кандидат медицинских наук, доцент кафедры эндокринологии
MD, Ph.D., Senior lecturer of Endocrinology department
аспирант
MD, Postgraduate student of Endocrinology department
кандидат биологических наук, научный сотрудник
Ph.D. in Biology, Research associate
доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой эндокринологии
MD, PhD, Professor, Chief of Endocrinology department
кандидат биологических наук
PhD in Biology
кандидат биологических наук, научный сотрудник
PhD in Biology, Reseach associate
доктор биологических наук, заведующая лабораторией
PhD in Biology, Chief of laboratory
Цель. Провести анализ ассоциаций полиморфизма rs7903146 гена TCF7L2 (англ. Transcription factor 7-like 2 – транскрипционный фактор 7, подобный второму) с сахарным диабетом 2 типа (СД2) у жителей Башкортостана татарской этнической принадлежности.
Материалы и методы. Обследованы 169 пациентов с СД2 и 286 лиц без клинических и лабораторных признаков диабета, а также без наследственной отягощенности по диабету . Амплификацию участков ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием TaqMan-зондов.
Результаты. Выявлена более высокая частота генотипа СТ и аллеля Т в группе пациентов с СД2 при сопоставлении со здоровыми лицами (46,7% против 36,4%, Р=0,030; 41,7% против 30,8%, P=0,001 соответственно). У обладателей генотипа ТТ диабет манифестировал позже (в среднем в 59,5 лет), чем у пациентов с генотипами СТ и СС (56,1 лет, Р=0,044). Уровень базального С-пептида, показатели липидного обмена, а также индекс массы тела не отличались в зависимости от генотипов rs7903146 TCF7L2.
Заключение. Полиморфизм rs7903146 гена TCF7L2 ассоциирован с СД2 у жителей Башкортостана татарской этнической принадлежности. Аллелем риска является аллель T (OR=1,61), протективным – аллель С (OR=0,62), Р=0,001.
Aim. To perform the analysis of the association of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene rs7903146 polymorphism with type 2 diabetes mellitus (T2DM) among Tatars of Bashkortostan.
Materials and methods. In this study, 169 patients with T2DM and 286 controls without clinical symptoms and laboratory signs of diabetes and without diabetes relatives were examined. Amplification of the DNA fragments was performed using real-time polymerase chain reaction (PCR) and TaqMan technique.
Results. Genotype CT and allele T ratios were higher in the T2DM group than in controls (46. 7% vs. 36. 4%, p = 0. 030; 41. 7% vs. 30. 8%, p = 0. 001 respectively). There was a positive association between allele T and T2DM (OR = 1. 61), and allele C had a protective effect (OR = 0. 62, p = 0,001). Carriers of the ТТ genotype had later onset of T2DM (mean = 59. 5 years old) compared with carriers of the CT and CC genotypes (56. 1 years old, p = 0. 044). Basal C-peptide concentration, lipid levels and body mass index were not associated with TCF7L2 rs7903146 polymorphism.
Conclusion. TCF7L2 rs7903146 polymorphism is associated with T2DM among Tatars of Bashkortostan.
Сахарный диабет (СД) представляет собой острую медико-социальную и экономическую проблему, обусловленную широкой распространенностью, развитием инвалидизирующих осложнений, а также большими финансовыми затратами на лечение.
В Республике Башкортостан на 1 января 2014 г. количество пациентов, состоящих на диспансерном учете по поводу сахарного диабета 2 типа (СД2), составило 86 474 человека, что почти на 12 000 больше, чем в 2011 г. При этом примерно треть из них (29 734 человека) – инвалиды, а средняя продолжительность жизни от начала заболевания составляет 9,75 лет.
Одной из обсуждаемых сторон проблемы роста социально значимых заболеваний является генетическая основа предрасположенности. Наличие генетической составляющей подтверждается рядом исследований, проведенных на близнецах: установленная конкордантность у однояйцевых близнецов с диабетом составляет 80% и более [
СД2 возникает как итог взаимодействия множества генетических факторов с особенностями питания и двигательной активности индивидуума.
Недавними исследованиями был выявлен маркер предрасположенности к СД2 rs7903146 гена TCF7L2 (англ. Transcription factor 7-like 2 – транскрипционный фактор 7, подобный второму), влияющий на пролиферацию, активность и дифференцировку β-клеток.
Белок, кодируемый TCF7L2, является частью Wnt-сигнального пути, необходимого для таких важных биологических процессов, как эмбриогенез, органогенез, туморогенез. Нарушения в передаче Wnt-сигнала играют роль в развитии диабета, что реализуется через пролиферацию бета-клеток, экспрессию глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП-1) [2, 3].
Ген TCF7L2 (10q25. 3) был впервые описан в качестве предрасполагающего к СД2 в популяциях исландцев и американцев мексиканского происхождения [4, 5]. Позже данный регион был более подробно картирован у исландцев с использованием 228 микросателлитных маркеров, покрывающих 10,5-Mbp, что позволило ограничить участок в интроне 3 [
Исследования, проведенные в популяции сидхов (Индия), подтвердили ассоциацию с заболеванием 8 локусов, в том числе и TCF7L2-rs7903146, при этом данный маркер оказался наиболее сильным предиктором СД2, как и у европейцев [
Локус rs7903146 TCF7L2 показал ассоциацию с функцией бета-клеток в ряде исследований [
Механизм, посредством которого ген TCF7L2 предрасполагает к СД2, до сих пор до конца непонятен.
Выдвинуто несколько гипотез, объясняющих взаимосвязь данного гена с СД2. Продукт гена TCF7L2 может нарушать способность панкреатических островков продуцировать инсулин в ответ на стимуляцию инсулинотропным интестинальным гормоном ГПП-1 или глюкозой. Эта гипотеза основана на том наблюдении, что TCF7L2 влияет на экспрессию мРНК прекурсора глюкагона in vitro и что делеция этого гена в нокаутированных моделях мышей приводит к потере эпителиальных секретирующих клеток кишечника, которые продуцируют ГПП-1 и другие гормоны [
L.M. Hart et al. (2010) проанализировали совместное влияние 8 локусов предрасположенности к СД2, ассоциированных с функцией бета-клеток, в том числе TCF7L2, на секрецию инсулина, стимулируемую тремя различными секретагогами в ходе гипергликемических клэмпов. Выявлена достоверная отрицательная корреляция между числом рисковых аллелей и первой фазой секреции инсулина. При этом количество рисковых аллелей не было взаимосвязано со второй фазой секреции инсулина. Это предполагает, что сочетание данных рисковых аллелей преимущественно регулирует экзоцитоз гранул инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой [
В скандинавском исследовании было показано, что аллель локуса rs7903146*Т ассоциирован с риском развития СД2, нарушенной секрецией инсулина, действием инкретинов и усиленной продукцией глюкозы печенью [
В работах отечественных авторов сообщается о том, что полиморфные маркеры rs12255372 и rs7903146 гена TCF7L2 ассоциированы с развитием СД2 у русских жителей Новосибирской области и г. Москвы [19–20]. Исследования по анализу распределения частот полиморфных вариант гена TCF7L2 у пациентов с СД2 в Республике Башкортостан не проводились.
Провести анализ ассоциаций полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 с СД2 у жителей Республики Башкортостан татарской этнической принадлежности.
В исследование было включено 455 человек, мужчин и женщин (табл. 1). Из них 169 пациентов с СД2 и 286 лиц без клинических и лабораторных признаков диабета, а также без наследственной отягощенности по диабету. Обследуемые были татарской этнической принадлежности в трех поколениях и являлись жителями Республики Башкортостан. Описание выборок приведено в таблице 1.
Таблица 1. Характеристика обследованных выборок
| Показатели, m±σ (ДИ) | Контрольная группа | Пациенты с СД2 |
| Возраст, лет | 50,2±11,6 (41,0–58,0) | 61,4±9,2 (43,0–77,0) |
| ИМТ, кг/м2 | 25,7±5,1 (22,1–28,0) | 30,1±4,4 (21,0–45,7) |
| Окружность талии (ОТ), см | 92,0±11,0 (74,0–126,0) | 102,0±11,2 (74,0–130,0) |
| Длительность заболевания, лет | – | 6,1±5,3 (0,0–24,0) |
| Возраст манифестации СД2, лет | – | 55,2±8,9 (43,0–77,0) |
| Гликогемоглобин, % | 4,8±0,6 (4,3–5,3) | 6,7±1,3 (5,4–12,0) |
| Глюкоза плазмы венозной крови натощак, ммоль/л | 4,9±0,8 (4,3–5,6) | 7,1±1,9 (4,5–12,3) |
Примечание: m – среднее арифметическое; σ – стандартное квадратичное отклонение; ДИ – 75% доверительный интервал
Нормальную массу тела (ИМТ<25 кг/м2) имели 30 (17,7%) больных, избыточный вес (ИМТ 25–30 кг/м2) – 40 (23,7%), ожирение (ИМТ≥30 кг/м2) – 99 (58,6%) пациентов. На инсулинотерапии находились 20 пациентов, средняя потребность в инсулине составила 51,0±20,0 ЕД (от 35 до 63 ЕД) в сутки.
В контрольной группе нормальную массу тела (ИМТ<25 кг/м2) имели 77 (47,0%) человек, избыточный вес (ИМТ 25–30 кг/м2) – 52 (31,7%), ожирение (ИМТ≥30 кг/м2) – 35 (21,3%) человек. Данные об ИМТ у 122 человек группы сравнения отсутствовали.
Определение содержания общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) проводили методом точечной фотометрии на биохимическом анализаторе «Olimpus» фирмы «Abbott» (Германия) наборами BeckmanCoulter. Определение содержания С-пептида в сыворотке крови проводили методом ферментативно-усиленной хемилюминесценции на автоматическом анализаторе IMMULITE фирмы DPC (США) с использованием реактивов фирмы DPC.
Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) рассчитывали по стандартной формуле CKD-EPI (
ДНК выделяли из венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Амплификацию участков ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием TaqMan-зондов производства фирмы «ТестГен» (табл. 2).
Таблица 2. Последовательности праймеров, флуоресцентных зондов и условия амплификации полиморфного локуса rs7903146 гена TCF7L2
| Ген | Полиморфный маркер | Метод генотипирования | Последовательность праймеров, 5`-3` | Последовательность зондов, 5`-3’ | Температура отжига, °С |
| TCF7L2 | rs7903146 | TaqMan | ggaccaaagagaagattc gcgaagagatgaaatgta | actttttagatactatataatttaa cactttttagatattatataatttaa | 58 |
Целевыми показателями липидного обмена считали: ОХС<4,5 ммоль/л, ЛПНП<2,5 ммоль/л, ЛПВП>1,0 ммоль/л (для мужчин) и >1,3 (для женщин), ТГ<1,7 ммоль/л (Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом, 7-й выпуск).
Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ STATISTICA 6. 0 и SNPStats (
Достоверность различий частот генотипов и аллелей определяли с использованием критерия χ2 для таблиц сопряженности 2х2 (
Перед включением в исследование все пациенты подписывали информированное добровольное согласие. Исследование одобрено на заседании экспертного совета по биомедицинской этике по клиническим дисциплинам ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации 15. 11. 2013 г.
В таблице 3 представлены результаты генотипирования обследованных лиц по полиморфному участку rs7903146 гена TCF7L2. Обращает на себя внимание более высокая частота генотипа CТ и аллеля Т в группе пациентов с СД2 при сопоставлении со здоровыми индивидуумами (46,7% против 36,4%, P=0,030; 41,7% vs. 30,8%, P=0,001 соответственно). При этом доля обладателей генотипа СС и аллеля С в выборке пациентов, напротив, меньше, чем в группе сравнения: 34,9% и 51,0%, P=0,001; 58,3% и 69,2%, P=0,001 соответственно.
Таблица 3. Распределение генотипов/аллелей полиморфного участка rs7903146TCF7L2 в группе пациентов с СД2 и в контрольной группе
| Генотипы/аллели | Распределение генотипов/аллелей в группе пациентов с СД2, n (%) | Распределение генотипов/аллелей в контрольной группе, n (%) | OR (CI 95%) | P (χ2) |
| СС | 59 (34,9) | 146 (51,0) | 0,51 (0,34–0,76) | 0,001 (11,175) |
| СТ | 79 (46,7) | 104 (36,4) | 1,54 (1,04–2,26) | 0,030 (4,762) |
| ТТ | 31 (18,4) | 36 (12,6) | 1,56 (0,92–2,63) | 0,102 (2,803) |
| С | 197 (58,3) | 396 (69,2) | 0,62 (0,47–0,82) | 0,001 (11,215) |
| Т | 141 (41,7) | 176 (30,8) | 1,61 (1,22–2,13) |
Примечание: здесь и далее жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.
Продемонстрирована ассоциация генотипа CТ с риском развития СД2. Показатель OR составил 1,54 (95% CI=1,04–2,26). Использование аллельного теста показало ассоциацию аллеля Т с риском развития СД2, OR=1,61 (95% CI=1,22–2,13). Генотип CC и аллель С являются протективными в отношении СД2, OR=0,51 и 0,62 соответственно (табл. 3).
Был произведен анализ ассоциаций полиморфного локуса rs7903146 гена TCF7L2 с клинико-метаболическими характеристиками пациентов с СД2, данные которого представлены в таблице 4.
Таблица 4. Анализ клинических и метаболических параметров в зависимости от полиморфных вариантов гена TCF7L2 rs7903146 (ко-доминантная модель)
| Параметры | Генотипы | Р | ||
| TT | CC | CT | ||
| Возраст дебюта СД2*, лет | 59,5±1,8 | 56,1±0,7 | 0,044 | |
| Отягощенная наследственность по СД, % | 23,3 | 40,0 | 36,7 | 0,180 |
| Вес, кг | 79,6±2,1 | 77,9±1,8 | 78,3±1,5 | 0,830 |
| ИМТ, кг/м2 | 30,6±0,8 | 29,9±0,6 | 30,1 ±0,5 | 0,770 |
| ОТ, см | 100,9±1,9 | 101,5±1,7 | 101,9±1,4 | 0,920 |
| Глюкоза натощак, ммоль/л | 6,9±0,4 | 7,0±0,2 | 7,3 ±0,3 | 0,430 |
| HbA1c, % | 6,8±0,4 | 7,0±0,2 | 7,0±0,3 | 0,870 |
| С-пептид, нг/мл | 1,9±0,2 | 1,9±0,2 | 2,5±0,4 | 0,170 |
| Холестерин**, ммоль/л | 5,9±0,2 | 5,4±0,2 | 0,041 | |
| Триглицериды, ммоль/л | 1,8±0,2 | 1,9±0,3 | 1,5±0,1 | 0,520 |
| ЛПНП**, ммоль/л | 3,4±0,2 | 2,8±0,2 | 0,017 | |
| ЛПВП, ммоль/л | 1,1±0,0 | 1,2±0,1 | 1,1±0,1 | 0,370 |
| СКФ (CKD-EPI), мл/мин/1,73 м2 | 59,8±3,4 | 67,1±2,7 | 62,7±2,3 | 0,220 |
Наблюдались статистически значимые различия в возрасте дебюта заболевания в зависимости от градаций генотипа по полиморфному участку rs7903146 гена TCF7L2. Так, у обладателей генотипа ТТ диабет манифестировал позже (в среднем в 59,5 лет), чем у пациентов с генотипами СТ и СС (56,1 лет, Р=0,044).
Концентрация базального С-пептида не отличалась у пациентов с генотипами ТТ (1,9 нг/мл), СТ (1,9 нг/мл), СС (2,5 нг/мл). При этом средние показатели базального С-пептида в группах пациентов с разными генотипами не выходили за рамки референсных значений (0,9–4,0 нг/мл). Вероятно, это обусловлено тем, что средняя длительность заболевания обследованной группы пациентов был небольшим (6,1 лет), и можно предположить, что функция бета-клеток у них еще сохранена.
Характеризуя состояние липидного обмена, интерес представляет тот факт, что, вне зависимости от генотипа, практически ни в одной из групп не достигнуты целевые значения показателей липидного обмена (ОХС, ЛПНП, ТГ). Лишь в группе пациентов с генотипом СТ значение уровня ТГ соответствует целевым показателям (согласно Алгоритмам специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом, 7-й выпуск).
При исследовании показателей липидного обмена во взаимосвязи с генетическим маркером TCF7L2 rs7903146 было выявлено, что уровни ОХС (5,4 ммоль/л) и ЛПНП (2,8 ммоль/л) были ниже у обладателей генотипа СТ при сопоставлении с генотипами СС+ТТ (5,9 ммоль/л, Р=0,041 и 3,4 ммоль/л, Р=0,017).
Для дальнейшего анализа были отобраны пациенты, которые не получали гиполипидемической терапии, данные представлены в таблице 5. Статистически значимых различий концентраций ОХС, ТГ, ЛПНП, ЛПВП в группах пациентов с генотипами СС, СТ, ТТ обнаружено не было. В доступной литературе данные об ассоциации маркера rs7903146 TCF7L2 с показателями липидного обмена также отсутствуют.
Таблица 5. Анализ параметров липидного обмена в зависимости от полиморфных вариантов гена TCF7L2 rs7903146 (ко-доминантная модель) у пациентов с СД2, не принимающих гиполипидемические препараты
| Показатели липидного обмена | Генотипы | Р | ||
| СС | СТ | ТТ | ||
| Холестерин, ммоль/л | 5,4±0,3 | 4,8±0,3 | 5,1±0,5 | 0,420 |
| Триглицериды, ммоль/л | 1,2±0,3 | 1,4±0,2 | 1,2±0,2 | 0,780 |
| ЛПНП, ммоль/л | 2,7±0,4 | 2,5±0,3 | 2,7±0,6 | 0,880 |
| ЛПВП, ммоль/л | 1,1±0,1 | 1,1±0,1 | 1,1±0,1 | 0,980 |
Примечание: * – рецессивная модель; ** – сверхдоминантная модель
Таким образом, полиморфный участок rs7903146 гена TCF7L2 ассоциирован с риском развития СД2 в популяции татар (жителей Республики Башкортостан), что согласуется с итогами исследований, проведенных в популяциях европеоидных народов как за рубежом, так и в Российской Федерации [4–11, 19–20]. При этом аллелем риска является аллель T (OR=1,61), а протективным – аллель C (OR=0,62).
В проведенном нами исследовании у пациентов с различными генотипами уровни базального С-пептида достоверно не отличались. Данные литературы о взаимосвязи полиморфного локуса rs7903146 TCF7L2 с базальной секрецией инсулина неоднозначны. Ряд работ демонстрирует более высокие уровни инсулина натощак у обладателей генотипа СС, в некоторых исследованиях зависимости базальной секреции инсулина от полиморфных вариант rs7903146 TCF7L2 не выявлено [19, 21]. Возможно, это связано с тем, что содержание инсулина крови зависит от многих факторов, в частности, имеет место «эффект первого прохождения», когда секретируемый инсулин поступает в печень, где частично метаболизируется, а лишь затем поступает в системный кровоток.
В нашем исследовании не обнаружено ассоциаций полиморфного участка rs7903146 гена TCF7L2 с ИМТ, в то время как в ряде работ такая ассоциация была продемонстрирована. Так, в популяции жителей Венгрии было показано, что носители аллеля Т имели более низкий ИМТ в сравнении с обладателями генотипа СС в группах пациентов с СД2 и LADA-диабетом [
Интересными представляются данные о возрасте манифестации СД2 в зависимости от генотипов rs7903146 TCF7L2. Так, у пациентов, имеющих в генотипе «защитный» аллель С, заболевание диагностировалось в среднем на 3,4 года раньше. По-видимому, в патогенезе СД2 у таких пациентов играют роль полиморфные варианты иных генов с более «агрессивным» влиянием на течение заболевания.
Проведенное исследование позволило выявить ассоциацию полиморфного локуса rs7903146 гена TCF7L2 с СД2 у представителей татарской этнической группы Башкортостана. Показано, что генетическим маркером повышенного риска СД2 является аллель Т (OR=1,61).
Полученные результаты еще раз подчеркивают важность изучения молекулярно-генетических механизмов развития СД2 в зависимости от популяционной структуры населения. Для понимания патофизиологических основ СД2 необходимы дальнейшие репликативные исследования ассоциаций полиморфных маркеров, выявленных в процессе полногеномных поисков, с СД2 в различных популяциях Российской Федерации.
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов, связанных с рукописью.
Работа получила частичную финансовую поддержку РГНФ №13-06-00101 и РФФИ 14-06-97003 р_Поволжье.
Участие авторов: Авзалетдинова Д.Ш. – подбор пациентов для исследования, подписание информированного согласия, сбор анамнеза, физикальное обследование, забор венозной крови, статистическая обработка данных, написание статьи; Шарипова Л.Ф. – подбор пациентов и лиц контрольной группы для исследования, подписание информированного согласия, сбор анамнеза, физикальное обследование, забор венозной крови, определение уровня липидов и С-пептида; Кочетова О.В. – проведение амплификации участков ДНК, написание статьи; Моругова Т.В. – подбор пациентов для исследования, забор венозной крови, написание статьи; Эрдман В.В. – выделение ДНК из венозной крови лиц контрольной группы; Сомова Р.Ш. – выделение ДНК из венозной крови пациентов с СД2; Мустафина О.Е. – контроль за проведением молекулярно-генетических исследований, написание статьи.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.