Оценить интенсивность репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей у пациентов с синдромом диабетической стопы (СДС) на фоне местного применения отрицательного давления по сравнению со стандартной консервативной терапией. 

В исследование был включен 31 пациент (10 женщин и 21 мужчина) с нейропатической и нейроишемической формами (после реваскуляризации) СДС, которым была проведена хирургическая обработка раневого дефекта. 

В качестве предоперационной подготовки к пластическому закрытию в течение 8±4 дней 13 больным (группа 1) применялась терапия отрицательным давлением (-90–120 мм рт.ст.) (VivanoTec, Hartmann, Германия). Смена повязки проводилась 1 раз в 3–4 дня с оценкой динамики размеров и состояния раны.

Пациенты группы контроля (18 человек) находились на стандартной терапии (ежедневная смена атравматических повязок с жидкими антисептиками: промывание послеоперационной раны водным раствором йода (Бетадин, Повидон-йод), повязка Inadin, Systagenix; Silcofix, Povi). 

Критерием готовности раны к закрытию являлось заполнение ее полости грануляциями на 75% и более.

До и после местного лечения пациентам проводился забор биопсийного материала тканей раневого ложа с последующим гистологическим и ИГХ исследованиями.

Пациенты обеих групп были достоверно сопоставимы по возрасту, уровню контроля углеводного обмена, выраженности микрососудистых осложнений, форме СДС, площади и глубине раневых дефектов, состоянию кровотока нижних конечностей (p>0,05). Группы незначительно отличались по длительности СД. (табл. 1).

При анализе результатов гистологического и ИГХ исследований биоптатов раневых дефектов, полученных после хирургической обработки и до начала предполагае­мого лечения, установлено, что обе группы были также сопоставимы по состоянию репаративных процессов в мягких тканях. В обеих группах отмечался выраженный отек, плохо организованный экстрацеллюлярный матрикс (ЭЦМ), низкое содержание фибробластоподобных клеток и выраженный воспалительный инфильтрат (р<0,05). По результатам ИГХ исследования до начала терапии отмечалось интенсивное окрашивание маркера макрофагов (CD68) и матриксной металлопротеазы-9, слабое окрашивание TIMP-1. Данные результаты подтверждают замедление процессов репарации в мягких тканях у обеих групп больных. Все лабораторные исследования образцов крови проводились по стандартным методикам на базе биохимической лаборатории ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ России (зав. отделением – Ильин А.В.).

Площадь раны определялась методом очерчивания контуров раны через прозрачную масштабную пленку с последующим подсчетом площади внутри контура по специальным формулам (Opsite Flexgrid, Smith and Nephew).

Транскутанная оксиметрия выполнена на аппарате Radiometer (Дания). Датчики накладывались на расстоянии 0,5–1 см от краев раны.

Морфологические исследования проведены в отделении патоморфологии ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ России (и.о. зав. отделением – к.м.н. Абдулхабирова Ф.М.). Морфологический анализ биопсийного материала включал гистологический и ИГХ методы исследования до и после проводимого лечения. Материал фиксировали в 10% растворе формалина, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные срезы толщиной 3–5 мкм депарафинировали по стандартной схеме и окрашивали гематоксилином и эозином.

Гистологические критерии воспаления, регенерации и состояния грануляционной ткани были оценены количественным методом согласно общепринятым прин­ципам.

ИГХ исследование выполнили на иммуностейнере Leica BOND-MAX. Использовали характеристики антител фирмы Dako в стандартных разведениях с использованием положительного контроля. Применялись антитела к тканевому ингибитору металлопротеиназы-1 (ТИМП-1), к матриксной металлопротеазе-9 (ММП-9), маркеру макрофагов CD68.

Оценка экспрессии цитоплазматических маркеров (ТИМП-1, ММП-9, CD68) проводилась полуколичественным методом: 1«+» окрашивание единичных клеток (менее 30% клеток), 2«+» – 30–60% клеток, 3«+» – 60–90%, 4 «+» – более 90% клеток.

Исследование проведено в дизайне сравнительного.

Протокол исследования одобрен на заседании этического комитета ФГБУ ЭНЦ от 28 ноября 2012 г. (протокол №18). Всеми пациентами подписано информированное согласие на участие в исследовании.

Статистический анализ проведен с помощью программы «Статистика 7.0» (StatSoft). Для сравнения количественных признаков использовали критерий Манна-Уитни, для качественных – точный критерий Фишера. Для описания признаков использовали среднее значение со среднеквадратичным отклонением. Корреляцию проводили по Спирмену. Нулевая гипотеза отвергалась при p≤0,05.

На рис. 1 представлена динамика клинического состояния раневых дефектов после 8±4 дней терапии. 

На фоне терапии отрицательным давлением у пациентов удалось достигнуть сокращения площади и глубины раневых дефектов на 26,6±17,2% и 40,5±25,6% соответственно (по сравнению с исходными данными) (p<0,05). В отличие от группы контроля, где данные показатели составляли 23,5±19,4 и 21,8±21,6% соответственно (p<0,05). 

Однако динамика размеров ран на фоне лечения существенно не различалась между группами (p=0,064), в отличие от динамики глубины. В группе, получавшей терапию отрицательным давлением, определялось более значимое сокращение глубины ран после лечения по сравнению с группой контроля (p=0,037).

По результатам транскутанной оксиметрии в группе 1 зафиксировано более выраженное усиление локальной микрогемодинамики по сравнению с группой контроля (p<0,05). 

Важным критерием подготовки раны к пластическому закрытию является ее заполнение грануляционной тканью более чем на 75%. У 95% пациентов группы 1 сочные грануляции заполняли 89,1±17% раневого дефекта.

У 89% пациентов из группы контроля грануляции покрывали 54,3±18% раневого ложа (p<0,05).

Установлена корреляционная связь между длительностью вакуум-терапии и динамикой размеров ран. Разница площади язвенных дефектов имеет более высокую корреляцию как со значениями отрицательного давления, так и с длительностью вакуум-терапии (коэффициенты 0,34 и 0,55 соответственно).

В контрольной группе длительность терапии коррелировала с изменением площади и глубины ран с коэффициентами 0,18 и 0,46 соответственно (рис. 2, 3).

По данным гистологического исследования тканей раневых дефектов после лечения в группе 1 по сравнению с группой контроля отмечалось существенное уменьшение отека на 80% (p<0,05), организация экстрацеллюлярного матрикса (p<0,05), исчезновение воспалительного инфильтрата на 90% (p<0,05) и формирование здоровой грануляционной ткани (p<0,05). 

В ходе ИГХ исследования с антителами к маркеру макрофагов CD68 на фоне проведенного лечения отмечалось снижение количества макрофагов в дерме. В обеих группах до лечения выраженность экспрессии CD68 в баллах составляла 2,5±0,5 (p>0,05), после лечения в группе 1 – 1,5±0,3 балла (p<0,05), в группе 2 – 2,0±0,6 баллов (p<0,05). До лечения уровень экспрессии MMP-9 в обеих группах в среднем составлял 3,5±1 баллов (p>0,05). В обеих группах на фоне лечения было зафиксировано снижение уровня ММР-9: в группе 1 – до 3±0,5 баллов, в группе 2 – до 2,8±0,4, однако данные различия не были статистически значимы (p=0,05). Уровень экспрессии ТИМП-1 на фоне терапии отрицательным давлением, наоборот, существенно повысился: с 2,5±0,5 баллов до 3,3±0,3 (p<0,05), в отличие от группы контроля, где данный показатель, наоборот, снизился с 2,5±0,6 баллов до 1,8±0,6 (p<0,05). Соотношение MMP-9/TIMP-1 было ниже в группе 1 (p<0,05). 

Были изучены особенности репаративных процессов в мягких тканях нижних конечностей у 31 пациента с нейропатической и нейроишемической формами (после восстановления кровотока) СДС, получавших в периоперационном периоде терапию отрицательным давлением или стандартное лечение.

Больные были сопоставимы по возрасту, длительности СД, выраженности микрососудистых осложнений, размерам и состоянию раневых дефектов, оксигенации мягких тканей.

По результатам гистологического исследования тканей раневых дефектов до лечения зафиксировано замедление репаративных процессов, что проявлялось выраженным межклеточным отеком, дезорганизацией экстрацеллюлярного матрикса и выраженными воспалительными проявлениями. Полученные данные совпадают с результатами опубликованных ранее исследований, свидетельствующих о замедлении процессов заживления у пациентов с СД [2, 3, 5].

Установлено, что раны при нарушениях углеводного обмена характеризуются более продолжительной фазой воспаления, снижением активности воспалительных клеток и замедлением перестройки ЭЦМ. Именно эти нарушения способствуют переходу раны из острой в хроническую [7]. 

Известно, что у лиц с СД снижено количество продуцируемого коллагена, что приводит к замедлению сокращения размеров раны. Известно, что в фазе воспаления основными клетками, участвующими в процессе заживления, являются макрофаги, синтезирующие такие факторы роста, как фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста (TGF), колониестимулирующий фактор роста (GM-CSF) [8]. Они играют одну из ключевых ролей в переходе раны в фазу заживления за счет организации экстрацеллюлярного матрикса и коллагеновой сети. Когда фаза воспаления сменяется фазой пролиферации, происходит снижение уровня макрофагов и миграция кератиноцитов в раневое ложе, взаимодействие между матриксными металлопротеиназами (ММР), интегринами и цитокинами, в результате чего происходит продукция ЭЦМ [3]. В ходе ИГХ исследования мягких тканей ран отмечено повышенное количество макрофагов (высокий уровень экспрессии CD68), повышение уровня ММР-9 и снижение уровня экспрессии TIMP.

Таким образом, полученные клинические и морфологические результаты свидетельствуют о хроническом течении раневого процесса. Можно предположить, что причиной замедления заживления является «застревание» ран в фазе воспаления, что подтверждается результатами как гистологического, так и ИГХ методов исследования. 

В литературе описаны положительные эффекты вакуум-терапии: клеточные (формирование грануляционной ткани), внеклеточные (усиление кровотока, уменьшение отека и снижение протеолитической активности раневой среды) и комплексные (очищение раны, контроль инфекции, возможность анализа полученного экссудата) [13].

На фоне терапии отрицательным давлением у пациентов удалось достигнуть сокращения площади и глубины раневых дефектов на 26,6±17,2% и 40,5±25,6% соответственно (по сравнению с исходными данными). В отличие от группы контроля, где данные показатели составляли 23,5±19,4 и 21,8±21,6% соответственно. 

Следовательно, можно говорить о более высокой эффективности отрицательного давления в сокращении размеров ран. 

В ходе лечения в группе 1 отмечался более интенсивный прирост грануляционной ткани, выстилающей раневое ложе. Данные клинические эффекты позволили выполнить следующий этап хирургического лечения у пациентов этой группы в более ранние сроки.

У пациентов группы 2, которым проводили ежедневные перевязки с антисептическими растворами, размеры раны сократились в меньшей степени, у 89% пациентов определялось низкое качество грануляций и обильная экссудация, что потребовало повторной хирургической обработки и увеличило сроки пребывания больных в стационаре (рис. 4–7).

По результатам транскутанной оксиметрии прирост парциального давления кислорода составил 23,2% (в группе контроля – 18%). Как известно, неоваскуляризация и усиление локальной гемодинамики являются важнейшими факторами, способствующими заживлению раневых дефектов. Так, исследование Dinh et al. продемонстрировало, что количество сосудов в дерме (по данным световой микроскопии) было выше в группе пациентов, чьи язвенные дефекты при СДС быстрее эпителизировались [14]. 

Следствием улучшения микрогемодинамики можно считать существенное уменьшение отека, организацию ЭЦМ, практически полное исчезновение воспалительного инфильтрата и формирование здоровой состоятельной грануляционной ткани, достоверно более выраженные в группе 1 (p<0,05), что подтверждается результатами гистологического и ИГХ исследований. 

По результатам ИГХ в группе 1 зафиксировано более выраженное снижение уровня макрофагов, что говорит о переходе раневого процесса из фазы воспаления в фазу пролиферации. Сходные результаты были получены в исследовании F.Bassetto et al., где к 7-м суткам терапии отрицательным давлением отмечалось существенное снижение маркера макрофагов (CD68) [13] (рис. 9).

Известно, что ММР-9 и TIMP-1 непосредственно участвуют в формировании ЭЦМ. Данные коллагеназы вырабатываются эндотелиальными клетками и фибробластами и участвуют в формировании ЭЦМ и в дальнейшем рубцовой ткани [9–11]. У лиц с раневыми дефектами нижних конечностей и СД соотношение ММР-9/TIMP-1 повышено и является одной из причин замедленного заживления ран [9]. В настоящем исследовании в обеих группах была зафиксирована тенденция к снижению уровня ММР-9, соотношение MMP-9/TIMP-1 было ниже в группе 1 (p<0,05). Можно сделать вывод о том, что на фоне местного применения отрицательного давления происходит лучшая организация ЭЦМ.

Muller M. в своей работе предлагают использовать соотношение MMP-9/TIMP-1 в качестве предиктора заживления ран при СДС [10]. Li Z. в своей работе описали, что соотношение MMP-9/TIMP-1 в раневой жидкости снижалось в ходе успешно проводимого лечения раневых дефектов у лиц с СД2, в отличие от группы пациентов, чьи трофические язвы плохо поддавались консервативному лечению, этот показатель оставался повышенным [15]. По данным исследования Dinh Т., получены аналогичные результаты: уровень ММР-9 был значимо повышен у пациентов с плохим заживлением раневых дефектов при СДС по сравнению с группой без СДС и группой, где язвенные дефекты хорошо поддавались консервативному лечению [14] (рис. 10, 11).

Вакуум-терапия может влиять на заживление ран, ингибируя протеазы, однако на сегодняшний день однозначных данных о том, какой эффект преобладает при лечении отрицательным давлением (синтез факторов роста или ингибирование протеаз), нет [16]. 

Несмотря на небольшой объем выборки больных, на основании полученных данных можно утверждать, что терапия отрицательным давлением эффективно влияет на репаративные процессы в мягких тканях нижних конечностей у лиц с нарушенным углеводным обменом и может служить методом выбора при подготовке к последующим этапам хирургического лечения.

Однако в настоящий момент количество данных об отдаленных результатах проведенного лечения недостаточно, что требует продолжения исследований.

Исследование проведено при спонсорской поддержке ФГБУ ЭНЦ в рамках утвержденной темы НИР.

Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведением исследования и публикацией настоящей статьи.