3) и оставалась в пределах нижней границы нормативных показателей.

В выполненном исследовании показано, что у больных СД1 без макро- и микрососудистых осложнений отмечается сбалансированное реагирование гемостаза в ответ на контролируемое снижение уровня глюкозы плазмы от гипергликемии до эугликемии и затем до гипогликемии.

Исходно на фоне гипергликемии показатели агрегации на изучаемые агонисты были ниже или в пределах нормы, что свидетельствовало о достаточных компенсаторных механизмах. Физиологические антикоагулянты – протеин S и протеин C, а также фВб были также в пределах нормы, в то время как показатели антитромбина III (АТ-III) существенно (на 70,3%) превышали верхние границы нормы. Развитие гипогликемии оказывало активирующее действие на тромбоцитарный гемостаз, и в период гипогликемии агрегация тромбоцитов на все агонисты повышалась по сравнению с показателями на фоне гипергликемии и эугликемии. Очень важным было то, что на этапе эугликемии активации тромбоцитов не отмечалось, а повышение агрегации наблюдалось только при гипогликемии. Полученные результаты указывают на то, что значение в повышении активности тромбоцитов имел факт быстрого развития гипогликемического состояния, а не собственно процесс снижения уровня глюкозы. Повышение агрегации на фоне гипогликемии от исходных показателей составило 23,9% для тромбина, 30,6% и 30,9% – для АДФ и арахидоновой кислоты и 69,4% и 70,8% – для коллагена и ристоцетина. При этом агрегация на коллаген, АДФ и арахидоновую кислоту оставалась в пределах верхних границ нормы, агрегация на тромбин превышала верхние границы нормы, а агрегация на ристоцетин оставалась достоверно ниже нижней границы нормы. Повышение агрегации было обусловлено стрессовой реакцией на гипогликемию. По данным Lingenfelser T. [21], быстрое развитие гипогликемии сопровождается выбросом норадреналина, адреналина и других катехоламинов, которые активируют α-адренорецепторы тромбоцитов [27, 28]. В свою очередь, активированные α-адренорецепторы повышают чувствительность других рецепторов тромбоцитов к соответствующим агонистам [22, 29]. Отдельно необходимо обратить внимание на показатели агрегации с ристоцетином. In vitro тромбоциты в присутствии ристоцетина связываются с фВб с помощью рецепторов гликопротеина Ib [30], что инициирует процесс активации и агрегации тромбоцитов [27, 31]. Низкая агрегация на ристоцетин была связана с низким уровнем фВб, что отражало сохранность эндотелиального слоя сосудистого русла.

При анализе физиологических антикоагулянтов установлено достоверное повышение активности свободного протеина S. Необходимо отметить, что повышение его активности наблюдалось только при гипогликемии и отсутствовало на этапе нормогликемии. Повышение активности свободного протеина S было обусловлено активацией тромбоцитов и может рассматриваться как компенсаторная реакция. Свободный протеин S имеет два механизма антикоагулянтного влияния. С одной стороны, активация тромбоцитов сопровождается выделением ими киназ, которые сразу же усиливают фосфорилирование свободного протеина S и тем самым повышают в 1,5–2,0 раза его кофакторную активность к протеину С [32]. Фосфорилированный протеин S обладает высоким сродством к отрицательно заряженным фосфолипидам и тем самым улучшает контакт активированного протеина С с мембраной за счет образования комплекса с ним. В свою очередь, активированный протеин С является основным ингибитором активации V и VIII факторов свертывания крови, необходимых для преобразования протромбина в тромбин и последующего формирования из фибриногена фибрина и образования сгустка. С другой стороны, кроме кофакторной активности в отношении протеина С, свободный протеин S проявляет антикоагулянтную активность посредством прямого торможения активации Х фактора [23].

Интересной была динамика изменения концентрации АТ-III. АТ-III – основной ингибитор тромбина, активированных IX, X и XII факторов, плазмина [25, 33], активность которых повышается у больных СД1 [24, 34]. Исходно на фоне гипергликемии концентрация АТ-III была значительно выше нормативных значений, затем достоверно снижалась при достижении нормогликемии и сохранялась на этом уровне при переходе к гипогликемии (оставаясь достоверно выше верхней границы нормы). Повышение концентрации АТ-III на фоне гипергликемии может рассматриваться как компенсаторное, направленное на равновесное состояние коагуляционного и антикоагуляционного потенциала крови. Полученные данные позволяют предположить, что повышенная активность АТ-III была реакцией на гипергликемию, а нормализация уровня глюкозы приводила к достоверному уменьшению его активности, но в пределах значений достоверно выше нормы.

Различий в концентрации антигена фВб, – интегрального маркёра дисфункции эндотелия, при переходе от гипер- к нормо- и затем к гипогликемии не было установлено, что, вероятно, связано с сохранной функцией эндотелия, т.к. пациенты, включенные в исследование, не имели микро- и макрососудистых осложнений.

Таким образом, полученные результаты позволяют предполагать, что у пациентов с СД1 без макро- и микрососудистых осложнений, даже при декомпенсации углеводного обмена (HbA1с=9,12±2,19) быстрое снижение уровня глюкозы от гипергликемии до гипогликемии сопровождается сбалансированной реакцией гемостаза с динамическим равновесием свертывающих и противосвертывающих систем. Повышение активности тромбоцитарного гемостаза компенсируется активацией свободного протеина S, сохранением повышенной концентрации АТ-III и отсутствием признаков потребления факторов свертывания.

Финансирование работы. Работа выполнена в рамках Государственного задания «Взаимодействие генетических, метаболических и воспалительных факторов развития и прогрессирования сосудистых осложнений сахарного диабета, в том числе и после хирургически индуцированной ремиссии сахарного диабета».

Конфликт интересов. Все авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведением исследования и публикацией данной статьи.

Участие авторов. И.Р. Ярек-Мартынова – анализ данных, написание текста; редактирование текста; М.Ю. Мартынов – концепция и дизайн исследования, статистическая обработка и анализ данных, интерпретация результатов; написание и утверждение итогового варианта текста рукописи; К.Г. Саркисова – сбор и обработка материала, статистическая обработка результатов исследования, анализ данных, написание текста; Е.О. Кокшарова – набор материала; Е.Е. Мишина – набор материала; М.В. Шестакова – концепция и дизайн исследования, анализ данных, интерпретация результатов; утверждение итогового варианта текста рукописи; А.Н. Ясаманова – анализ данных, редактирование текста.