Изучить фенотипические и генетические особенности больных СД2 с различным ответом на терапию метформином в Новосибирской области.

Проведено одномоментное поперечное обследование 2000 больных СД2 (450 мужчин и 1550 женщин) на базе передвижного диабетологического центра (Диамобиль) в районах Новосибирской области. Протокол исследования одобрен комитетом по этике Новосибирского государственного медицинского университета (протокол №52, от 19. 03. 2013). Перед включением в исследование все пациенты подписывали информированное согласие.

Из 2000 обследованных больных СД2 была сформирована группа из 460 человек (97 мужчин и 363 женщин), получавших терапию МФ как в монотерапии, так и в сочетании с препаратами сульфонилмочевины (СМ). Критериями исключения являлись: СД1, другие типы диабета, инсулинотерапия при СД2, наличие онкологических заболеваний, сердечной недостаточности 3–4-го функционального класса в соответствии с классификацией Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA), печеночная недостаточность (более 7 баллов по Чайлд-Пью), снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) менее 45 мл/мин×1,73 м2, лечение кортикостероидами или эстрогенами, алкоголизм, наркомания, деменция или серьезные психические расстройства. Всем 460 больным исследовали уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) иммунотурбидиметрическим методом на анализаторе BIO-RAD D10 (США), провели полное клиническое обследование. Средний возраст обследованных составил 58,8±8,6 лет, длительность СД2 – 6,2±5,7 лет, уровень HbA1c 8,4±1,9%, ИМТ 34,8±6,7 кг/м2. В зависимости от уровня HbA1c пациенты были распределены на группы: больные, имеющие целевой HbA1c на фоне терапии МФ (n=209), из них монотерапия МФ была у 110 человек, комбинацию МФ с СМ получали 99 больных, и группа пациентов, не достигших целевого уровня HbA1c на максимальной дозе МФ (n=251), из них монотерапия МФ была у 58 человек, комбинацию МФ с СМ получали 193 человека. Полная клинико-лабораторная характеристика обследованных больных приведена в таблице 1.

Выделение ДНК и генотипирование полиморфного локуса rs11212617 гена ATM проводили в лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов. ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 65 мМTris-HCl (рН 8,9), 24 мМ сульфата аммония; 3,5 мМ MgCl2; 0,05% Tween-20; 300 нМ каждого праймера; по 100 нМTaqMan-зондов, конъюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ-ные dNTP, 20–100 нг ДНК и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификация проводилась с помощью амплификатора CFX384 (Bio-Rad, США) в следующих условиях: начальная денатурация 3’ при 96°С; затем 50 циклов, включающих денатурацию при 96°С – 8 с, отжиг праймеров и последующую элонгацию при Тотж = 60°С в течение 40 сек (каждый шаг сопровождался регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующих интервалам флюоресценции флюорофоров FAM и R6G). Для определения генотипа полиморфного локуса rs11212617 использовали следующие олигонуклеотиды:

Статистический анализ

Использовали стандартный описательный и сравнительный анализ. При нормальном распределении данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD), при асимметричном – в виде медианы (Ме) и 25 и 75 процентиля [25; 75]. Для сравнения частоты аллелей между группами использовали χ2. Для оценки межгрупповых различий проводился дисперсионный анализ (ANOVA) или ранговый анализ Краскела-Уоллиса в зависимости от типа распределения данных. Критический уровень значимости принимали равным 0,05. Соответствие равновесию Харди-Вайнберга оценивали с помощью точного теста Фишера. Для статистической обработки использованы пакет статистики Genetics программного обеспечения R-project (www.r-project.org) и программа Statistica 6. 0.

При анализе клинических данных было отмечено, что больные СД2 с хорошим ответом на терапию МФ по сравнению с группой больных с плохим ответом на МФ как в общей группе (табл. 1), так и в подгруппе комбинированной терапии МФ с препаратами СМ были старше (61,1±9,1 лет vs. 57,4±8,4 лет, р=0,001), имели более позднее начало СД2 (54,6±10,1 лет vs. 49,2±8,5 лет, р=0,0001), меньшую длительность СД2 (6,5±5,9 лет vs. 8,2±6,1 лет, р=0,03) и не отличались по полу, ИМТ, уровню инсулина, степени инсулинорезистентности, СКФ и уровню трансаминаз. В группе больных, получавших монотерапию МФ, статистически значимых различий по полу, возрасту, длительности СД2, возрасту начала СД2, ИМТ, уровню инсулина, СКФ, трансаминаз, степени инсулинорезистентности, в зависимости от ответа на терапию МФ, получено не было.

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных

Распределение генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM статистически значимо не отклонялось от равновесия Харди-Вайнберга (p=0,21). Частота редкого аллеля С полиморфного локуса rs11212617 гена ATM у обследованных больных составила 0,41; в подгруппе больных с плохим ответом на монотерапию МФ достигала 0,46, при хорошем ответе – 0,39 (р>0,05); при комбинированной терапии МФ и СМ и в общей группе больных с плохим ответом на МФ частота аллеля С была одинакова – 0,4 и 0,41 соответственно и не отличалась от группы с хорошим ответом (рис. 1).

По результатам проведенного логистического регрессионного анализа не было выявлено статистически значимой ассоциации генотипа полиморфного локуса rs11212617 гена ATM с типом ответа, как в общей группе пациентов (OR=0,94, 95% CI=0,73–1,23, p=0,67), так и в подгруппах пациентов с монотерапией МФ (OR=0,90, 95% CI=0,65–1,25, p=0,54) и комбинированной терапией (OR=1,02, 95% CI=0,72–1,43, p=0,92) (табл. 2).

Таблица 2. Логистический регрессионный анализ зависимости достижения целевого HbA1c<7% при терапии метформином от генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM

Использована аддитивная модель наследования для вычисления OR для аллеля С в каждой когорте. В регрессию были дополнительно включены следующие параметры: пол пациента, возраст на момент обследования, ежедневная доза метформина и уровень креатинина.

При проведении логистического регрессионного анализа зависимости ответа на МФ от клинических параметров было установлено статистически значимое влияние возраста пациента на ответ на терапию во всех трех группах: общая (p=0,001), монотерапия МФ (p=0,04), комбинированная терапия (p=0,0009), более старший возраст пациента является предиктором хорошего ответа на терапию МФ. Также в группе монотерапии МФ была выявлена ассоциация низкой дозы МФ с хорошим ответом (p=0,03), а в группе с комбинированной терапией – мужского пола с хорошим ответом (p=0,003).

Распределение генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM статистически значимо не отличалось в группах больных с хорошим и плохим ответом на терапию МФ, сопоставимых по стажу диабета и по длительности терапии МФ (табл. 3).

Таблица 3. Распределение генотипов полиморфного локуса rs11212617 гена ATM при различном ответе на терапию метформином у больных СД2 в Новосибирской области, в зависимости от длительности СД

Анализ выполняли с помощью двустороннего точного теста Фишера в связи с небольшим размером групп носителей генотипов С/С.

В настоящее время известно, что активация АМРК взаимосвязана не только с изменением углеводного обмена, но и с антиатерогенным действием МФ, которое связано со снижением синтеза свободных жирных кислот, холестерина [13], эндогенных антиоксидантных систем, снижением адгезии моноцитов к эндотелию, торможением формирования «пенистых» клеток, уменьшением экспрессии молекул адгезии (ICAM-1, VCAM-1), снижением уровня ингибитора активатора плазминогена, фактора Виллебранда, концентрации фибриногена, повышением фибринолитической активности [14, 15].

При анализе клинических и лабораторных параметров обследованных больных СД2 (n=460) в зависимости от генотипа полиморфного маркера rs11212617 гена ATM было установлено, что наличие генотипа С/С и А/С по сравнению с генотипом А/А было ассоциировано с более высоким уровнем триглицеридов (2,33 [1,52;4,2] ммоль/л, 2,09 [1,35;3,0] ммоль/л vs. 1,99 [1,49;3,21] ммоль/л, р=0,001), высокой частотой ИБС (13,4%, 13,4% vs. 9,6%, р=0,009) и инфаркта миокарда (ИМ) (7,8% vs. 3,2%, 4%, р=0,001) и не было взаимосвязано с длительностью СД2, ИМТ, степенью инсулинорезистентности и уровнем инсулина в общей группе. Для исключения влияния гипергликемии на развитие липидных нарушений и частоты ИБС и ИМ было проведен анализ клинических и лабораторных параметров в группе больных, получавших монотерапию МФ и имевших целевой уровень HbA1c в зависимости от генотипа полиморфного маркера rs11212617 гена ATM (табл. 4).

Таблица 4. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных СД2 с хорошим ответом на монотерапию МФ в зависимости от генотипа полиморфного маркера rs11212617 гена ATM

Не обнаружено статистически значимых различий по возрасту, длительности диабета, возрасту начала СД2, частоте АГ, дозе МФ между генотипами полиморфного маркера rs11212617 гена ATM в группе больных СД2 с хорошим ответом на МФ. Была выявлена тенденция к более высоким параметрам базального инсулина, индекса HOMA-IR, ИМТ, триглицеридам при генотипе С/С, по сравнению с генотипом А/А и А/С. Частота ИБС и инфаркта миокарда была достоверно выше при генотипе С/С (табл. 3). Таким образом, наличие генотипа С/С полиморфного маркера rs11212617 гена ATM было ассоциировано с более выраженными нарушениями липидного обмена, высокой частотой ИБС и инфаркта миокарда и не было взаимосвязано с длительностью СД2, ИМТ, степенью инсулинорезистентности и уровнем инсулина как в общей группе, так и в группе монотерапии МФ.

Первое фармакогенетическое полногеномное ассоциативное исследование МФ было проведено в Шотландии у 1024 больных СД2, участвовавших в исследовании GoDARTS (Genetics of Diabetes Audit and Research Tayside) [11]. Эффективность терапии МФ оценивали по уровню HbA1c в течение первых 18 месяцев от начала терапии. Целевым уровнем являлся HbA1c ниже 7%, что считалось показателем эффективности сахароснижающей терапии. При проведении статистического анализа учитывали исходный уровень HbA1c, его динамику в процессе терапии МФ и клиренс креатинина. Исследователи выявили 14 полиморфизмов в участке, содержащем ген АТМ. Было установлено, что носители минорного аллеля С полиморфного локуса rs11212617 гена АТМ достигали целевого уровня HbA1c<7% чаще (OR=1,64, 95% CI=1,37–1,99 1,9×10-7) [16]. Последующий мета-анализ [17], включавший 4443 больных СД2, выявил значимую ассоциацию аллеля С с ответом на терапию МФ (ОR=1,35, 95% CI=1,22–1,49, P=2,9×10-7). Примечательно, что ассоциация аллеля С при делении на группы монотерапии МФ и комбинированной терапии сохранялась только в группе монотерапии МФ. Van Leeuwen с соавт. предположили, что, возможно, некоторые эффекты терапии МФ, в частности опосредованные через путь AMPK, могут частично нивелироваться при приеме препаратов СМ [17]. Исследователи сделали вывод, что данный участок гена контролирует клеточный цикл, а изменения в нем могут приводить к уменьшению фосфорилирования и активации АМРК и, соответственно, различному сахароснижающему эффекту МФ [11, 16].

Другими исследователями, которые изучали влияние полиморфного локуса rs11212617 гена АТМ на вероятность развития СД2 у лиц с избыточным весом и НТГ в Программе профилактики диабета (Diabetes Prevention Program), с участием представителей пяти американских этнических групп (n=988), было выдвинуто предположение, что время перехода НТГ в СД2 у лиц, принимающих МФ и различных по генотипу полиморфного локуса rs11212617, может отличаться. Однако никакой существенной разницы не было обнаружено (OR=1,17, 95% CI=0,96–1,42, P=0,13). Florez с соавт. предположили, что эффект полиморфного локуса при терапии МФ заметен только при высоких HbA1c, что возможно только у лиц с уже диагностированным СД2. В их исследовании у участников развивался впоследствии СД2, и уровни HbA1c были невысоки [18].

Недавно Vilvanathan с соавт. на жителях Южной Индии (118 пациентов с СД2 и 112 здоровых) оценивали связь полиморфного локуса rs11212617 с развитием СД2. Однако влияния данного полиморфного локуса на предрасположенность к СД2 не выявили: OR=1,09, 95% CI=0,75–1,60 [19].

Schiekofer и соавт. обследовали 242 человека без нарушений углеводного обмена в возрасте от 58 до 86 лет с ИБС, подтвержденной результатами коронарографии. Частота минорного аллеля С полиморфного локуса rs11212617 гена АТМ в обследованной группе составила 0,48, аллеля А 0,52, влияния полиморфного локуса на уровень гликемии натощак они не обнаружили. У носителей частого аллеля А ИБС встречалась чаще (p=0,003), однако в работе отсутствуют данные частоты ИБС в зависимости от гаплотипа. Исследователями выявлена слабая ассоциация генотипа С/С с уровнем ЛПНП и частотой артериальной гипертензии (АГ) [20].

Таким образом, в литературе отсутствуют данные о фенотипических особенностях больных при различном ответе на терапию МФ, проведенные исследования демонстрируют, что, вероятнее всего, полиморфный локус rs11212617 гена АТМ ассоциирован с эффективностью терапии МФ у пациентов с СД2, но не влияет на предрасположенность к развитию СД2. Также возможно прямое или опосредованное через прием МФ влияние полиморфного локуса rs11212617 гена АТМ на развитие ИБС.

Проведенное нами исследование впервые показало, что больные СД2 с хорошим ответом на терапию МФ по сравнению с группой больных с плохим ответом на МФ были старше, имели более позднее начало СД2, а предикторами хорошего ответа на МФ являлся возраст старше 60 лет, мужской пол, низкая доза МФ. В данном исследовании не выявлено ассоциации полиморфного локуса rs11212617 гена ATM с ответом на терапию МФ в Новосибирской области, что, возможно, связано с недостаточной мощностью выборки. Нами установлено, что наличие генотипа С/С полиморфного маркера rs11212617 гена ATM было ассоциировано с высокой частотой ИБС и ИМ как в общей группе, так и в подгруппе монотерапии МФ. Причины высокой частоты ИБС, возможно, связаны с более выраженными нарушениями обмена липидов при генотипе С/С, но не исключено влияние и других негенетических факторов. Необходимо продолжить исследования в данном направлении с увеличением мощности выборки и динамическим наблюдением за показателями эффективности сахароснижающей терапии.

Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ 13-04-00520.

Авторы декларируют отсутствие явного и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Бондарь И.А. – анализ полученных данных, написание рукописи; Шабельникова О.Ю. – клиническое обследование больных, формирование базы данных, анализ полученных данных, написание статьи; Филипенко М.Л – контроль качества разработанных систем генотипирования полиморфного локуса АТМ в лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, написание статьи; Соколова Е.А. – выделение ДНК и генотипирование полиморфного локуса АТМ в лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, статистический анализ данных, написание статьи.