Данное исследование направлено на определение влияния периодической углеводной нагрузки на регуляцию глюкозы (концентрация инсулина и глюкозы крови), экспрессию PDX-1 и апоптоз в островках поджелудочной железы. Данные параметры отражают реакцию организма на эпизодическое поступление дополнительных калорий и позволяют количественно оценить избыток калорий, который может переноситься организмом без последствий.

Животные

Данное исследование было одобрено Комитетом по уходу и использованию животных факультета ветеринарии, Universitas Airlangga.

Восьмимесячных самцов Balb/c мышей подготавливали к исследованию в течение 2 нед. Всего было выделено 5 групп по 4 мыши в каждой. В исследование была включена контрольная группа (Контроль), которая получала стандартную диету, группа постоянного потребления (П), которая получала стандартную диету плюс ежедневный раствор глюкозы в качестве дополнительного поступления 7,4% калорий, а также группы эпизодического потребления: группа Инт1 получала стандартную диету плюс раствор глюкозы 1 раз в неделю; группа Инт2 получала стандартную диету плюс раствор глюкозы 2 раза в неделю и группа Инт3, которая получала стандартную диету плюс раствор глюкозы 3 раза в неделю. Продолжительность исследования составила 8 нед.

В стандартной диете использовались гранулы, полученные ветеринарным университетом Universitas Airlangga, состоящие из рыбьего порошка (23%), соевого порошка (6%), рисовых отрубей (10%), риса (31,5%), кукурузы (20%), пшеничной муки (5%), минералов (2%), мелассы сахарного тростника (2%) и поливитаминов (0,5%). Количество калорий составило примерно 2732,61 калорий/кг. Порошок глюкозы состоял из 100% декстрозы, произведенной в Xingmao (Китай), с использованием минеральной воды в качестве растворителя.

Диета с добавлением 7,4% от суточного потребления калорий предусматривала пероральное введение 0,5 мл раствора глюкозы 0,3 г/мл. Кроме того, всем мышам, за исключением контрольной группы, давали 0,05 мг/см3 раствора глюкозы в свободном доступе в соответствии с установленной для каждой экспериментальной группы частотой [17].

По окончанию исследования мышей умерщвляли путем внутрибрюшинной инъекции. Анестезирующая смесь состояла из 1 мл кетамина (100 мг/мл), 0,5 мл ксилазина (20 мг/мл), 0,3 мл ацепромазина (10 мг/мл) и 8,2 мл стерильной воды. Доза внутрибрюшинной анестезии составляла 0,05–0,1 мл/10 г массы тела.

После умерщвления проводилась операция по удалению поджелудочной железы с последующим изготовлением гистологических препаратов и окрашиванием гематоксилином и эозином. Затем проводился расчет площади островков поджелудочной железы и иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ) для определения экспрессии PDX-1 и активности апоптоза.

Определение уровня экспрессии PDX-1

Для определения экспрессии PDX-1 было выполнено ИГХ исследование. Измерение выполняли путем вычисления среднего числа бета-клеток в зоне 5 полей зрения, что обеспечивало положительную реакцию на антитело PDX-1 (Bioss, bs0923R) с использованием микроскопа с 400-кратным увеличением (Nikon eclipse E100), оснащенным DS Fi2 300-мегапиксельной цифровой камерой.

Экспрессия PDX-1 в каждом образце оценивалась полуколичественно в соответствии с модифицированным методом Реммеле [18], в котором индекс иммунореактивного показателя (ИИП) был результатом умножения процентного содержания иммунореактивных клеток на уровень интенсивности цвета иммунореактивных клеток (табл. 1). Положительные иммунореактивные клетки были от желтоватого до коричневого цвета, тогда как остальные клетки были зеленого или синего цвета в соответствии с используемым контрастным веществом.

Таблица 1. Биохимические параметры участников до и после проведения исследования

Примечание. Множественные положительные результаты иммунореактивных клеток в процентах (A) с оценкой интенсивности цвета в иммуноактивных клетках (B). IRS = AxB.

Апоптоз и плотность апоптоза

Микроскопические препараты были исследованы при помощи анализа TUNEL и набора для исследования апоптоза (TACS DtD DAB Trevigen) для обнаружения фрагментов ДНК при апоптозе. Кроме того, активность апоптоза определяли, вычисляя среднее число бета-клеток в 5 полях зрения. Апоптоз в каждом образце оценивали полуколичественно в соответствии с методом Реммеле (см. табл. 1).

Островки поджелудочной железы

Площадь островков поджелудочной железы (мкм2) рассчитывали с использованием программного обеспечения Image Raster 3.0 с окрашиванием гематоксилином и эозином. В среднем подсчитывали площадь пяти островков поджелудочной железы.

Измерение концентрации глюкозы крови

Образцы крови были получены из хвоста, анализ на концентрацию глюкозы проводился в начале и в конце исследования. Гликемия измерялась при помощи глюкометра Accucheck Active.

Измерение инсулина крови

Для измерения концентрации инсулина в сыворотке проводили сбор внутрисердечной крови. После сбора кровь центрифугировали, сыворотку отбирали для дальнейшего изучения с использованием Elisa.

Статистический анализ

Чтобы определить, было ли распределение данных нормальным, был выполнен тест на нормальность. Если распределение было нормальным, то оно анализировалось при помощи дисперсионного теста ANOVA. Если результат был значимым, за ним следовал апостериорный анализ. Если данные не были нормально распределены, был проведен тест Краскела-Уоллиса. Если результаты были значимыми, был проведен тест Манна-Уитни. Показатели средних значений и стандартных отклонений (СО) отображены на рисунках и в таблицах.

Островки поджелудочной железы

В контрольной группе наблюдались самые крупные островки поджелудочной железы, были обнаружены значительные различия с группами Инт2 и Инт3 (рис. 1 и 2).

Рис. 1. Площадь островков поджелудочной железы (мкм2).

Примечание. * Статистически значимы (p <0.05) по сравнению с контрольной группой.

Рис. 2. Площадь островков поджелудочной железы (стрелка) при окрашивании гематоксилином и эозином, микроскоп Nikon eclipse Ci, с увеличением 400x, Optilab Viewer 2.2, Image Raster 3.0.

Экспрессия PDX-1 в островках поджелудочной железы

Не было выявлено разницы экспрессии PDX-1. Однако в группе П отмечалось снижение уровня экспрессии PDX-1. Между тем группа Инт3 показала более высокую экспрессию PDX-1, чем другие экспериментальные группы (рис. 3 и 4).

Рис. 3. Экспрессия PDX-1 (A) и плотность PDX-1 (B) в островках поджелудочной железы после лечения.

Примечание. Между группами не было выявлено значимого различия (p=0,05).

Рис. 4. Экспрессия PDX-1 в клетках островков поджелудочной железы (стрелка).

Примечания: Микроскоп Nikon eclipse Ci, увеличение 400x, Optilab Viewer 2.2, Image Raster 3.0.

Активность апоптоза клеток островков поджелудочной железы

При сравнении параметров активности апоптоза клеток островков поджелудочной железы не было выявлено различий между группами. Тем не менее, по данным среднего значения экспрессии, контрольная группа показала самый низкий уровень апоптоза, в то время как самый высокий апоптоз наблюдался в группе ежедневной высокоуглеводной диеты (рис. 5 и 6).

Рис. 5. Активность и плотность апоптоза клеток островков поджелудочной железы.

Примечание.* Значительно отличается от контрольной группы (p<0,05). ~ существенно отличается от группы Инт1 (p<0,05).

Рис. 6. Апоптоз клеток островков поджелудочной железы (стрелка), анализ TUNEL.

Примечания: Микроскоп Nikon eclipse Ci, увеличение 400x, Optilab Viewer 2.2, Image Raster 3.0.

При анализе плотности апоптоза была выявлена значимая разница (р<0,05) между группами, при этом, группа Инт1 показала наименьшую плотность апоптоза.

Динамика веса

Масса тела до (МТ до) и после (МТ после) исследования представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, данные МТ были разными среди групп (p=0,039). При этом группы П и Инт2 имели более низкие значения при сравнении с контрольной группой, а группа Инт2 имела более низкие значения по сравнению с группой Инт1.

Таблица 2. Влияние эпизодической высокоуглеводной диеты на изменение массы тела, гликемии и уровня инсулина сыворотки крови. Приведены средние значения±СО, n=4 в каждой группе

Примечания. МТ до, граммы – масса тела в граммах; МТ после, граммы – масса тела после исследования в граммах; МТ разница, граммы – разница массы тела до и после исследования; ГК до, ммоль/л – глюкоза крови до исследования; ГК после, ммоль/л – глюкоза крови после исследования; ГК разница, ммоль/л – разница глюкозы крови до и после исследования; Инс, пмоль/л – концентрация инсулина сыворотки крови.

* Значительно отличается от контрольной группы (р<0,05). ^ Значительно отличается от П (p<0,05). # значительно отличается от Инт1 (p<0,05). ~ Значительно отличается от Инт3 (p<0,05).

Изменения веса были оценены по разнице показателей массы тела до и после исследования. Увеличение веса наблюдалось во всех группах, тем не менее, в группе П наблюдались минимальные изменения (рис. 7 и табл. 2).

Рис. 7. Изменение массы тела (в граммах) равнялось разнице массы тела до и после лечения.

Примечание. Между группами не было выявлено значительных различий (p>0,05)

Изменения гликемии

Концентрация глюкозы крови до (ГК до) и после (ГК после) исследования показал значительную разницу между группами (см. табл. 2). Учитывая разницу параметров до исследования, предполагалось, что и концентрация глюкозы крови исходно будет различным. Таким образом, мы оценивали изменение гликемии в ходе исследования. После исследования наблюдалось повышение гликемии.

Концентрация глюкозы в крови определена до и после лечения с целью показать разницу гликемии на фоне избыточного потребления калорий в сутки в течение 8 нед.

Рис. 8 и табл. 2 показывают, что изменение гликемии в экспериментальных группах было ниже и значительно отличалось от изменений контрольной группы (p<0,05). Тем не менее между экспериментальными группами не было существенной разницы.

Рис. 8. Изменение уровня гликемии.

Примечание. * значительно отличается от показателей контрольной группы (р<0,05).

Исследование инсулина крови

Результаты уровня инсулина (рис. 9 и табл. 2) показывают, что концентрация инсулина в контрольной группе была наименьшей, а группа П имела самую высокую концентрацию инсулина (р=0,004). Все группы эпизодической углеводной нагрузки не сильно отличались от контрольной группы. При этом Инт1 и Инт3 имели значительное отличие от П.

Рис. 9. Уровень инсулина после исследования (пмоль/л).

Примечание. * существенно отличается от контрольной группы (p<0,05); ^: существенно отличается от группы П (p<0,05).

Результаты оценки островков поджелудочной железы показали, что контрольная группа имела наибольшую площадь, а Инт2 и Инт3 имели значительные отличия от контрольной группы. Полученные данные согласуются с результатами исследования Petrik и соавт (2001) [19], в котором было показано, что у новорожденных мышей, получавших молочную смесь с высоким содержанием углеводов, среди островков поджелудочной железы преобладали небольшие островки. Мы предположили, что площадь небольших островков поджелудочной железы в экспериментальной группе может наблюдаться в результате перехода от ранней к промежуточной стадии адаптационного механизма регуляции глюкозы в условиях высокоуглеводной диеты. При более длительном наблюдении нельзя исключить увеличения размера островков. Поскольку потребность в инсулине увеличивается, островок поджелудочной железы также становится больше. Наше исследование продемонстрировало интересный результат: концентрация инсулина увеличилась, тогда как площадь островков поджелудочной железы стала меньше. Такое несоответствие может наблюдаться из-за стресса. Первоначально возникали функциональные изменения, за которыми последовали морфологические. На заключительной стадии островки поджелудочной железы будут уменьшаться вследствие истощения бета-клеток, как это происходит при СД 2 типа. Тем не менее, также возможно развитие воспалительной реакции, как это происходит вследствие аутоиммунной реакции при СД 1 типа [20]. Кроме того, наше исследование показало, что имеется прямая зависимость между изменением массы тела и состоянием островков поджелудочной железы (табл. 3).

Таблица 3. Корреляция между параметрами

Примечания: МТ разница – разница массы тела до и после исследования; ГК разница – разница глюкозы крови до и после исследования

** Корреляция значима на уровне 0,01 (двусторонний); * Корреляция значима на уровне 0,05 (двусторонний).

Экспрессия PDX-1 была наибольшей в контрольной группе, тем не менее результат был другим при сравнении с областью островков поджелудочной железы (плотность PDX-1). Это может быть связано с тем, что процент бета-клеток, которые экспрессируют PDX-1 в контрольной группе, был относительно меньше, хотя число клеток островков было более многочисленным. Если бы это было связано с концентрацией инсулина, можно было бы предположить, что площадь островков поджелудочной железы не являлась основным фактором. Однако бета-клетки становились более активными, так как стимулировались дополнительной углеводной нагрузкой.

Как упоминалось выше, PDX-1 является транскрипционным фактором, который играет важную роль в регуляции функции и выживания бета-клеток как до рождения, так и после [21, 22]. Количество бета- и альфа-клеток может косвенно зависеть от уровня экспрессии PDX-1. Повышение экспрессии PDX-1 может уменьшить популяцию альфа-клеток и увеличить популяцию бета-клеток во время эмбриональной фазы. Кроме того, уменьшение количества бета-клеток и увеличение – альфа-клеток может быть результатом нарушения экспрессии PDX-1. Снижение экспрессии PDX-1 происходит в случаях хронической гипергликемии и дислипидемии, вследствие чего наблюдается нарушение функции бета-клеток. Одним из основных механизмов является влияние инсулиноподобного фактора роста (IGF), за которым следует снижение экспрессии PDX-1, которое, в конечном итоге, вызывает апоптоз бета-клеток [12, 21].

Экспрессия и плотность PDX-1 среди групп в этом исследовании не показали существенной разницы. При сравнении экспрессии и плотности PDX-1 с концентрацией инсулина результаты были противоречивыми. Вероятно, помимо PDX-1 были и другие факторы, играющие роль в изменении гликемии, с прямой зависимостью от уровня экспрессии PDX-1. Другим возможным механизмом является активация процесса адаптации, который приводит к стимуляции бета-клеток вследствие увеличенного поступления углеводов. Более того, у эмбрионов мышей E.13.5 до рождения существует несколько факторов транскрипции, таких как MafA (фактор транскрипции млекопитающих A) и MafB. MafA также играет роль в активации транскрипции инсулина, при этом MafB может влиять на MafA. Отсутствие MafB может ингибировать MafA и PDX-1 [23]. Для изучения этих факторов необходимы дальнейшие исследования.

Анализ параметров апоптоза показал отсутствие значимых различий при сравнении с контрольной группой. Однако активность и плотность апоптоза в группе П были самыми высококими, а в группе Инт1 – самыми низкими. В другом исследовании, проведенном Yamamoto (2017) [24], было указано, что апоптоз у мышей βPdx1; Ins2Akita, Ins2Akita и мышей контрольной группы значительно не различался. Кроме того, в этом исследовании могли наблюдаться компенсаторно-защитные механизмы вследствие усиления экспрессии PDX-1. В предыдущем исследовании говорилось, что наряду с апоптозом при СД был активирован механизм воспаления [25]. Гипергликемия при СД вызывает некроз тканей конечностей [26]. Несмотря на то что в нескольких исследованиях было обнаружено, что основным механизмом гибели бета-клеток является апоптоз, по-прежнему существует вероятность того, что ишемический некроз может наблюдаться и в бета-клетках вследствие активации воспалительных факторов при СД [27, 28].

Бета-клетки поджелудочной железы, так же как нервные и эндотелиальные клетки, являются инсулиннезависимыми. Таким образом, поступление глюкозы в эти клетки не опосредованно инсулином. При повышении концентрации глюкозы поступление глюкозы в эти клетки будет также усиливаться. Это может инициировать механизм цепной реакции повреждения клеток, при котором будет наблюдаться увеличение внутриклеточной продукции реактивных форм кислорода (РФК), которые инициируют клеточный апоптоз или активируют митохондриальный путь [29, 30]. Исследования, проведенные Sun и соавт. (2016) [31], в которых изучалось влияние диеты, богатой жирами, показали усиление активности апоптоза. При этом наблюдалась прямая зависимость увеличения активности апоптоза с увеличением кратности дней приема пищи с высоким содержанием жира.

В контрольной группе наблюдались самые большие изменения МТ. Изменения МТ в экспериментальных группах не были столь существенны. Увеличение МТ было в первую очередь связано с ростом мышей в течение 8 нед. Группа с дополнительным приемом 7,4% калорий 1 раз в неделю показала наибольшее увеличение МТ по сравнению с другими экспериментальными группами. Группы П и Инт2 характеризовались наименьшим изменением МТ. Аналогичные исследования, в которых использовались углеводы в виде раствора глюкозы, также показали более низкое увеличение МТ по сравнению с контрольной группой [32, 33]. Исследования, проведенные Adeyi и соавт. (2012) [34], показали, что потребление пищи с высоким гликемическим индексом или низким содержанием жиров в течение 8 нед также приводит к аналогичным результатам. Xu и соавт. (2010) [35] провели 12-недельное исследование углеводной диеты у 3-недельных самцов крыс Wistar, было показано, что наибольшее изменение массы наблюдалось в группе низкоуглеводной диеты. Предполагалось, что концентрация лептина была максимальной в группе низкоуглеводной диеты, а минимальной – в группе диеты с высоким содержанием углеводов. В другом исследовании был сделан вывод о связи проведенных диетических изменений с рецепторами к лептину. Наблюдалось снижение рецепторов лептина в гипоталамусе в группе с низкоуглеводной диетой. Утверждалось, что лептин также играет роль в метаболизме глюкозы и уменьшении аппетита [36].

В нашем исследовании концентрация инсулина была выше в экспериментальных группах, что не соответствовало данным МТ и статистическому анализу (см. табл. 3). Это может быть связано с нарушением энергетического метаболизма. В физиологическом состоянии инсулин ингибирует распад жира и способствует синтезу свободных жирных кислот. Впоследствии это приводит к повышению МТ. Наши результаты показали более низкую МТ. Таким образом, для более детального изучения необходимо также измерить больше параметров, таких как рецепторы к инсулину, а также другие гормоны, такие как лептин и рецепторы к нему.

Наибольшие изменения гликемии наблюдались в контрольной группе, тогда как в экспериментальных группах не было выявлено существенных различий. Результат был неожиданным: в контрольной группе наблюдалось наибольшее изменение концентрации глюкозы. Однако если были измерены данные ГК до и после (табл. 2), значения ГК после были значительно выше (p≥0,05). Предыдущие исследования, такие как изучение диеты с высоким содержанием глюкозы на крысах, показали более низкий гликемии натощак в контрольной группе [37], в то время как в других исследованиях на мышах не было обнаружено существенной разницы в отношении гликемии под воздействием высокоуглеводной диеты [38].

В результатах нашего исследования наблюдаются противоречивые данные, опосредованные тем, что в контрольной группе наблюдался самый низкий уровень инсулина. Более низкая концентрация инсулина приводила к менее эффективному поглощению ГК клетками, что приводило к более высокому уровню глюкозы в контрольной группе. В экспериментальной группе высокий уровень ГК активировал механизмы компенсации и выживания.

Дополнительное поступление 7,4% калорий от суточного потребления в виде глюкозы доказало, что это стимулирует бета-клетки секретировать больше инсулина в экспериментальных группах (в большей степени в группе П), по сравнению с контрольной группой. Несколько исследований с использованием высококалорийной диеты показали, что концентрация инсулина сыворотки крови достигала более высокого уровня по сравнению с контрольной группой [38]. Тем не менее имеется повод для дальнейших исследований, так как концентрация инсулина в группе 2-недельной эпизодической углеводной нагрузки был выше, чем в группе 3-недельной эпизодической углеводной нагрузки.

Увеличение суточной калорийности за счет дополнительного введения глюкозы приводило к увеличению пиковой концентрации глюкозы крови. При этом показатели отличались в дни, когда дополнительного введения глюкозы не было. Некоторые литературные источники объясняют это тем, что высокий уровень глюкозы крови после еды может вызывать секрецию глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1), который секретируется клетками кишечника. ГПП-1 может оптимизировать дальнейшую стимуляцию секреции инсулина и ингибировать секрецию глюкагона островками поджелудочной железы [21]. Увеличение секреции инсулина в экспериментальной группе может являться следствием эпизодической углеводной нагрузки.

Исходя из результатов этого исследования, можно сделать вывод, что ежедневное дополнительное поступление 7,4% калорий с глюкозой 1–3 раза в неделю с перерывами активирует механизмы компенсации и поддержания гомеостаза, при этом наблюдаются повышение концентрации инсулина сыворотки крови и изменения морфологических и биомолекулярных характеристик островков поджелудочной железы (уменьшение площади островков поджелудочной железы и увеличение плотности апоптоза). Плотность PDX-1 незначительно увеличивалась в экспериментальных группах с эпизодической углеводной нагрузкой. Судя по всему, дополнительное потребление углеводов 1 раз в неделю может переноситься организмом без дополнительного вреда, при этом следует отдать предпочтение именно однократному потреблению дополнительных углеводов в неделю. Так как по данным нашего исследования не было выявлено значимого повышения концентрации глюкозы и инсулина крови, можно сделать вывод об отсутствии влияния проведенных манипуляций на углеводный обмен. Тем не менее, необходимо проведение дальнейших исследований, в ходе которых будут более детально изучены морфологические и биомолекулярные изменения в островках поджелудочной железы.

Финансирование работы. Исследование было проведено при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований, Министерства исследований, технологий и высшего образования, Индонезия.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. L. Herawati - концепция, дизайн и проведение эксперимента, интерпретация результатов, написание и редактирование статьи; K.W. Wigati - подготовка таблиц, написание и редактирование текста; P.S. Rejeki - анализ данных; W. Widjiati - интерпретация результатов исследования; R. Irawan - концепция и дизайн исследования, интерпретация результатов, написание и редактирование статьи. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Благодарности. Авторы хотели бы поблагодарить всех членов команды лаборатории эмбриологии за их техническую помощь во время исследований, Dewita, Tia, Ronald и команду (Факультет ветеринарии, Universitas Airlangga, Surabaya) за техническую помощь в проведении иммуногистохимических исследований, Wahyu Wibowo (Отделение статистики, Institute Teknologi Sepuluh November, Surabaya) за статистический анализ.