Цель исследования состояла в изучении функциональной активности и маркеров апоптоза НГ при СД1 у детей.

Обследовано 25 детей с СД1 в возрасте 7–15 лет (табл. 1). Пациенты были разделены на группы в зависимости от длительности заболевания. В группу I вошли 12 детей с длительностью заболевания менее 3 лет. Средний возраст пациентов составил 9,7±0,42 лет, средняя длительность заболевания – 1,7±0,49 лет. В группу II включены 13 детей с длительностью СД1 более 3 лет. Средний возраст детей составил 13,3±0,99 лет, средняя длительность заболевания – 7,1±0,88 лет. Показатели гликированного гемоглобина в группе I достигали 11,3±0,90%, в группе II – 10,0±0,71%. 

Контрольную группу составили 15 здоровых детей в возрасте 7–15 лет. 

Всеми пациентами и их родителями были подписаны информированные согласия на участие в исследовании.

Для оценки программируемой клеточной гибели выявляли количество НГ, экспрессирующих маркеры апоптоза. Нейтрофилы выделяли на двойном градиенте плотности Ficoll-Paque и фиколл-урографин (GE Healthcare, Швеция). Суспензию клеток трижды отмывали в среде RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия). В культурах нейтрофилов оценивали количество клеток, экспрессирующих рецепторы CD95, CD95L, Bcl2 методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (Invitrogen, США). 

Фагоцитарный индекс определяли по способности НГ поглощать частицы меламиноформальдегидных латексов. Уровень кислородзависимой бактерицидности НГ оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по числу клеток, содержащих фармазан (фармазанположительные клетки). Содержание лизосомальных катионных белков (ЛКБ) определяли методом Шубича М.Г., уровень миелопероксидазы (МП) – методом Грэхема–Кнолля. Рассчитывали средний цитохимический коэффициент по принципу Астальди.

Оценку сопутствующих инфекционно-воспалительных заболеваний проводили на основании клинического обследования в специализированном отделении и анализа амбулаторных карт из детской поликлиники, принимая во внимание результаты диспансерного наблюдения у педиатра, отоларинголога, дерматолога. 

Для статистического анализа данных использовали пакет программ Primer of Biostat 4,0, Attestat 10.5.1. Для оценки межгрупповых различий применяли дисперсионный анализ повторных измерений с вычислением критериев Ньюмена–Кейлса, Данна. Анализ качественных признаков выполнялся с использованием критерия χ2. Количественные значения с нормальным распределением были представлены как среднее±стандартная ошибка средней (X±sx); признаки, характеризующиеся ненормальным распределением – в виде медианы и интерквартильного (25 и 75 процентили) размаха (Me (Q1-Q)). Достоверными считали различия при р<0,05.

При изучении функциональной активности ПМЯЛ установлено снижение уровня фагоцитоза у детей с длительностью заболевания более 3 лет (72,9±2,35, p<0,05). У пациентов с длительностью СД1 менее 3 лет показатели фагоцитоза не отличались от контрольной группы (табл. 2). 

Показатели оксидазной активности НГ по данным спонтанного НСТ-теста достоверно уменьшались по сравнению с контрольной группой, уровень функцио­нального резерва (ИС НСТ) был снижен у детей с длительностью заболевания более 3 лет. 

При сравнительной характеристике показателей функциональной активности НГ в группе детей, страдающих СД1 более 3 лет, установлены более низкие показатели фагоцитоза (p<0,05) и ИС НСТ-теста (p<0,05) (табл. 2) по сравнению с детьми, болеющими менее 3 лет. 

У пациентов обеих групп выявлено увеличение цитоэнзимохимических показателей – уровня МП и лизосомальных катионных белков по сравнению с контрольной группой (с более высокими значениями МП у детей с длительностью заболевания более 3 лет). 

При исследовании маркеров апоптоза установлено увеличение экспрессии проапоптотических маркеров CD95, снижение антиапоптотических – Bсl2 (табл. 3). Максимальные показатели CD95 зарегистрированы у детей с длительностью заболевания более 3 лет. 

Установлено увеличение процента ПМЯЛ, имеющих на своей поверхности CD95L. Наиболее высокие показатели выявлены у детей с длительностью заболевания более 3 лет. 

Развитие сопутствующих инфекционно-воспалительных заболеваний отмечено у 72% включенных в исследование детей, что превышало аналогичные показатели в контрольной группе (20%), p<0,05. 

Частые респираторные инфекции регистрировались у детей обеих групп (табл. 4). Хронический тонзиллит диагностировался у 33,4% в группе I и у 30,8% в группе II. Хронический гайморит встречался только в группе II (23,1%). 

Инфекции мочевыводящих путей верифицировались в единичных случаях. Цистит был выявлен в 8,3% в группе I и в 7,7% в группе II. Хронический пиелонефрит был диагностирован только в группе II (15,4%). 

Заболевания кожи встречались у 16,7% детей в группе I и у 41,7% – в группе II. В структуре патологии имели место стрептодермии – у 16,7% детей в группе I и у 15,4% в группе II, рецидивирующий herpes в группе II – 23,1%, аллергический дерматит – у 8,3% и 23,1% соответственно.

В единичных случаях у детей группы I (8,3%) отмечался кандидоз слизистой полости рта. У школьников длительностью СД1 более 3 лет наблюдались повторные эпизоды стоматита (23,1%).

При сравнительной характеристике частоты инфекционно-воспалительных заболеваний в зависимости от длительности заболевания более высокие показатели отмечались у детей II группы. Однако достоверных межгрупповых различий получено не было, что, вероятно, связано с небольшим объемом выборок. 

Известно, что структурно-метаболический статус ПМЯЛ неразрывно связан с выполнением их физиологических задач и складывается из активации, адгезии, хемотаксиса клеток, поглощения антигена, его киллинга и расщепления. Нами установлено снижение количества фагоцитирующих клеток у детей с длительностью заболевания более 3 лет, что согласуется с результатами большинства исследований, посвященных фагоцитарной активности при СД1 [2, 10, 11]. 

Известно, что нарушению поглотительной и хемотаксической функции ПМЯЛ при СД могут способствовать гипергликемия и гиперкетонемия, под действием которых нейтрофилы приобретают сферическую форму и в значительной мере теряют способность образовывать псевдоподии. В результате снижаются адгезивные и эмиграционные свойства НГ, затрудняется поглощение, кэпинг [4]. 

В работе показано уменьшение показателей спонтанного и стимулированного НСТ-теста у детей с СД1, что может быть связано с нарушением процесса дегрануляции – слияния специфических и азурофильных гранул ПМЯЛ с их фагосомами. Известно, что дегрануляция – энергозатратный процесс. В экспериментальных условиях выявлено, что при СД в ПМЯЛ значительно сокращаются запасы гликогена, тормозится его синтез, снижается активность ключевых ферментов анаэробного окисления глюкозы и пентозного цикла, что приводит к уменьшению внутриклеточных запасов АТФ [15].

При сравнительной характеристике показателей функциональной активности НГ в группе детей, страдающих СД1 более 3 лет, были установлены более низкие показатели фагоцитоза и НСТ-теста по сравнению с детьми, болеющими менее 3 лет, что, вероятно, связано с длительностью заболевания и функциональным истощением НГ [16]. 

У пациентов обеих групп выявлено увеличение цитоэнзимохимических показателей – уровня МП и лизосомальных катионных белков по сравнению с контрольной группой с более высокими значениями МП у детей с длительностью заболевания более 3 лет. Полученные нами данные, вероятно, могут свидетельствовать об увеличении биоагрессивного потенциала нейтрофилов периферической крови у детей с СД1 вследствие увеличения продукции HOCl и катионных белков. Известно, что наиболее цитотоксичными продуктами миелопероксидазной системы являются гипохлорная кислота и гипохлорит-анион, которым принадлежит роль основных повреждающих агентов в биологических системах [17].

Нами установлено, что течение СД у детей сопровождается увеличением процента нейтрофилов, экспрессирующих маркеры апоптоза (CD95), и уменьшением доли клеток, имеющих на своей поверхности антиапоптотические белки. Наиболее выраженная активация апоптоза отмечена в группе детей с длительностью заболевания более 3 лет.

По данным литературы, интенсивность апоптоза нейтрофилов при СД может быть как низкой [18, 19], так и высокой [12, 13, 20]. Установлено, что ПМЯЛ больных СД не демонстрируют замедление апоптоза, индуцированное бактериями и липополисахаридом [13]. Существует мнение, что нарушение утилизации глюкозы и глютамина может быть фактором, предрасполагающим к повышенному апоптозу ПМЯЛ [2]. 

Однако в литературе имеются сведения и о снижении скорости апоптоза НГ при СД, что, вероятно, инициирует процессы хронического воспаления с повреждением ткани ПЖ [18, 19].

В исследовании выявлено увеличение процента клеток, имеющих на своей поверхности CD95L, что может способствовать усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых β-клетках ПЖ, инфильтрированных лейкоцитарными клетками. Наиболее высокие показатели отмечены у детей с длительностью заболевания более 3 лет. 

Таким образом, увеличение апоптотического потенциала НГ на фоне функционально-метаболических изменений является отражением активного вовлечения НГ в иммунопатогенез заболевания. 

Установлено, что гиперэкспрессия отдельных факторов биоцидности ПМЯЛ в виде увеличения МП и ЛКБ сопровождается усилением их апоптоза, что может быть связано с изменением метаболизма глютамина в НГ при развитии и прогрессировании СД. 

Вместе с тем установлено снижение бактерицидной активности нейтрофилов с дефицитом поглощения, секреции активных радикалов кислорода, функционального резерва. Степень функциональной недостаточности зависит от длительности заболевания и увеличивается у детей, болеющих СД1 более 3 лет.

Известно, что ПМЯЛ являются связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом и выполняют главенствующую роль в антибактериальной защите. Нарушение их функциональной компетенции у детей с СД1 становится одним из факторов, предрасполагающих к развитию инфекционных заболеваний. У детей, страдающих СДI, отмечена повышенная чувствительность к инфекционным заболеваниям, что согласуется с данными зарубежных исследователей [2, 3, 14].

Работа выполнена в рамках федеральной целевой научной программы. Номер государственной регистрации 01200954364.

Выполнение настоящего исследования одобрено Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ (ул. Мира, 310). Протокол №16 от 14 мая 2012 г.

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведенным исследованием и публикацией настоящей статьи.