Комплемент является важным фактором врожденного иммунитета, играющим существенную роль в развитии иммунных и воспалительных реакций. Представляя собой первичный барьер на пути развития инфекционных процессов, инициируя огромное разнообразие клеточных и гуморальных реакций и межмолекулярных взаимодействий, формирующих иммунный ответ, комплемент, по сути, является цитотоксичной системой защиты организма, обеспечивающей в норме элиминацию инородных патогенов, токсических продуктов тканевого распада, опсонизацию некротических и апоптотических клеток, облегчая их захват фагоцитами, индукцию и усиление воспаления, а также секрецию иммунорегуляторных молекул и удаление из кровотока иммунных комплексов. Однако неконтролируемая активация комплемента, приводящая к гиперпродукции опсонинов, медиаторов воспалительных процессов и цитолитических комплексов, в патологических условиях может приводить к повреждению здоровых тканей организма [1–6]. Система комплемента активируется в каскаде протеолитических реакций и состоит из более чем 60 растворимых и мембраносвязанных белков, включая рецепторы и регуляторы. Существуют три пути активации комплемента – классический, альтернативный и лектиновый, отличающиеся составом компонентов и пусковыми механизмами. Конечный этап, так называемый терминальный каскад комплемента, идентичен для всех трех путей. Этот каскад запускается расщеплением С3 компоненты комплемента на активные фрагменты под действием C3-конвертазы (продукта активации всех трех путей) и приводит к формированию мембраноатакующего комплекса (С5b-9; МАК) или конечного продукта активации комплемента. Встраиваясь в плазматическую мембрану, МАК приводит к ее перфорации и лизису клетки. МАК может также выступать триггером апоптоза, инициировать продукцию клетками медиаторов воспаления, цитокинов, простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов, активных форм кислорода и экспрессию адгезивных молекул [1–6]. Нарушения иммунного статуса организма вносят существенный вклад в патогенез обоих типов сахарного диабета (СД) [7–9]. Хорошо известно, что преждевременная инвалидность и смертность больных СД 2 типа (СД2) в первую очередь связана с его макроваскулярными осложнениями (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей и пр.), индуцирующими развитие воспалительных реакций [10, 11]. C другой стороны, гиперактивация иммунного ответа организма, индуцируемая окислительным стрессом или рядом других факторов, приводит к дисфункции инсулинпродуцирующих бета-клеток и инсулинорезистентности [12, 13], способствуя развитию СД2. В связи с вышеизложенным, представляется интересным изучение функционального состояния системы комплемента при СД2. Результаты наших предыдущих исследований свидетельствуют о значительном повышении в крови больных СД2 активности классического и альтернативного каскадов комплемента [14]. В настоящей работе мы провели сравнительный анализ уровней МАК, а также гемолитической активности C1 и C3 компонентов комплемента в крови больных вышеотмеченным заболеванием. В исследование были также включены здоровые лица (ЗЛ) в качестве контроля. Методы Субъектами исследования являлись 37 больных СД2 (женщин – 20, мужчин – 17; средний возраст – 58±9 лет (М±d)) и 37 здоровых лиц без наследственной отягощенности СД (женщин – 20, мужчин – 17, средний возраст – 52±12 лет (М±d)). Больные состояли на учете в Научно-медицинском центре «Армения» МЗ РА. Диагностирование пациентов проводили врачи вышеуказанного учреждения согласно Международной классификации болезней (10 издание, МКБ-10). Средняя длительность заболевания диабетом у больных СД2 составляла 11±7 лет (М±d). У всех больных СД2 наблюдалось тяжелое течение заболевания, сопровождающееся осложнениями, характерными для поздних этапов развития диабета (макроангио-, микроангио- и нейропатии). Группу ЗЛ (без наследственной отягощенности инсультом, инфарктом миокарда и СД) добровольно составили сотрудники НАН РА. Никто из субъектов исследования не страдал онкологическими или аутоиммунными заболеваниями, не переносил инсульт или инфаркт миокарда, острых инфекционных заболеваний, не подвергался хирургическим операциям и не принимал препараты иммуномодуляторного действия как минимум за 12 месяцев до проведения настоящего исследования. Взятие крови было проведено с согласия больных или их близких, а также с разрешения Комитета по этике Института молекулярной биологии НАН РА. Забор крови проводили в 9:00 часов натощак пункцией из локтевой вены. Пробы сразу помещали в лед, затем центрифугировали при 3000g в течение 10 минут и отбирали сыворотку, которую использовали в последующих экспериментах. Образцы сыворотки хранили при -30°C. Определение уровней МАК в образцах сыворотки крови субъектов исследования проводили ранее описанным нами методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) [15]. В качестве связывающих антител были использованы мышиные моноклональные антитела, специфичные к неоэпитопам С9 компоненты МАК, экспонированной на поверхности еще не включенных в мембраны водорастворимых МАК. Связанные с антителами МАК обнаруживали при использовании кроличьих антител (конъюгированных с пероксидазой хрена), полиспецифичных к другой компоненте МАК – белку S, и о-фенилендиамин дигидрохлорида (в 3% перекиси водорода) в качестве субстрата. Измерения проводили при использовании прибора «Stat Fax 3200» (Awareness Technology Inc., USA) на микропланшетах с 96 ячейками, при длине волны 492 нм. Калибровку проводили при использовании стандартной сыворотки с известной концентрацией МАК. Концентрацию МАК выражали в микрограммах на 1 мл сыворотки (мкг/мл). Гемолитическую активность C1 и C3 компонентов комплемента определяли ранее описанным методом при использовании эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами в качестве субстрата и дефицитных по этим компонентам сывороток [16]. C1-дефицитную сыворотку получали аффинной хроматографией сыворотки крови человека как описано ранее [17]. С3-дефицитную сыворотку получали обработкой сыворотки крови морской свинки зимосаном ранее описанным методом [18]. Активность выражали в процентах лизировавших эритроцитов (% лизиса). Долю лизированных эритроцитов определяли с учетом их спонтанного лизиса (контроль) и рассчитывали по отношению к 100% лизису (положительный контроль). Измерения проводили при длине волны 414 нм на спектрофотометре CE-292 (Cesil Instruments Ltd., UK). Статистическую обработку полученных данных, включающую непараметрический U-тест Манна–Уитни, проводили используя программный пакет «SPSS-13». Значения p<0,05 были приняты как статистически достоверные. Результаты и обсуждение В результате проведенных исследований было установлено, что уровни МАК в крови больных СД2 в среднем в 1,6 раза достоверно превышают уровни МАК в крови ЗЛ. Уровни C1 и С3 компонентов комплемента в крови больных СД2 в среднем в 2,2 раза превышали аналогичные параметры ЗЛ. Результаты статистического анализа полученных данных представлены в таблице 1. C1q является начальным звеном классического каскада комплемента, C3 является начальным звеном альтернативного каскада комплемента и, одновременно, как уже было отмечено, мишенью C3-конвертазы, запускающей терминальный каскад комплемента [1–6]. Полученные нами данные подтверждают результаты наших предыдущих экспериментов, свидетельствующих о гиперактивации альтернативного и классического каскадов комплемента при СД2, а кроме того, представляют убедительные доказательства гиперактивации терминального каскада комплемента при отмеченном заболевании. Наши данные находятся в соответствии с результатами ранее опубликованных иммуногистохимических исследований, выявивших накопление промежуточного и конечного продуктов активации комплемента C3d и МАК, соответственно, на стенках эндоневральных микрососудов и микрососудов сетчатки у больных СД [19, 20]. Таким образом, очевидно, что при СД2, на этапе поздних осложнений происходит гиперактивация системы комплемента, включая его альтернативный, классический и терминальный каскады, и гиперпродукция его цитотоксических продуктов. Гиперактивность системы комплемента при СД2 может быть обусловлена комплексом гормонально-метаболических и генетических нарушений, наблюдающихся при данной патологии [21–23]. С другой стороны, накопление продуктов активации системы комплемента может в значительной степени способствовать дальнейшему прогрессированию заболевания. В основе хронических осложнений СД2 лежит повреждение стенок микрососудов, а также нарушение тромбоцитарно-сосудистого и гуморального звеньев системы гемостаза [11, 24]. Это меняет их антигенные и функциональные характеристики, вызывает нарушение проницаемости и прочности стенки сосуда, развитие в ней иммунопатологических реакций, сужение просвета сосудов и уменьшение площади их внутренней поверхности, развитие отека, сужение просвета микрососудов и углубление в них дистрофических процессов [11, 24]. Очевидно, что наряду с другими факторами, сверхпродукция хемотоксинов, опсонинов, анафилатоксинов и МАК в результате гиперактивации системы комплемента может в значительной степени способствовать прогрессированию отмеченных патологических изменений. Так, например, вопрос о причинной взаимосвязи между уровнем гликемии и риском развития хронических осложнений при СД2 получил свое реальное клиническое выражение в соотношении уровня компенсации углеводного обмена и частоты развития микро- и макроангиопатий. Показано, что риск развития сосудистой патологии при СД2 значительно возрастает даже при незначительном повышении (на 1%) уровня гликированного гемоглобина [25]. В этой связи интересно отметить, что помимо цитотоксических эффектов, встраивание МАК в мембраны клеток сосудистого эндотелия приводит к высвобождению факторов роста, стимулирующих пролиферацию клеток, способных также при длительном воздействии индуцировать гипертрофию и тромбогенную трансформацию сосудистой стенки [1–6]. В норме продукция МАК, даже в условиях гиперактивации системы комплемента, находится под контролем регуляторного белка CD59, способного препятствовать формированию МАК в процессе активации комплемента [26, 27]. Однако, как свидетельствуют экспериментальные данные, в гликированном состоянии CD59 теряет способность ингибировать образование МАК [28–30]. Это факт представляет непосредственный интерес в свете полученных нами данных, поскольку, как известно, для патогенеза СД2 характерны повышение пролиферации гладкомышечных клеток сосудов и ретинальных эндотелиальных клеток и, как результат, гипертрофия и тромбогенная трансформация сосудистой стенки, приводящие к нарушению проницаемости сосудов и ангиопатиям [11, 24]. Кроме того, показано, что, как свидетельствуют клинические и экспериментальные данные, для СД2 характерна интенсификация апоптоза в нейрональной и сосудистой ткани, стимулирующая развитие ретинопатии [31, 32]. В этой связи и основываясь на полученных нами данных, не исключено, что определенный вклад в этот процесс вносят продукты протеолитической активации С3 и С4 компонентов комплемента (C3b, C4b, iC3b и C3dg), являющиеся известными триггерами апоптоза [1–6]. Таким образом, основываясь на полученных нами и вышеприведенных данных, можно заключить, что один из механизмов развития сосудистых осложнений СД2, индуцируемых, в частности, гипергликемией, может заключаться в гликировании ингибитора МАК и переводе его в неактивное состояние. С другой стороны, вышеописанные патологические изменения в сосудистой ткани, а также множество других метаболичес­ких и гормональных нарушений, характерных для СД2, могут, в свою очередь, активировать систему комплемента, приводя к накоплению физиологически активных продуктов протеолиза компонентов комплемента (медиаторов воспаления, триггеров апоптоза и факторов, повышающих проницаемость сосудов), способствующих дальнейшему прогрессированию осложнений СД2.