Оценить морфологические характеристики интенсивности репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей у пациентов с нейропатической и нейроишемической формами СДС.

В исследование было включено 63 пациента (21 женщина и 42 мужчины) с нейропатической и нейроишемической формами (после реваскуляризации, без критической ишемии) СДС, которым была проведена хирургическая обработка раневого дефекта.

После проведенной хирургической обработки проводился забор биопсийного материала тканей, с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями. В таблице 1 представлена клиническая характеристика обследованных больных.

Все лабораторные исследования образцов крови проводились по стандартным методикам клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ России (зав. отделением – Ильин А.В.).

Площадь раны определялась методом очерчивания контуров раны через прозрачную масштабную пленку с последующим подсчетом площади внутри контура по специальным формулам (Opsite Flexgrid, SmithandNephew).

Транскутанная оксиметрия выполнена на аппарате Radiometer (Дания). Датчики накладывались на расстоянии 0,5–1 см от краев раны.

Морфологические исследования проведены на базе лаборатории гистологии и иммуногистохимии с группой крио банкинга ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ (зав. отделением д.м.н., проф. Абросимов А.Ю.).

Морфологический анализ биопсийного материала включал гистологический и иммуногистохимический методы исследования.

Из центральной зоны раневого ложа проводился забор биоптата объемом 0,5 см3, после чего материал фиксировали в 10% растворе формалина, а затем заливали в парафин по обычной методике.

Серийные срезы толщиной 3–5 мкм депарафинировали по стандартной схеме и окрашивали гематоксилином и эозином.

Гистологическая оценка выраженности отека и ЭЦМ проводилась полуколичественным методом с помощью баллов, где 1 «+» – слабо выражено, 2«+» – умеренно выражено, 3 «+» – сильно выражено, 4 «+» – очень сильно выражено.

Оценка зрелости грануляционной ткани проводилась путем определения площади некроза, количества сосудов, выраженности воспалительного инфильтрата и клеточного состава (полиморфноядерные лейкоциты, лимфоциты, макрофаги, фибробласты) и разделялась на молодую, созревающую, зрелую, где 1 – молодая грануляционная ткань: богатая клетками и тонкостенными сосудами соединительная ткань, между сосудами много недифференцированных лимфоцитоподобных клеток соединительной ткани, лейкоцитов, плазматических клеток и лаброцитов, 2 – созревающая грануляционная ткань: продолжается дифференцировка клеточных элементов, волокнистых структур, а также сосудов. Число гематогенных элементов уменьшается, а фибробластов – увеличивается. В связи с синтезом фибробластами коллагена в межклеточных пространствах образуются аргирофильные, а затем и коллагеновые волокна. По мере созревания фибробластов количество коллагеновых волокон увеличивается, они группируются в пучки; 3 – зрелая грануляционная ткань: волокнистая соединительная ткань.

Фазы воспаления были определены на основании классификации Кузина М.И. (1990 г.), где фаза 1 – воспаления: в ране преобладают нейтрофильные гранулоциты, моноциты и макрофаги, фаза 2 – регенерации и созревания грануляционной ткани: последняя формируется в виде отдельных очагов на дне раны и характеризуется интенсивным новообразованием капилляров. Определяется большое количество фибробластов, формирование коллагеновых и эластиновых волокон, фаза 3 – рубцевания и эпителизации: грануляционная ткань превращается в зрелую фиброзную ткань с грубыми коллагеновыми волокнами и фиброцитами.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование выполнили на иммуностейнере Leica BOND-MAX. Характеристика использованных антител фирмы Dako в стандартных разведениях с использованием положительного контроля: применялись антитела к ТИМП-1, к ММП-9, маркеру макрофагов CD68, остеопонтину.

Оценка экспрессии цитоплазматических маркеров (ТИМП-1, ММП-9, остеопонтин) проводилась полуколичественным методом: 1«+» – окрашивание единичных клеток (менее 30% клеток), 2«+» – 30–60% клеток, 3«+» – 60–90%, 4 «+» – более 90% клеток.

Степень экспрессии СD68 (маркер макрофагов мие лоидных и гистиоцитарных клеток) была рассчитана полуколичественным методом исходя из числа иммунопозитивных клеток и варьировала в диапазонах: 5–10%, 10–15%, 15–20%, 20–30%, 30–40% специфически окрашенных клеток. Микрофотографии выполнены с помощью камеры LeicaDSC 450 S (Leica, Германия).

Протокол исследования был одобрен на заседании этического комитета ФГБУ ЭНЦ от 28 ноября 2012 года (протокол №18).

Всеми пациентами было подписано информированное согласие.

Статистический анализ проведен с помощью программы Статистика 7.0 (StatSoft). Для описания признаков использовали медиану, 25, 75 квартили. Корреляцию проводили по Спирмену.

Впервые выполнена комплексная оценка интенсивности репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей у лиц с СДС с помощью выбранных морфологических методик.

В ходе исследования у всех пациентов после проведенной хирургической обработки и до начала местной терапии проводился забор биоптатов из дна раневых дефектов с последующим проведением гистологического и иммуногистохимического исследования.

Во всех ранах отмечался выраженный межклеточный отек – медиана выраженности отека составляла 3 [3; 4], плохо организованный ЭЦМ – медиана 2 [1; 2], низкое содержание фибробластоподобных клеток и выраженная воспалительная инфильтрация, выявлено наличие формирующейся молодой грануляционной ткани – 1 [1; 2].

Несмотря на то, что у многих больных раневой процесс был длительным и резистентным к местному лечению, проведенная хирургическая обработка позволила перевести хронический процесс в острый.

У большинства обследованных пациентов раны находились в фазе воспаления, медиана – 1 [1; 2].

На рис. 1 представлена типичная гистологическая картина биоптата раневого дефекта до начала местного лечения.

Иммуногистохимические особенности течения раневого процесса у лиц с синдромом диабетической стопы

По результатам ИГХ-исследования, у всех обследованных отмечались умеренное количество макрофагов (иммунопозитивных с антителами к CD68) и интенсивная окраска ММП-9, слабое окрашивание TIMP-1 и остео понтина.

В табл. 2 представлены значения медианы [25; 75] ИГХ-маркеров репарации у обследованных больных.

Несмотря на длительный анамнез СД у обследованных больных, корреляций между длительностью заболевания, значениями гликированного гемоглобина и выраженностью репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей получено не было, Rs=-0,01.

На рис. 2, 3, 4, 5 представлены результаты ИГХ-исследования биоптатов ран после проведенной хирургической обработки.

Хронические раневые дефекты нижних конечностей при СД в настоящий момент встречаются все чаще, что обусловлено, в том числе, и растущей заболеваемостью СД.

Хорошо известно, что процессы заживления при нарушенном углеводном обмене замедлены, однако патофизиологические основы данного факта до конца не ясны.

Цель данного исследования заключалась в оценке морфологических и ИГХ показателей репарации у больных СД.

Было проведено комплексное обследование 63 пациентов с СДС от 32 до 78 лет, находившихся на стационарном лечении в отделении диабетической стопы в ФГБУ «Эндокринологический центр» МЗ РФ в период с сентября 2012 г. по декабрь 2014 г.

Всем пациентам была проведена хирургическая обработка раневого дефекта, адекватная антибактериальная терапия и разгрузка пораженной конечности.

В период стационарного лечения всем пациентам проводилась коррекция сахароснижающей терапии с достижением индивидуальных целевых значений гликемии [17].

В ходе клинико-лабораторного обследования выяснено, что медиана уровня гликированного гемоглобина у всех больных составляла 8,7% [7,6; 10], таким образом, состояние углеводного обмена было неудовлетвори тельным.

В исследовании Christman et al. было установлено, что скорость заживления ран нижних конечностей при диабете напрямую зависела от уровня гликированного гемоглобина. При значениях HbA1c≤7% скорость заживления составляла 0,197 см2 в день, при HbA1c 7–8% раневые дефекты уменьшались в размерах со скоростью 0,157 см2 в день, а при HbA1c≥8% заживление происходило со скоростью 0,028 см2 в день [18].

У большинства больных диабетическая нефропатия либо отсутствовала, либо была на стадии МАУ, таким образом, фактор дефицита белка как неблагоприятный для заживления тканей отсутствовал, что подтверждено лабораторными данными.

У большинства больных имелась диабетическая полинейропатия. Несмотря на то, что при оценке периферической чувствительности у незначительного количества больных не было выявлено ее снижения, однако наличие у обследованных сухости кожных покровов, гиперкератозов и дисгидроза позволило расценить вышеуказанные симптомы как начальные проявления снижения периферической иннервации.

В ходе гистологического исследования биоптатов раневых дефектов до начала местного лечения было установлено, что у всех больных отмечался выраженный отек, плохо организованный экстрацеллюлярный матрикс, низкое содержание фибробластоподобных клеток и значительный воспалительный инфильтрат. Все раны находились в фазе воспаления.

Полученные данные согласуются с данными Boulton А и соавт., где было доказано, что раны при диабете имеют более продолжительную фазу воспаления, сниженную активность воспалительных клеток и замедленную перестройку ЭЦМ. Именно эти нарушения препятствуют заживлению и способствуют переходу раны из острой в хроническую [6].

Согласно работам Baltzis D и соавт., взаимодействие гликированного коллагена с ЭЦМ и фибробластами или эндотелиальными клетками препятствует адгезии клеток, их пролиферации и сокращению раны [8].

При иммуногистохимическом исследовании также было отмечено замедление репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей у обследованных больных с СД.

В ходе настоящего исследования установлено, что уровень экспрессии остеопонтина был снижен у большинства больных. Это согласуется с данными литературы, где говорится о снижении экспрессии остео понтина у лиц с нарушениями углеводного обмена [13].

Высказывается предположение, что одной из причин замедления репаративных процессов при СД является снижение экспрессии остеопонтина в раневом ложе, что выражается в нарушении миграции иммунокомпетентных клеток, накоплении продуктов распада, уменьшении количества эндотелиальных клеток, замедлении неоангиогенеза и дезорганизации ЭЦМ [13].

У всех больных отмечается окрашивание средней интенсивности маркера макрофагов CD68.

На лабораторных моделях было доказано, что при СД количество макрофагов в ране накапливается более длительно, что может быть связано с повышением уровня провоспалительных цитокинов и протеаз и сниженным количеством факторов роста. Аналогичные данные получены и у пациентов с СД [8].

После проведенной хирургической обработки зафиксировано усиление экспрессии MMP-9 и слабое окрашивание TIMP-1, что свидетельствует о высокой протеолитической активности в ранах и, согласно некоторым исследованиям, приводит к замедлению перестройки коллагена и является неудовлетворительным прогностическим признаком заживления ран.

Так, Liu Y и соавт. отметили, что высокий уровень ММР-9 в раневой жидкости свидетельствует о воспалении и является маркером плохого заживления ран при СД [15]. Другие исследователи в своей работе предложили использовать соотношение MMP-9/TIMP-1 в качестве предиктора заживления ран при СДС [16].

Несмотря на отсутствие группы контроля в данном исследовании, полученные результаты согласуются с литературными данными.

Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что у лиц с СД репаративные процессы в мягких тканях замедлены, однако в настоящий момент данных об отдаленных результатах проведенного лечения недостаточно, что требует продолжения исследований.

Исследование проведено при спонсорской поддержке ФГБУ ЭНЦ в рамках утвержденной темы научно-исследовательской работы.

Авторы заявляют об отсутствии явного и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Информация о вкладе каждого автора: Зайцева Е.Л. – сбор и обработка материала, анализ полученных данных и написание текста; Доронина Л.П. – сбор материала; Молчков Р.В. – проведение гистологического исследования; Воронкова И.А. – проведение иммуногистохимического исследования; Токмакова А.Ю. – концепция и дизайн исследования.